分子生物 第3章 DNA體外重組 第7、8章 外源基因在原核、真核細胞中的表達(林小聰)

DNA體外重組第三章DNArecombinationinvitro*1授課：廣東醫(yī)科大學林小聰*2即基因克隆：它涉及到特定DNA片段的獲取、載體的選擇及準備、DNA片段與載體重組、重組DNA的轉化、重組DNA的克隆化及鑒定等操作。是操作基因的最基本技術，也是分子生物學的核心技術；是通過體外連接重組、體內(nèi)克隆擴增，將2個或2個以上的DNA分子組成1個新的DNA分子的過程。第三章DNA體外重組第一節(jié)

基本流程和必備工具*3一、基本流程二、常用工具酶三、基因載體分－－(1)獲取目的基因并進行必要的改造切－－(2)選擇載體并用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割接－－(3)將目的基因與載體連接成重組DNA

轉－－(4)將重組DNA導入宿主細胞篩－－(5)含重組DNA宿主細胞的克隆化及鑒定一、DNA體外重組的基本流程*4思考題1重組DNA技術的基本過程（1）*5重組DNA技術的基本過程（2）*6

(一)限制性核酸內(nèi)切酶

是一類能識別雙鏈DNA中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶，又稱為內(nèi)切酶或限制酶（restrictionenzyme）。主要是從原核生物中分離純化而來。在原核生物中與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。*7二、常用工具酶（restricton

Endonuclease）第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫斜體；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫斜體；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。限制酶的命名：HindⅢ

屬種

株序Haemophilus

influenzae

d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶*8Ⅰ和Ⅲ型限制酶通常是相對分子量較大的多亞基蛋白質(zhì)復合物，同時具有內(nèi)切酶和甲基化酶活性，反應過程中需有Mg2+和ATP參與。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型（基因工程技術中常用Ⅱ型）。限制酶的分類：Ⅱ型限制酶通常以同源二聚體形式存在，只具有核酸內(nèi)切酶活性而無甲基化酶活性，反應過程中只需有Mg2+參與而不需有ATP參與。*9Ⅱ類酶識別序具有回文結構(palindrome)特點，

即具有雙重旋轉對稱結構的兩條DNA鏈的堿基序列的反向重復。１.識別位點：大部分Ⅱ型限制酶都能識別由4~8個核苷酸組成的特定序列。*10*11BamHⅠGGATCCCCTAGGGTCCAGGACCTG+平端切口GCCTAGGATCCG+粘端切口HindⅡGTCGACCAGCTG平或鈍末端（bluntend)粘性末端（stickyend)切口：平端切口、粘端切口*12*13*14

2.酶切效率限制性內(nèi)切酶的活性單位定義為：影響酶切效率的因素：*151小時內(nèi)完全酶解1μgλ噬菌體DNA中所有相同酶切點所需要的酶量。（1）緩沖液：商品化的內(nèi)切酶均提供高鹽、中鹽和低鹽緩沖液；進行雙酶切時要遵循先低鹽反應后高鹽反應的原則。影響酶切效率的因素：（2）酶切位點的側翼序列：大多數(shù)限制性內(nèi)切酶對只含有識別序列的寡核苷酸沒有催化活性，需在兩側各延長一個或幾個核苷酸才能被有效酶切。盡量不要選擇兩個位點相鄰的內(nèi)切酶，以避免側翼序列縮短或丟失影響酶切效率。（3）酶切位點的化學修飾：酶切位點的甲基化修飾可導致酶切失敗?？蓪①|(zhì)粒重新轉化另一種菌株，再提取質(zhì)粒進行酶切。影響酶切效率的因素：（4）甘油含量：商品化的限制性內(nèi)切酶保存在50%的甘油溶液中。酶切反應體系中酶的體積應控制在10%以內(nèi)（即甘油含量在5%以內(nèi)），以防止甘油抑制酶活性。（5）反應時間：酶切反應時間可根據(jù)說明書確定。若需延長反應時間，應適當減少酶的用量，以避免產(chǎn)生星號活性（內(nèi)切酶在非標準條件下也能切割一些與其特異識別序列類似的序列）。影響酶切效率的因素：（6）加樣順序：配制酶切反應體系時酶要最后加。（7）酶的稀釋：商品化的內(nèi)切酶都是濃度很高的濃縮酶，使用時可用酶切緩沖液進行稀釋，但不能用水進行稀釋，否則可導致酶失活。限制性內(nèi)切酶酶切中常見的問題和原因能使在DNA雙鏈上相鄰的5-磷酸基和3-羥基之間形成3,5-磷酸二酯鍵從而封閉DNA鏈上的缺口或連接2個DNA片段。

