病毒感染的實驗診斷課件

病毒感染的實驗診斷什么是病毒？病毒（virus）是一類體積微小、結構簡單、有嚴格的細胞內寄生性的非細胞型微生物。

特點：體積微小，只能在電鏡下觀察，能通過濾菌器無完整的細胞結構：蛋白質衣殼＋核酸核心只有一種類型核酸：RNA或DNA有嚴格的細胞內寄生性，只能在活細胞內生長以核酸復制的方式增殖，不能進行二分裂繁殖抵抗力特殊：耐冷不耐熱，對化學因素的抵抗力較一般比細菌強，耐甘油，對抗生素及磺胺類藥物不敏感，干擾素可抑制病毒復制。一、標本采集、運送和處理（一）標本采集采集時間：盡早采集（越早越好）標本種類：根據感染的部位、可能感染的病毒類型選擇標本種類無菌采集標本：必要時用抗生素或抗真菌藥處理抑制細菌生長

100U/ml青霉素＋100μg/ml鏈霉素抑制真菌生長

2.5μg/ml二性霉素B或40μg/ml制霉菌素血清學檢查標本：雙份血清（二）標本的運送與保存1.低溫送檢

4℃可保存數小時，-70℃可長期保存

-10～-20℃下病毒易滅活，不可用于保存病毒標本對冷凍標本應避免反復凍融2.保濕送檢50%甘油鹽水保存送檢病毒轉運培養(yǎng)基（virustransportmedium，VTM）含0.5%明膠或牛血清白蛋白的Hank’s液3.無菌送檢抑制細菌生長100U/ml青霉素＋100μg/ml鏈霉素抑制真菌生長2.5μg/ml二性霉素B或40μg/ml制霉菌素二、病毒的形態(tài)學檢查1.光學顯微鏡檢查

主要觀察病變組織中的包涵體，某些大病毒也通過光學顯微鏡觀察。簡便、快速，但敏感性低，有些病毒感染細胞后不形成包涵體

狂犬病毒胞漿內包涵體（內基小體）巨細胞病毒胞核內包涵體（貓頭鷹眼）三、病毒的分離與鑒定動物接種組織培養(yǎng)標本采集標本處理后接種雞胚接種卵黃囊膜尿囊液羊膜腔液絨毛尿囊膜觀察囊膜病變血凝試驗血凝抑制試驗CPEEM包涵體空斑試驗紅細胞吸附中和試驗觀察發(fā)病抗原檢測抗體檢測病理檢查（一）病毒的分離組織培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)動物接種1.組織培養(yǎng)將人或動物離體的活組織或分散的活細胞在體外人工控制的條件下使其生長繁殖的一種技術。組織培養(yǎng)的類型:（1）組織塊培養(yǎng)（2）器官培養(yǎng)人胚氣管－呼吸道病毒；人胚腸－腸道病毒（3）細胞培養(yǎng)最常用原代和次代細胞培養(yǎng)二倍體細胞培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng)二倍體細胞株原代細胞反復傳代（50～70代）仍保持二倍體染色體特性。病毒分離和疫苗制備的首選細胞株。傳代細胞株

