miRa抑制炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及其機(jī)制研究

miRa抑制炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及其機(jī)制研究第1頁/共19頁miR-26a：微小

RNA

（microRNA

）是一類長約

22nt

的核苷酸單鏈小分子

RNA

，分布于各種生物中，對基因的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用。目前miR-26a在腫瘤中研究如火如荼，尤其以肝癌中的研究最多。miR-26a在肝癌中低表達(dá)，機(jī)體炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，肝癌加重。然而關(guān)于miR-26a在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況、生物學(xué)功能以及參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制文獻(xiàn)報道較少。關(guān)鍵詞第2頁/共19頁炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌：由結(jié)腸或直腸炎癥引起的結(jié)腸或直腸癌炎癥微環(huán)境可以影響腫瘤的發(fā)生和腫瘤形成，從臨床前研究和臨床研究通過潛在分子機(jī)制已經(jīng)證明炎癥持續(xù)發(fā)生會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，是發(fā)生癌變的高危因素。流行病學(xué)研究顯示，包括潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥性腸病發(fā)生癌變的機(jī)制為：發(fā)炎黏膜增生性病變-不典型增生-癌變。由炎癥誘發(fā)的癌變機(jī)制包括：炎癥誘導(dǎo)活性氧和活性氮產(chǎn)生、誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定、基因突變后的倍性、增強(qiáng)細(xì)胞增殖、基因異常表達(dá)、抗凋亡、腫瘤的血管可以新生以至于更具侵略性、穿透基底膜導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。這些機(jī)制可以直接或是間接的通過損傷重要的細(xì)胞成分(例如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì))，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。炎癥已經(jīng)成為癌癥的第七大特征，慢性炎癥的持續(xù)刺激是多種腫瘤產(chǎn)生的關(guān)鍵原因。關(guān)鍵詞第3頁/共19頁AOM/DSS誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌模型：氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸鈉(dextransodiumsulfate,DSS)小鼠模型是一種在致癌劑AOM和致炎劑DSS協(xié)同作用基礎(chǔ)上，由炎癥性腸病(inflmmatoryboweldisease,IBD)逐步發(fā)展為結(jié)直腸癌的炎癥相關(guān)性癌癥的研究模型。AOM/DSS模型能很好地模擬慢性腸道炎癥誘發(fā)癌癥的生理病理過程，近年來被廣泛用于炎癥相關(guān)性癌癥形成機(jī)制的研究。關(guān)鍵詞AOM/DSS模型誘導(dǎo)方法主要有兩種：“四步法”為AOM單劑量(7.5~12.5mg/kg)腹腔注射后，即時或1周后飼喂含1%~3%DSS飲水7d(也有4d)，之后改為正常飲水14d為1個循環(huán)，共循環(huán)3次；“兩步法”與前者的區(qū)別在于將3次循環(huán)的DSS處理縮短為單次循環(huán)，共兩步完成。四步法較兩步法加速了腫瘤的生長。第4頁/共19頁第5頁/共19頁psiCHECK2雙熒光素酶系統(tǒng)：由promega公司研發(fā)，雙熒光素酶報告基因在同一載體上。其中，海腎熒光素酶基因(hＲluc)為報告基因，螢火蟲熒光素酶基因(Fluc)為內(nèi)參基因，兩個熒光素酶基因都有自己的啟動子、終止位點(diǎn)，二者獨(dú)立表達(dá)互不干擾。該載體可快速準(zhǔn)確地反應(yīng)微小ＲNA(microＲNA，miＲNA)和ＲNA干擾(ＲNAinterference，RNAi)對靶基因的調(diào)控作用效果，但需要特定的熒光素酶檢測試劑盒和熒光素酶報告基因檢測儀。關(guān)鍵詞第6頁/共19頁第7頁/共19頁雙熒光素酶系統(tǒng)實(shí)驗方法：（1）PCR擴(kuò)增靶基因的3’UTR，或直接合成結(jié)合位點(diǎn)序列；