(二)DNA連接酶(DNAligase)*20(2)T4DNA連接酶在ATP和Mg2+存在條件下，可使DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA片段間的，2個互補黏性末端或平末端連接。(1)大腸埃希菌DNA連接酶

只能連接具有互補黏性末端的兩個雙鏈DNA分子。連接黏性末端作用模式圖：*******GAATTC*****************CTTAAG**********5′3′5′3′EcoR

IDNA連接酶*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********G*********5′3′3′5′—P

OH—+*21連接平末端作用模式圖：*************AGCT***************************TCGA**************5′3′5′3′Alu

IT4DNA連接酶—OH—P5′3′3′5′************TC************AG5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************+*22

(三)DNA聚合酶能催化以DNA或RNA為模板合成DNA的反應，把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地添加到雙鏈DNA分子的或引物鏈的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。1.大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ2.Klenow片段具有53聚合酶，

35及53核酸外切酶活性。具有53聚合酶，

35核酸外切酶活性。*233.TaqDNA聚合酶4.反轉錄酶：依賴RNA的DNA聚合酶。具有53聚合酶，53核酸外切酶活性，對Mg2+濃度非常敏感。是第一個被發(fā)現(xiàn)的、耐熱的、依賴DNA的DNA聚合酶，

最佳反應溫度為70~75℃。

普遍使用的是來源于AMV(鳥類成髓細胞白血病病毒)及M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒)的反轉錄酶，具有53聚合酶。*241.末端脫氧核苷酸轉移酶（terminaldeoxynucleotidyl

transferase）

(四)

其它修飾酶是一種無需模板的DNA聚合酶，催化脫氧核糖核苷酸轉移到單鏈或雙鏈DNA分子的3-OH末端上。(1)底物是單鏈DNA或有3突出末端的雙鏈DNA。5′3′OHMg2+dNTPnppi5′3′(A/G/C/T)n*25(2)底物是3’平端或3’凹端的雙鏈DNA。Co2+dNTPnppi5′3′OH5′3′(A/G/C/T)nCo2+dNTPnppi5′3′OH5′3′(A/G/C/T)n用途：

（1）主要作用是在載體或目的基因3末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重組。（2）使DNA3末端帶上標記物。*26

2.堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）能特異地切除DNA、RNA和dNTP上5’-磷酸基團。

3.多核苷酸激酶（polynuleotide

kinase）又稱T4多核苷酸激酶，能催化ATP的γ-磷酸基團轉移到DNA或RNA片段的5’-OH末端。*27載體（vector）的概念是指能攜帶目的DNA片段進入宿主細胞，在細胞內(nèi)自主自制或表達的DNA分子。*28三、基因載體(1)質(zhì)粒載體：最常用的目的基因克隆載體；粘粒載體：用于克隆大片段DNAM13噬菌體載體：用于Sanger雙脫氧DNA測序(2)噬菌體載體：構建基因組DNA或cDNA文庫(3)病毒載體：包括人或哺乳動物病毒、昆蟲及植物病毒，用于在真核細胞中表達目的蛋白(4)人工染色體載體：用于更大DNA片段的克隆

(一)質(zhì)粒(plasmid)載體細菌培養(yǎng)

質(zhì)粒是存在于細菌染色質(zhì)以外，具有自我復制能力的雙鏈環(huán)狀DNA。小的約2~3kb,大的數(shù)百kb。大腸桿菌染色質(zhì)質(zhì)粒質(zhì)粒擴增并表達蛋白質(zhì)嚴謹型質(zhì)粒:復制受到嚴格控制,1個細胞周期復制1-2次松弛型質(zhì)粒:復制控制較寬松,1個細胞周期復制10-200次*30１.克隆用質(zhì)粒載體含有復制起始點OriC、多個可供插入DNA片段的酶切位點MCS和篩選標志（藥物抗性基因或代謝酶編碼基因）。