來源于腫瘤細胞或突變的二倍體細胞，能在體外無限增殖。增殖快，不易衰老，易于傳代保存。常用于病毒的分離鑒定，但不能用于制備疫苗。優(yōu)點細胞來源廣、敏感細胞株多不受機體免疫因素的影響，個體差異小病變結果易于觀察可用于病毒的分離鑒定和制備疫苗及抗原缺點條件要求相對較高，有細胞培養(yǎng)條件的實驗室才能做2.雞胚培養(yǎng)新鮮受精卵接種病毒38～39℃7～13d卵黃囊接種（流行性腦炎病毒）羊膜腔接種（流感病毒）尿囊腔接種（傳代培養(yǎng)）絨毛尿囊膜接種（痘類病毒）優(yōu)點雞胚來源充足，操作簡便，有多種接種途徑病毒增殖快，可收獲大量病毒雞胚本身是無菌的，對接種的病毒不產生抗體缺點易感病毒少，目前主要用于流感病毒、腮腺炎病毒、皰疹病毒和痘類病毒的分離培養(yǎng)。某些病毒在雞胚內傳代后，其毒力下降3.動物接種常用動物小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病毒對動物的敏感性不同，根據病毒種類加以選擇。接種途徑按病毒侵襲部位選擇相應的接種途徑：乙型腦炎病毒及狂犬病毒小鼠腦內接種柯薩奇病毒乳鼠腹腔接種乙肝病毒黑猩猩靜脈注射流感病毒鼻腔滴種用途分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清優(yōu)點方法簡單、結果易于觀察選擇適當的接種途徑，可出現類似人類的感染癥狀，有利于發(fā)病機制的研究缺點可自然帶毒或隱性感染，干擾實驗結果有個體差異很多病毒無敏感動物，或感染后不出現明顯癥狀病毒在細胞培養(yǎng)中的表現1.細胞代謝作用改變（培養(yǎng)液顏色變化）正常細胞代謝：培養(yǎng)液由紅變黃病毒增殖，抑制細胞代謝：培養(yǎng)液顏色不變或更紅

病毒在細胞內增殖后，使宿主細胞的形態(tài)發(fā)生不同程度改變，稱為細胞病變效應（cytopathiceffect，CPE）。2.細胞形態(tài)改變細胞變圓、融合、腫脹、細胞空泡、核濃縮、形成嗜酸性或嗜堿性包涵體等。

某些病毒感染細胞后不出現CPE3.干擾現象（interference）當兩種不同的病毒同時或先后感染同一細胞時，其中一種病毒可抑制另一種病毒的增殖，稱為病毒的干擾現象。干擾現象也可被相應特異性抗體抑制，稱為干擾抑制現象鼻Ｖ.無CPE鼻V.＋Poli.V無CPEPoli.V有CPE病毒的血清學鑒定對初步鑒定為陽性的標本均需要用血清學方法做最后鑒定。方法：血凝抑制試驗、中和試驗、免疫熒光試驗、ELISA等。四、病毒的血清學診斷用已知病毒抗原檢測患者血清中的相應抗體，可協助診斷病毒感染。雙份血清IgG測定4倍以上增長，有診斷意義單份血清IgM測定可用于早期診斷，但部分病人可能陰性，少數病人產生的特異性IgM抗體也可在體內持續(xù)存在1～2年。病毒血清學試驗常用方法（一）中和試驗

原理抗體與相應病毒結合后，能夠使病毒失去感染性。V.＋Ab→失去感染易感細胞的能力

一定量抗體可中和一定量病毒根據抗體的效價對待測病毒液進行半定量檢測。中和試驗的必要條件：1.活病毒2.敏感細胞、雞胚或動物中和試驗的特點：特異、敏感，既可檢測抗體，也可測定抗原（定屬、定型）。既可用細胞培養(yǎng)做，也可用動物或雞胚接種，以細胞培養(yǎng)法最常用。檢測IgG，不能用于早期診斷，常用于流行病學調查。（二）補體結合試驗檢測IgM，常用于早期診斷。不需活細胞，比中和試驗簡單，省時。（三）IF及ELISA方法簡單、快速、敏感性高。檢測特異性IgM，有助于某些病毒感染的早期診斷，如：孕婦羊水中檢測IgM型特異抗體：胎兒先天性感染抗HBcIgM：作為急性HBV感染的指標（四）血凝及血凝抑制試驗含有血凝素的病毒能吸附一定種類的哺乳動物或禽類的紅細胞，使紅細胞凝集。該現象可被相應的血凝素抗體抑制，稱為血凝抑制試驗，可用于病毒的分型。五、病毒抗原檢查DFA、IFA、IEA等?？蓹z測細胞內、外的游離病毒抗原。敏感、特