（2）將上述DNA片段克隆至報告載體psiCHECK質(zhì)粒；

（3）合成miRNA模擬物；

（4）將報告載體與miRNA模擬物共轉(zhuǎn)待檢細(xì)胞；

（5）多功能酶標(biāo)儀檢測報告基因的表達(dá)水平。第8頁/共19頁轉(zhuǎn)基因小鼠制備誘導(dǎo)炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌ELISA、WB、qRT-PCR檢測炎癥因子，HE染色病理觀察軟件分析miR-26a靶蛋白雙熒光素酶系統(tǒng)驗證Mimics高表達(dá)miR-26a，CCK-8、WB、qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)炎癥靶蛋白臨床樣本檢測課題設(shè)計第9頁/共19頁1.分別制備全身細(xì)胞過表達(dá)miR-26a、髓系細(xì)胞過表達(dá)miR-26a和腸上皮細(xì)胞過表達(dá)miR-26a的轉(zhuǎn)基因小鼠；利用AOM/DSS誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌實(shí)驗分組正常小鼠對照組全身過表達(dá)組髓系細(xì)胞過表達(dá)組腸上皮細(xì)胞過表達(dá)組預(yù)期結(jié)果獲得不同部位高表達(dá)miR-26a的結(jié)直腸癌小鼠模型。第10頁/共19頁2.ELISA檢測各類轉(zhuǎn)基因小鼠外周血中炎癥相關(guān)因子如：IL-1、IL-6、IL-10、IL-23、TGF-β、NF-kB、TNF-α、TNF-β等；WB和qRT-PCR檢測腫瘤組織中的炎癥相關(guān)因子；以及大腸組織切片觀察病理形態(tài)及腫瘤組織形態(tài)實(shí)驗分組正常小鼠對照組全身過表達(dá)組髓系細(xì)胞過表達(dá)組腸上皮細(xì)胞過表達(dá)組實(shí)驗方法ELISAWBqRT-PCRHE染色預(yù)期結(jié)果確定小鼠模型中miR-26a高表達(dá)對炎癥因子表達(dá)和癌癥發(fā)展的影響。第11頁/共19頁3.選擇靶基因搜索數(shù)據(jù)庫TargetScan和PicTar軟件預(yù)測miR-26a的靶基因，對兩種預(yù)測軟件獲得的靶基因取交集作為miR-29a的靶基因集合。查閱文獻(xiàn)尋找可促進(jìn)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖的蛋白預(yù)期結(jié)果找到能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖的miR-26a靶蛋白。第12頁/共19頁4.在293T細(xì)胞中以psiCHECK2.2雙熒光素酶系統(tǒng)驗證靶基因?qū)嶒灧纸MpsiCHECK2空載與陰性對照psiCHECK2空載與miR-26amimicspsiCHECK2-3’UTR與陰性對照psiCHECK2-3’UTR與miR-26amimics預(yù)期結(jié)果海腎熒光素酶表達(dá)，螢火蟲熒光素酶表達(dá)；海腎熒光素酶表達(dá)，螢火蟲熒光素酶表達(dá)；海腎熒光素酶表達(dá)，螢火蟲熒光素酶表達(dá)；海腎熒光素酶低表達(dá)，螢火蟲熒光素酶表達(dá)；驗證軟件尋找的靶基因確實(shí)能與miR-26a特異性結(jié)合。第13頁/共19頁5.用mimics高表達(dá)SW620細(xì)胞中的miR-26a，CCK-8檢測細(xì)胞增殖，WB和qRT-PCR檢測靶蛋白、各種炎癥相關(guān)因子的表達(dá)情況和mRNA水平實(shí)驗分組正常對照組陰性對照組Inhibitor組實(shí)驗方法CCK-8WBqRT-PCR預(yù)期結(jié)果miR-26a的高表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，減少靶蛋白和炎癥因子的表達(dá)，體外驗證靶蛋白。第14頁/共19頁6.在三種不同的轉(zhuǎn)基因小鼠大腸組織中WB檢測靶蛋白的表達(dá)情況實(shí)驗分組正常小鼠對照組全身過表達(dá)組髓系細(xì)胞過表達(dá)組腸上皮細(xì)胞過表達(dá)組實(shí)驗方法WB預(yù)期結(jié)果體內(nèi)驗證靶蛋白第15頁/共19頁7.取不同病理期的結(jié)直腸癌患者外周血和腫瘤組織，檢測miR-26a和炎癥因子表達(dá)情況，病理切片分析miR-26a、炎癥因子濃度和腫瘤發(fā)展情況，以正常體檢患者外周血和癌旁組織為正常對照實(shí)驗分組正常體檢樣品不同病理期臨床樣品實(shí)驗方法ELISAWBqRT-PCRHE染色免疫組化預(yù)期結(jié)果了解臨床樣本中miR-26a與炎癥因子、腫瘤發(fā)展的關(guān)系。第16頁/共19頁預(yù)期結(jié)果臨床樣本中隨著炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)展，m