主要功能是攜帶目的DNA片段進入宿主細胞并在細胞內(nèi)自主復制擴增，可經(jīng)過克隆篩選獲得克隆化的重組DNA。分子質(zhì)量相對較小，以容納較大的外源DNA；拷貝數(shù)較多，易于與受體細胞的染色體DNA分開；具有較高的遺傳穩(wěn)定性。amprORItetr

(1)質(zhì)粒pBR322：最早商業(yè)化的克隆載體ORI：ampr,

tetr：兩個抗性基因，用于篩選陽性克隆。PstI,BamHI：兩個酶切位點，用于插入目的基因分子量較小拷貝數(shù)較高復制起始點，保證高拷貝自我復制。*31陽性克隆*32含Amp培養(yǎng)板含Tet培養(yǎng)板BamH

I酶切插入目的基因，

Tetr失效：

(2)質(zhì)粒pUC18/19:pBR322衍生的克隆載體OripUC192686bpAmprP(BLA)PlacAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)MCS多個酶切位點用于克隆操作LacZ’藍白斑篩選陽性克隆分子量更小拷貝數(shù)更高*33

pUC質(zhì)粒載體插入了β半乳糖苷酶N端α肽片段的編碼基因lacZ’；表達的產(chǎn)物α肽也無酶活性，也不能分解培養(yǎng)基中的X-gal。藍白斑篩選

DH5a宿主菌染色體插入了β半乳糖苷酶的C端ω肽片段的編碼基因lac’△M15；能表達ω肽但無酶活性；不能分解培養(yǎng)基中的X-gal。有活性的β半乳糖苷酶由α肽和ω肽互補(α互補)而成，可使培養(yǎng)基中的X-gal分解形成藍色化合物而出現(xiàn)藍色菌落。*34α*35X-gal藍色化合物-半乳糖苷酶（α+ω）白色藍白斑篩選：ωDH5a宿主菌藍色菌落：陰性克隆;

白色菌落：陽性克隆*36藍白斑篩選

(3)

TA克隆載體

許多耐熱的DNA聚合酶(如Taq、Tth等)擴增時，都在PCR產(chǎn)物3’-末端加上了A堿基。是專為克隆PCR產(chǎn)物而設計的，在其MCS兩側的3′-末端攜帶有未配對的T堿基。3′3′5′PCR產(chǎn)物AA5′Taq酶T載體TT5′5′3′3′*37在連接酶的作用下可直接將PCR產(chǎn)物克隆到TA載體中是在克隆載體的基礎上，在多克隆位點的上下游加上特殊啟動子序列，從而使其既可作為克隆載體又可在體外將插入的DNA片段轉錄成mRNA的雙重功能載體。如pGEM-3Z/4Z。*382.克隆-體外轉錄質(zhì)粒載體由pUC系列質(zhì)粒載體派生而來，在MCS兩側分別加上了噬菌體T7啟動子和SP6的強啟動子序列，為RNA聚合酶的附著提供了特異性識別位點。*39PT7Psp6是在克隆載體的基礎上，加上可使插入基因在宿主細胞中表達所需的必要元件，如啟動子、終止子、核糖體識別位點、起始密碼和終止密碼等。*403.表達用質(zhì)粒載體(1)原核表達質(zhì)粒載體在原核克隆質(zhì)粒載體MCS的上下游分別加上啟動子和終止子，與插入基因組成轉錄單位；加入RBS、起始和終止密碼，與插入基因組成翻譯模板。

pET28a在起始密碼的上游還加入了操縱基因（阻遏蛋白的結合位點），在閱讀框中還加入了6個組氨酸標簽(histag)的編碼序列。*41DNA聚合酶RNA聚合酶多聚組氨酸標簽(His-tag)：由6個組氨酸殘基組成，位于目的蛋白的C末端或N末端，以融合表達方式與目的蛋白一起表達。分子量小，對目的蛋白的生物學特性及其功能沒有影響，可通過固定化金屬離子親和層析對帶有His-tag的目的蛋白進行分離、純化。*42(1)真核表達質(zhì)粒載體－－穿梭載體

