動保中心雞血凝血抑實(shí)驗(yàn)

動保中心雞血凝血抑實(shí)驗(yàn)第一頁，共二十四頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容：一、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)材料五、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果判定六、舉例說明七、注意事項(xiàng)第二頁，共二十四頁，2022年，8月28日化驗(yàn)室是生產(chǎn)技術(shù)部一部分，和生產(chǎn)密切相關(guān)。

我們主要負(fù)責(zé)各養(yǎng)殖場場雞群的抗體檢測工作。主要抗體檢測：血凝抑制試驗(yàn)抗體是雞群接觸抗原（包括疫苗和有害病原微生物）體內(nèi)產(chǎn)生的特異性蛋白質(zhì)。他能很好反映機(jī)體的感染或抵抗?fàn)顩r第三頁，共二十四頁，2022年，8月28日1、血凝試驗(yàn)（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能選擇性地使某種動物地紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱為血凝（HA）,也稱直接血凝反應(yīng)。病毒顆粒紅細(xì)胞第四頁，共二十四頁，2022年，8月28日2、血凝抑制試驗(yàn)（HI）原理：當(dāng)病毒的懸液中加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆粒或其血凝素時，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆?；蜓刂苯咏佑|。這時紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為紅細(xì)胞凝集抑制（HI）反應(yīng)，也稱血凝抑制反應(yīng)。抗體抗原第五頁，共二十四頁，2022年，8月28日

3、抗原：凡能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并能與抗體結(jié)合而發(fā)生特異反應(yīng)的物質(zhì)稱為抗原。4、抗體：是機(jī)體受到抗原物質(zhì)刺激產(chǎn)生的具有特異性的免疫球蛋白，它能與相應(yīng)的抗原結(jié)合，發(fā)生特異性反應(yīng)，并具有一定的消除病原微生物及其產(chǎn)物的物質(zhì)。適用范圍：適用于對雞新城疫(ND)，禽流感(H9、H5-4、H5-5)抗體滴度的檢測。第六頁，共二十四頁，2022年，8月28日材料準(zhǔn)備離心機(jī)（離心紅細(xì)胞和離心血清）冰箱（存放抗原和血清）振蕩器（振蕩96孔V型板）抗原：新城疫（ND）、流感（H9、H5-4、H5-5）抗原（從指定廠家買穩(wěn)定的濃縮抗原）1%紅細(xì)胞懸液、PBS液（做血清稀釋液用、配制4單位抗原）離心管和離心盒（保存血清）96孔V型板(稀釋血清)

單道、八道移液器、十二道移液器和槍頭（加樣、稀釋血清）積液巢（盛PBS液及配制4單位抗原）第七頁，共二十四頁，2022年，8月28日附錄1PBS液配制準(zhǔn)確稱取NaCl24g、Na2HPO48.7g、KCl0.6g、KH2PO40.6g，加蒸餾水至3000mL，加熱溶解后調(diào)pH值至7.2，121℃高壓滅菌15min，4℃保存?zhèn)溆?。附?1%雞紅細(xì)胞懸液制備采集至少3只SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積PBS液混合，將混合液10ml裝入帶刻度離心管，配平后放入離心機(jī)中，經(jīng)2000r/min，離心4min。用吸管吸去上清液與白細(xì)胞、棄去，將沉淀的紅細(xì)胞加生理鹽水洗滌，如此反復(fù)離心三次，第四次離心時2500r/min，離心5min，將最后一次離心后的紅細(xì)胞泥，按1%的稀釋度加入PBS液中稀釋，4℃保存?zhèn)溆谩５诎隧?，共二十四頁?022年，8月28日血凝（HA）試驗(yàn)采用96孔V型反應(yīng)板，測定抗原效價1、首先用微量移液器向反應(yīng)板的每孔加PBS液30微升。2、用微量移液器吸取待測抗原30微升于第一孔中并擠壓6-7次混合，之后吸出30微升至第2孔，依次倍比稀釋到第11孔、棄去30微升。12孔為紅細(xì)胞對照孔。每種抗原4個平行對照。3、用微量移液器再向反應(yīng)板的每孔加PBS液30微升。4、微量移液器再吸取1%紅細(xì)胞懸液依次加入各孔，每孔30微升。5、置于微量振蕩器上振蕩10--30秒。6、室溫靜置40分鐘后觀察結(jié)果。第九頁，共二十四頁，2022年，8月28日1234567891011122×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×紅細(xì)胞對照PBS液303030303030303030303030抗原3030303030303030303030棄去30紅細(xì)胞303030303030303030303030結(jié)果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－操作示意圖第十頁，共二十四頁，2022年，8月28日結(jié)果觀察：

