2013培訓(xùn)講稿原核表達(dá)

外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

1.外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)蛋白質(zhì)通常是研究的最終目標(biāo)，因此蛋白質(zhì)的表達(dá)在基因工程中占有非常重要的地位。常用的表達(dá)系統(tǒng)有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要使用大腸桿菌，真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要有酵母細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。這些表達(dá)系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)室條件加以選擇。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)：

生物學(xué)特性和遺傳背景清楚，易于操作；

已開發(fā)較多的克隆載體可供選擇；

容易獲得大量的外源蛋白（外源蛋白可占細(xì)菌總蛋白50％左右）。蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞中的表達(dá)形式

以非融合蛋白、融合蛋白和分泌型表達(dá)等不同形式進(jìn)行表達(dá)。融合蛋白指的是在表達(dá)產(chǎn)物的N端或C端具有非目的蛋白的氨基酸殘基。融合蛋白使用的外源基因，必須注意其讀框和載體上原核讀框相符和。融合蛋白在大腸桿菌內(nèi)較穩(wěn)定，不易被降解。

乳糖操縱子的調(diào)節(jié)機(jī)制乳糖操縱子的調(diào)節(jié)機(jī)制2）乳糖操縱子的降解物阻遏

當(dāng)細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中生長時，通常優(yōu)先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有當(dāng)葡萄糖耗盡后，細(xì)菌才能充分利用乳糖，這種現(xiàn)象稱葡萄糖效應(yīng)，其實(shí)質(zhì)是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又稱降解物阻遏（catabolicrepression）。

降解物阻遏的機(jī)理：代謝物基因激活蛋白（CatabolitegeneActivationProtein，CAP），又稱cAMP受體蛋白（cAMPReceptorProtein，CRP），屬于一種激活蛋白，對乳糖操縱子進(jìn)行正調(diào)節(jié)。CAP分子內(nèi)同時具有DNA結(jié)合區(qū)和cAMP結(jié)合區(qū)。當(dāng)CAP與cAMP結(jié)合后，就可結(jié)合到CAP結(jié)合位點(diǎn)上，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。葡萄糖降解物能抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，從而降低cAMP的濃度，抑制轉(zhuǎn)錄。3）阻遏蛋白負(fù)調(diào)節(jié)與CAP正調(diào)節(jié)的協(xié)調(diào)當(dāng)阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時，CAP對該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用；而沒有CAP存在時，即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合，操縱子仍無轉(zhuǎn)錄活性。只有在CAP存在且沒有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合時，或者說只有高乳糖低葡萄糖時，操縱子發(fā)揮最大轉(zhuǎn)錄活性。這種協(xié)調(diào)與細(xì)菌對碳源的優(yōu)先利用相一致。

誘導(dǎo)過程挑取單個菌落接種于含抗生素LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日以1:100擴(kuò)大培養(yǎng)至含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至測定OD600=0.4~0.6時，加IPTG至終濃度1mmol/L，37℃振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)4ｈ。于誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后每一小時取樣1ml后測OD600，分別取上述菌液置于EP管中，4℃，5000rpm離心5min，棄上清，按每毫升OD600=1加入PBS50μL和SDS×上樣緩沖液40μL，DTT10μL.100℃煮沸10min，進(jìn)行SDS鑒定。Ppro-HTa-VP2-VP3/BL21表達(dá)及純化重組表達(dá)蛋白的SDS鑒定1.Ppro-HTa-VP2-VP3/BL21誘導(dǎo)前3-8.分別為Ppro-HTa-VP2-VP3/BL21誘導(dǎo)后1h、2h、3h、4h、5h、6h2.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)VP2-VP3蛋白純化鑒定結(jié)果1.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)2.Ppro-HTa-VP2-VP3/BL21誘導(dǎo)前3.Ppro-HTa-VP2-VP3/BL21誘導(dǎo)后4-5.純化VP2-VP3重組蛋白包涵體形式。在菌體沉淀中。外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)時，表達(dá)產(chǎn)物往往在胞漿聚集，形成均一密度的包涵體。包涵體的形成有利于保護(hù)表達(dá)產(chǎn)物不被胞內(nèi)的蛋白酶降解，而且可以通過包涵體和胞內(nèi)其他蛋白質(zhì)密度不同來純化包涵體蛋白。但包涵體蛋白不具有該蛋白的所有生物學(xué)活性，往往需要通過變性復(fù)性的方法恢復(fù)活性，有時只能回復(fù)部分活性。

可溶形式。在菌體上清中。天然的蛋白形式。具有天然活性。大腸桿菌中的蛋白表達(dá)形式的確定蛋白的純化大腸桿菌中的蛋白表達(dá)形式的確定取誘導(dǎo)后菌50mL液置于離心管中，4℃5000rpm離心l0min，棄上清，加入5mLPBS，在冰浴下超聲破碎菌體。12000rpm離10min分別收集上清液和沉淀，沉淀加入5mLPBS重懸，分別加入等倍體積的SDS×上樣緩沖液，100℃煮沸10min，進(jìn)行SDS電泳，檢測結(jié)果。上清中有目的蛋白帶出現(xiàn)，則說明目的蛋白以可溶形式表達(dá)；沉淀中有目的蛋白帶出現(xiàn)，則說明目的蛋白以包涵體形式表達(dá)9.重組蛋白表達(dá)形式的鑒定圖9:重組蛋白表達(dá)形式的SDS的分析1.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn);2.pET-30b-PLF-NS/BL21（DE3）超聲后上清;3.pET-30b-PLF-NS/BL21（DE3）超聲后沉淀;

超聲波處理誘導(dǎo)后菌體，經(jīng)SDS分析表明，表達(dá)的重組蛋白全部存在于菌體沉淀中，說明表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。10.包涵體的提取與純化圖10:提取的包涵體SDS分析1.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn);2-3.提取的重組PLF-NS蛋白包涵體圖11:純化重組蛋白SDS分析1-4.純化的PLF-NS蛋白;5.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)VP2-VP3蛋白純化鑒定結(jié)果1.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)2.Ppro-HTa-VP2-VP3/BL21誘導(dǎo)前3.Ppro-HTa-VP2-VP3/BL21誘導(dǎo)后4-5.純化VP2-VP3重組蛋白可溶蛋白過柱純化目的基因在重組干酪乳桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)挑取陽性重組菌菌落，接種于含10μg/mL氯霉素的MRS液體培養(yǎng)基中（5mLMRS+5μLCm），37℃厭氧培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)菌液按1：20比例接種于氯霉素的含1％木糖MRS培養(yǎng)基（不含葡萄糖）中，37℃誘導(dǎo)15h。用經(jīng)誘導(dǎo)的pPG-1/L.casei393和pPG-2/L.casei393干酪乳桿菌作為對照，用做表達(dá)分析。樣品的處理：取誘導(dǎo)后菌液1mL，12000r/min離心5min，菌體沉淀用ddH2O洗滌2次，12000r/min離心5min