一般由兩部分組成，一部分用于在原核細胞中復制及篩選，另一部分用于在真核細胞中復制、篩選及表達。如pRc/CMV：前一部分來源于pUC質(zhì)粒，包括復制起始點OriC和ampr基因，用于在原核細胞中復制及篩選；另一部分來源于病毒，包括PCMV（巨細胞病毒啟動子）、新霉素抗性基因(neo)及polyA加尾信號序列，用于在真核細胞中復制、篩選及表達。*43

(二)病毒載體(viralvector)

是通過改造病毒基因組DNA，使其具備攜帶目的基因并能在宿主細胞中包裝成病毒顆粒的DNA分子。*44常用的RNA病毒載體（整合型）：逆轉錄病毒(retrovirus,RV)慢病毒(lentivirus):也屬于RV家族常用的DNA病毒載體（游離型）：腺病毒(adenovirus,Ad)腺相關病毒(adeno-associatedvirus,AAV)桿狀病毒(baculovirus)原核病毒（噬菌體）載體：*45

2.慢病毒載體

是將人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)基因組改造而獲得的載體，可將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久表達外源基因的目的。ψgagpropol

envU5RU3U5RU3LTR-3’5’-LTRU3=增強子，R=啟動子，U5=轉錄起始位點；Ψ=病毒包裝信號；gag=編碼核心抗原，pro=切割蛋白前體所需蛋白酶，pol=病毒復制所需的聚合酶，env=胞膜蛋白。

(1)pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒表達質(zhì)粒LTR=長末端重復序列;PBS=引物結合位點;Ψ=病毒包裝信號;RRE=反式激活因子Rev蛋白的應答元件;cPPT/CTS=Poly(A)n加尾信號,輔助病毒包裝;IRES=核糖體結合位點;PCMVIE=人類巨細胞病毒啟動子; ZsGreen1=綠色熒光蛋白的基因;WPRE=轉錄后調(diào)解元件

(2)病毒包裝輔助質(zhì)粒pHelper1.0CMV=人類巨細胞病毒啟動子;gag=編碼核心抗原;pro=切割蛋白前體所需蛋白酶;pol=病毒復制所需的聚合酶;RRE=反式激活因子Rev蛋白的基因;EEnv=胞膜蛋白。

(3)病毒包裝輔助質(zhì)粒pHelper2.0CMV=人類巨細胞病毒啟動子;VSVG=單純皰疹病毒來源的VSV-G基因，提供病毒包裝所

需要的包膜蛋白。

(三)人工染色體載體

酵母人工染色體載體，簡稱YAC載體，由酵母染色體、酵母2μmDNA質(zhì)粒的復制起始序列等元件衍生而成；可插入100kb～2,000kb外源DNA片段，是人類基因組計劃中物理圖譜繪制采用的主要載體。

細菌人工染色體載體，簡稱BAC載體，以細菌F因子為基礎構建而成；可插入100kb～300kb外源DNA片段，是人類基因組計劃中序列分析采用的主要載體。*49第二節(jié)

DNA重組前的準備工作*50一、選擇載體二、載體的準備三、目的DNA的設計*51一、載體的選擇

(一)選擇載體的基本原則1.目的DNA的大?。?2.明確重組的目的；①表達融合蛋白，載體需要攜帶一段融合肽序列3.適合的克隆位點； 4.載體的穩(wěn)定性。1.載體結構；

(二)選擇載體時需要考慮的因素②載體是否攜帶基因表達用的起始和終止密碼子專用載體：如T載體專用于PCR產(chǎn)物的克隆表達載體：2.載體上可操作的酶切位點3.載體在宿主細胞中的行為方式③插入目的基因后，載體提供的閱讀框是否與目的基因的閱讀框一致，是否需要進行適當調(diào)整④對載體進行酶切處理不能影響一些重要的原件，如保證核糖體結合的SD序列表達載體：除了MCS可插入目的基因外，載體上其它的酶切位點也可以使用。如利用啟動子兩端的酶切位點可更換載體的啟動子明確載體屬于獨立復制型還是整合型載體*53二、載體的準備1.質(zhì)粒載體的線性化(1)單酶切：用一種限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒載體，使環(huán)狀質(zhì)粒變成線狀質(zhì)粒。(2)雙酶切：用兩種合適的限制性內(nèi)切酶同時或分別切割質(zhì)粒載體，在去掉載體上一段序列的同時使環(huán)狀質(zhì)粒變成線狀質(zhì)粒。避免使用同尾酶！*542.線性載體的純化最簡單的方法是用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA,然后將線性載體DNA條帶從凝膠上切割下來，再從凝膠中回收載體DNA。從凝膠中回收載體DNA