將反應(yīng)板傾斜成45度角，沉于孔底的紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉淀，表明紅細(xì)胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細(xì)胞平鋪孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動，說明紅細(xì)胞被病毒所凝集。能使雞紅細(xì)胞完全凝集的抗原的最高稀釋倍數(shù)，稱為該抗原滴度紅細(xì)胞凝集效價。即沉淀的前一孔即為該抗原的效價。如彩1所示第8孔紅細(xì)胞為完全凝集，說明該抗原效價為1：256。

血凝實(shí)驗(yàn)主要是測定病毒的紅細(xì)胞凝集價，以確定紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)驗(yàn)所用病毒的稀釋倍數(shù)（抗原單位）第十一頁，共二十四頁，2022年，8月28日第十二頁，共二十四頁，2022年，8月28日4單位抗原校正1、根據(jù)抗原效價結(jié)果配制相應(yīng)比例的抗原稀釋液：即4單位抗原。例：上圖1抗原效價為1：256，HI試驗(yàn)時，30微升抗原稀釋液內(nèi)須含4個凝集單位，則應(yīng)將抗原作256/4=64倍稀釋。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升PBS液。2、首先用微量移液器向反應(yīng)板的第1孔至第5孔加生理鹽水30微升。3、用微量移液器吸取4單位抗原30微升分別加入第1孔中，從第1孔開始擠壓6-7次混合，后吸出30微升至第2孔，依次倍比稀釋到第5孔，棄去30微升。4、用微量移液器再吸取1%紅細(xì)胞懸液依次加入1-5孔，每孔30微升。5、于微量振蕩器上振蕩10~30秒。6、室溫靜置40分鐘后觀察結(jié)果。7、結(jié)果觀察：第1、2孔為完全凝集，第3孔紅細(xì)胞為50%沉淀，第4孔為對照完全沉淀，如果出現(xiàn)以上結(jié)果，表明所配4單位抗原準(zhǔn)確，校正成立。如圖2所示。第十三頁，共二十四頁，2022年，8月28日第十四頁，共二十四頁，2022年，8月28日血凝抑制（HI）試驗(yàn)每排每孔檢測1份血清。步驟如下：1.用微量移液器先加30微升PBS液于各孔中。2.用微量移液器吸取待檢血清30微升置于第1孔中，然后倍比稀釋至第11孔，棄去30微升。最后一孔不稀釋，為紅細(xì)胞對照。3.用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔30微升（1-12）。4.置于微量振蕩器上振蕩10-30秒，混合均勻。5.室溫靜置30分鐘。6.用微量移液器吸取1%紅細(xì)胞懸液于每孔各加30微升。7.置于微量振蕩器上振蕩10-30秒，混合均勻。8.室溫靜置40分鐘后觀察結(jié)果。第十五頁，共二十四頁，2022年，8月28日結(jié)果判定：1）判定結(jié)果：以完全抑制紅細(xì)胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴度，以2的指數(shù)表示。見圖3：圖3上圖抗體結(jié)果從上至下依次為：8/7/8/9/8/7/7/6第十六頁，共二十四頁，2022年，8月28日2）判定標(biāo)準(zhǔn)：1.ND抗體：育雛育成雞在6以上，產(chǎn)蛋雞在8以上。2.H5體：抗體值在6以上。3.H9抗抗體：抗體值在7以上。能將4單位病毒物質(zhì)凝集紅細(xì)胞的作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的紅細(xì)胞凝集抑制效價注：在實(shí)際生產(chǎn)中，則以實(shí)際免疫程序進(jìn)行分析抗體滴度值的高低。第十七頁，共二十四頁，2022年，8月28日

免疫后抗體規(guī)律

一般活疫苗免后7-10天產(chǎn)生抗體，2-3周抗體到達(dá)峰值，可以維持1-2個月。滅活疫苗免后10-15天產(chǎn)生抗體，3-4周抗體到達(dá)峰值，可以維持3-4個月

對H5抗體要求6—11，低于5時及時免疫

H9抗體在7--11，當(dāng)最低抗體為6時及時免疫H9單苗

ND抗體在7--12產(chǎn)蛋雞最低值7補(bǔ)苗

第十八頁，共二十四頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)后處理：96孔V型反應(yīng)板的清洗：

自來水沖洗、甩干泡酸自來水沖洗、甩干純凈水沖洗甩干兩次60℃烤干抗原空瓶：高壓滅菌回收利用或棄去讀取抗體值：

記錄匯總存檔第十九頁，共二十四頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)室抗體檢測對實(shí)際生產(chǎn)的重要性母源抗體能反映一個雞場的種源種雞的健康程度，如果種源出現(xiàn)問題，這批雞肯定不好養(yǎng)。母源抗體加上2-3個滴度就是種雞群的抗體結(jié)果：所以母源抗體個體值ND、H9達(dá)到2log12，H5達(dá)到2log10是不正常的。從母源抗體推測出，種雞抗體肯定有2log14個體，說明種雞感染H9第二十頁，共二十四頁，2022年，8月28日種雞群發(fā)生過新城疫，雛雞抗體表現(xiàn)有12的。第二十一頁，共二十四頁，2022