(1)用DNA回收試劑盒回收

(2)擠膠法回收DNA：將切出的含DNA條帶的凝膠條用封口膜包好，-70oC短時間冷凍，取出溶化后用拇指及食指擠壓凝膠條，收集擠壓出的液體即可。*55三、目的DNA的結構設計1.根據(jù)載體設計目的DNA片段的結構

(1)目的DNA片段兩端的酶切位點通常是根據(jù)載體的酶切位點進行設計的，可采用目的DNA內(nèi)部的酶切位點，也可額外加上酶切位點。

(2)選用T載體時對目的DNA片段的考慮：線性T載體3’-端為不配對的T；Taq酶可在PCR產(chǎn)物末端加A,高保真酶不能在PCR產(chǎn)物末端加A。*562.根據(jù)研究目的設計DNA片段的結構

(1)擴增目的DNA片段時引物的選擇：以檢測特異DNA序列存在與否為目的，可隨意根據(jù)DNA序列設計引物；以獲得表達產(chǎn)物為目的，則需要根據(jù)編碼序列（通常選擇cDNA序列全長）設計引物。

(2)串聯(lián)目的DNA片段時酶切位點的選擇：在DNA單體片段的末端設計同尾酶(如BamHⅠ和BglⅡ)。

(3)選用表達載體時DNA片段酶切位點的設計：目的DNA的起始密碼與載體上SD序列等重要元件的距離要適當。如酶切位點遠離SD序列，可在目的DNA片段上設計一段與起始密碼距離適當?shù)腟D序列。第一節(jié)基本流程和必備工具*57一、基本流程：分、切、接、轉、篩二、常用工具酶：限制性內(nèi)切酶、連接酶、DNA聚合酶三、基因載體：質(zhì)粒載體、病毒載體、人工染色體載體克隆載體、克隆-轉錄載體、表達載體第二節(jié)DNA重組前的準備工作一、選擇載體：基本原則、考慮因素二、載體的準備：線性化、分離純化三、目的DNA的設計：根據(jù)載體、根據(jù)研究目的第三節(jié)

目的DNA片段的獲取及準備*58一、獲取DNA片段的方法二、DNA片段的末端處理目前多采用PCR法或化學合成-PCR搭接法合成目的基因片段。*59一、獲取DNA片段的方法選擇

(一)獲取DNA片段的主要方法1.酶切法直接分離目的DNA片段2.PCR和RT-PCR技術體外擴增合成目的DNA片段從載體上切割目的DNA片段(1)根據(jù)一段已知序列設計引物，以基因組DNA或mRNA為模板，合成全長目的DNA片段。(2)在PCR引物上，可直接加上合適的酶切位點或其它重要元件，或通過錯配改變堿基序列。思考題2反轉錄AAnATTnT5′5′mRNA反轉錄酶mRNAcDNA3′TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1雙鏈cDNA3′5′3′5′5′加熱變性加入特異性引物DNA聚合酶重復上述步驟擴增出大量的產(chǎn)物聚合酶鏈式反應退火延伸PCR或RT－PCRgDNA文庫：g-文庫cDNA文庫：c-文庫方法：

用目的基因上的一段DNA做成探針與文庫中的DNA作核酸雜交，從基因文庫中“釣出”有目的基因的克隆。*613.篩選文庫獲得目的DNA片段Screeningagenomiclibrarybycolonyhybridization.化學合成：德國K&A公司的DNA合成儀,可合長200bp。②從氨基酸序列推測的DNA序列：*63直接用氨基酸序列從GenBank等網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫搜索4.化學合成-PCR搭接法獲取目的DNA片段①長度約200bp的已知核苷酸序列的合成；避免使用稀缺密碼子，顧及宿主細胞的密碼偏好*64*65

(二)根據(jù)目的和條件選擇獲取DNA片段的方法

根據(jù)實驗條件選擇合適的方法用于獲取目的DNA片段。(1)直接從重組載體上將目的DNA片段酶下來或擴增出來。(2)計算機克隆法：首先將擬克隆的DNA序列在種屬間進行同源性或相似性比較，找出目的DNA的保守序列設計引物，從特定細胞或組織分離DNA或mRNA作為模板合成目的DNA。*66二、DNA片段的末端處理1.PCR產(chǎn)物的末端及修飾2.DNA片段末端加尾修飾

5’-末端可做多種修飾；Taq酶可在PCR產(chǎn)物的3’-末端加A(高保真酶無此功能)。(1)用末端轉移酶在雙鏈DNA的3’-端加上單鏈多聚核苷酸。(2)用DNA連接酶在DNA末端加上一段稱為“接頭(adaptor)”序列。第四節(jié)

DNA片段與載體的重組*67一、DNA片段與載體連接的方式二、連接反應時需要考慮的一些因素BamHⅠ切割反應GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶，15oC+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體目的基因自連載體自連

(一)黏性末端連接1.單酶切的黏性末端連接一、DNA片段與載體連接的方式EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶，15oC重組體2.雙酶切的黏性末端連接*69目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶，15oC重組體載體自連目的基因自連

(二)平頭末端連接

*705′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA

T(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體3′A(A)nA

A(A)nA3′5′5′

(1)同聚物加尾連接法*71EcoRⅠCCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠ由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。

(2)接頭連接法*72PCR擴增+3′3′5′PCR產(chǎn)物AA5′T載體TT5′5′3′3′連接轉化藍白篩選Taq酶2.PCR產(chǎn)物的黏性末端T-A連接*73

(三)PCR產(chǎn)物的連接

1.PCR產(chǎn)物的平頭末端連接1.連接反應的溫度和時間

一般采用T4DNA連接酶連接的反應溫度設定在14-16oC，反應時間為4-16小時。二、連接反應時需要考慮的一些因素2.連接反應的緩沖液3.連接酶的濃度4.DNA的濃度--目的DNA與載體DNA的比值

一般用50mmol/LTris-HCl緩沖液，pH7.4~7.8,10mmol/LMgCl2,10mmol/LDTT,1mmol/LATP,20~50μg/mlBSA。黏性末端連接：3~5

:1平頭末端連接：10:1

平末端連接所用酶量是黏性末端連接的10-100倍，進行黏性末端連接時，連接酶一般需要用酶緩沖液進行稀釋。第五節(jié)

重組DNA的克隆化及鑒定*75一、重組DNA轉化大腸埃希菌二、重組DNA的克隆篩選及鑒定1.轉化(transformation)

將質(zhì)粒DNA或以質(zhì)粒載體構建的重組DNA導入原核細胞細菌(大腸埃希菌)的過程。2.轉染(transfection)

將噬菌體、病毒或以它們?yōu)檩d體構建的重組DNA分子導入真核細胞的過程。3.感染(infection)以噬菌體或病毒載體構建的重組DNA，經(jīng)體外包裝成具有感染性的噬菌體或病毒顆粒后，通過感染宿主細胞而將重組DNA注入到宿主細胞的過程。*76三個基本概念：

(一)大腸埃希菌作為宿主細胞①基因型：野生型：基因符號右上標記+，如his+突變型：基因符號右上標記-，如his-②表型：“+”代表有，“-”代表缺失；④缺失的基因：“Δ”，融合的基因：“Φ”一般經(jīng)過一定的改造使其具有適合重組DNA擴增或表達的特性；具有其特定的基因型和表型。*77一、重組DNA轉化大腸埃希菌1.大腸埃希菌的特性標識③特殊標記，如氨芐西林抗性標記：ampr、

Ampr*782.大腸埃希菌作為宿主細胞的基本條件①限制性缺陷、重組整合缺陷、感染寄生缺陷；②具有較高的轉化效率；③具有與載體選擇性標記互補的表型。3.常用大腸埃希菌的基本特性①遺傳背景清楚；②載體-受體系統(tǒng)比較完備；③細胞生長周期短，倍增時間約為20分鐘；④重組DNA穩(wěn)定。4.大腸埃希菌的選擇選擇依據(jù)：載體上的一些重要結構元件，包括復制起始位點、抗性基因等。*79

(二)重組DNA的轉化1.制備感受態(tài)大腸埃希菌感受態(tài)細胞：是指用物理化學方法處理而產(chǎn)生的易于接納外源DNA的細胞。使大腸埃希菌轉變?yōu)楦惺軕B(tài)細胞的最常用方法是CaCl2法。*802.轉化重組DNA應注意的關鍵環(huán)節(jié)：

①在冰上融化感受態(tài)細胞，減少機械損傷；

②加入細胞膜保護劑，如DMSO或β-巰基乙醇。影響轉化效率主要因素：

①感受態(tài)細胞的狀態(tài)②轉化初始低溫操作③重組DNA結構及濃度

(一)重組DNA的克隆篩選一般是通過單克隆宿主細胞的表型特征進行篩選。*81二、重組DNA的克隆篩選及鑒定1.抗性篩選；2.藍白篩選；3.菌落PCR篩選4.原位雜交篩選

是從基因文庫中挑選含有目的基因的陽性克隆的常用方法。

根據(jù)MCS兩側保守序列設計跨越MCS的通用引物，直接挑取單菌落作為PCR模板進行擴增,然后瓊脂糖凝膠電泳分析。

(二)重組質(zhì)粒的提取鑒定*821.質(zhì)粒的提取*832.重組質(zhì)粒的鑒定

主要是對插入的DNA片段分子量及序列進行鑒定。酶切DNA片段后電泳分離是最常用的方法。

(1)酶切電泳：

采用重組DNA片段兩端的酶切位點切割質(zhì)粒后電泳。

(2)DNA序列分析：重組質(zhì)粒鑒定的“金標準”。DNA體外重組的主要技術操作載體質(zhì)粒噬菌體-病毒人工染色體目的基因（外源基因）酶切法

文庫擴增化學合成-PCR搭接體外擴增限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉化帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳原位雜交*84菌落PCR

外源基因表達涉及目的基因的克隆、復制、轉錄、翻譯、蛋白質(zhì)產(chǎn)物的加工及分離純化等過程，需要在適合的表達系統(tǒng)中完成。*85第七章外源基因在原核細胞中的表達1973年，美國科學家CohenS建立了體外DNA重組技術，并在細菌中成功表達了外源基因。

表達體系(expressionsystem)由表達載體(vector)和表達宿主(host)兩部分組成。根據(jù)受體細胞的不同分為原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)。

*86

表達體系的建立包括表達載體的構建、受體細胞的建立和表達產(chǎn)物的分離、純化等技術和策略。*87第一節(jié)常用表達系統(tǒng)及其選擇*88一、大腸埃希菌表達系統(tǒng)

(一)大腸埃希菌表達載體的構成1.復制子

是一段包含復制起始位點、反式因子作用區(qū)在內(nèi)的DNA片段。2.篩選標記

大多采用抗生素抗性基因作為顯性篩選標記。ampr、tetr、chlr、neor和kanr等。3.啟動子與終止子啟動子是一段包含DDRP識別位點和mRNA轉錄起點的DNA序列(20~300bp)；終止子使轉錄終止。*894.核糖體結合位點

是緊靠啟動子下游的、從轉錄起始點開始延伸幾十個bp的一段DNA序列，翻譯起始密碼ATG通常位于它的中心位置。核糖體結合位點中與核糖體16S亞基rRNA3′-端互補的核心部分稱為SD序列，位于起始密碼上游5~13bp處；與核糖體16S亞基rpS-1蛋白質(zhì)結合的rpS-1識別序列緊密相鄰。*90信號肽序列常用pET系列核糖體結合位信號肽序列*91

(二)大腸埃希菌表達載體及其表達方式1.非融合表達載體2.融合表達載體3.分泌表達載體：加入了信號肽編碼序列。4.表面展示表達載體5.帶分子伴侶的表達載體：促進蛋白質(zhì)正確折疊。

僅表達目的基因編碼的蛋白質(zhì)或多肽。表達融合基因(目的基因+附加基因)編碼的蛋白質(zhì)或多肽。噬菌體表面展示技術、細菌表面表達技術思考題3*92二、芽孢桿菌表達系統(tǒng)常用宿主細胞為枯草桿菌(Bacillussubtilis)；載體有自主復制質(zhì)粒、整合質(zhì)粒和噬菌體。(一)優(yōu)點

細胞壁內(nèi)不含內(nèi)毒素，能分泌大量蛋白質(zhì)到細胞外。除炭疽和蠟樣芽孢桿菌外，均對人畜無毒。(二)缺點自身分泌蛋白酶，使目的基因表達產(chǎn)物降解；質(zhì)粒不穩(wěn)定。*93三、鏈霉菌表達系統(tǒng)常用宿主細胞為變鉛青鏈霉菌(Streptomyces

lividans)；載體有高拷貝載體、低拷貝載體、穿梭載體、黏粒、噬菌體載體等。(一)優(yōu)點分泌蛋白酶量較少；可借助其胞外酶分泌系統(tǒng)分泌表達目的基因。(二)缺點基因操作難度比大腸埃希菌復雜得多，外源基因引入鏈霉菌的轉化率較低。

----最常用的是大腸桿菌（E.coli）表達體系統(tǒng)優(yōu)點:*94培養(yǎng)方法簡單、迅速、經(jīng)濟而又適合大規(guī)模生產(chǎn)。外源基因在原核細胞中的表達第二節(jié)外源基因的表達和鑒定產(chǎn)品功能生長素治療侏儒癥胰島素促治療糖尿病顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成促紅細胞生成素剌激白細胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細胞生長與分化干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素激活、剌激各類白細胞組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII進凝血超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品②不宜用于表達真核基因組DNA，只適于表達cDNA；

③表達真核蛋白不能形成正確的折疊和各種修飾；④高效表達時產(chǎn)物多形成無生物活性的包含體；⑤難以實現(xiàn)大量分泌性蛋白的表達；⑥真核蛋白不穩(wěn)定，易被細菌蛋白酶降解；⑦原核細胞周質(zhì)中常含有種類繁多的內(nèi)毒素。*96一、蛋白質(zhì)在原核細胞中表達的特點①受原核細胞啟動子和SD序列等元件控制；*97二、包含體的變性與復性包含體為無定型的蛋白質(zhì)聚合物。其中，50%以上是外源基因表達的空間結構錯誤的產(chǎn)物；此外，主要有宿主細胞蛋白及膜蛋白片段，還有DNA和RNA、質(zhì)粒編碼蛋白以及脂多糖等。

(一)包含體的組成與形成*98

(二)包含體的變性與復性*99三、蛋白質(zhì)在原核細胞中表達的調(diào)控在原核細胞中，與外源基因表達有關的調(diào)控因素主要有啟動子(如IPTG誘導外源基因表達)和SD序列等。四、外源基因在原核細胞中表達的鑒定外源基因在原核細胞中表達的鑒定主要包括目的基因序列的正確性，和表達產(chǎn)物的理化性質(zhì)(分子量、氨基酸組成與含量、等電點等)及生物學功能(如抑癌、抗菌等)的鑒定。*100第三節(jié)外源基因表達條件和優(yōu)化一、表達載體的優(yōu)化設計與選擇

(一)選擇適當?shù)膹妴幼舆x用具有可控表達型的啟動子，即誘導前本底表達很低或無，僅在誘導（溫度或化學誘導劑）后目的基因才能獲得較高的表達效率。利用強啟動子表達外源性基因時必須在其下游加入不依賴于ρ因子的轉錄終止區(qū)，以防止轉錄過程的通讀。

(二)引入原核增強子樣序列在轉錄起始點遠端（TSS上游至少100bp以上），引入增強子樣序列（長度為50-1500bp）。其可通過增強mRNA與核糖體的相互作用來提高翻譯的效率。*101

(三)設計合理的SD序列改善核糖結合位點結構起始密碼子ATG與SD序列之間的距離和堿基組成要處于一個適當?shù)姆秶鷥?nèi)。載體設計時應注意：①SD序列UAAGGAGG的翻譯效率要比AAGGA高3-6倍。②ATG與UAAGGAGG至少相隔3-4bp（最適距離為6-8bp），與AAGGA至少相隔5bp（最適距離為5-7bp），否則不能進行翻譯。