葫蘆砧木種子中帶菌量與砧木苗期細菌性果斑病發(fā)生的關系,植物保護論文

葫蘆砧木種子中帶菌量與砧木苗期細菌性果斑病發(fā)生的關系,植物保護論文細菌性果斑病(bacterialfruitblotch,BFB)是多種瓜類作物的重要病害,病害主要侵染源為種子帶菌。在中國,BFB是一種檢疫性病害,其病原菌為燕麥嗜酸菌西瓜亞種(Acidovoraxavenaessp.citrulli,Aac),屬革蘭氏陰性菌。Aac可在植株的葉片、莖部和果實等部位引起病害,尤其以苗期及果實期危害最嚴重。苗期發(fā)病可導致整株幼苗死亡,而在果實上發(fā)病則造成減產(chǎn),甚至絕收。該病害在高溫高濕的環(huán)境下發(fā)病特別迅速,迄今為止在世界范圍內還沒有完全免疫BFB的葫蘆科作物品種。BFB在中國新疆、內蒙古、海南、湖北、河南等很多地區(qū)均有發(fā)生,并給瓜類生產(chǎn)造成極大的經(jīng)濟損失。最近幾年來,隨著育苗工廠集約化的迅速發(fā)展,西甜瓜嫁接苗技術已廣泛運用于大型的育苗工廠中。該技術在防治西甜瓜枯萎病等多種土傳病害上具有很好的效果,但育苗工廠中育苗的密集性和適宜Aac存活與生長的高溫高濕環(huán)境,也為細菌性果斑病在嫁接育苗經(jīng)過中的存活和大規(guī)模爆發(fā)提供了有利條件。當前,對工廠化育苗中細菌性果斑病苗期的侵染途徑研究較少。筆者分析了葫蘆砧木種子中不同Aac帶菌量與砧木苗期細菌性果斑病發(fā)生的關系,旨在明確細菌性果斑病通過種子帶菌引起苗期發(fā)病的侵染途徑,為嫁接苗工廠化育苗生產(chǎn)和有效防治細菌性果斑病提供理論根據(jù)。1、材料與方式方法1.1試驗材料供試砧木葫蘆種子品種為京欣砧1號,由北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心提供;燕麥嗜酸菌西瓜亞種(Aac)菌株Pslb96由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保衛(wèi)研究所趙廷昌研究員惠贈。試驗固體培養(yǎng)基為KBA培養(yǎng)基(蛋白胨20g、硫酸鎂1.5g、磷酸氫二鉀1.5g、甘油10g、蒸餾水1000mL、瓊脂20g、pH7.0~7.4),液體培養(yǎng)基為KB(無瓊脂KBA培養(yǎng)基)。育苗基質為有機營養(yǎng)土,由鎮(zhèn)江培蕾基質科技發(fā)展公司生產(chǎn)。1.2Aac菌液配制參考Dutta等的方式方法配制Aac不同濃度菌液。將Pslb96株劃線接種在KBA平板上,置于28℃培養(yǎng)箱內,培養(yǎng)2d后挑取單菌落,接種在KB培養(yǎng)液中,在30℃下?lián)u培(250r/min)過夜。將菌液于6000r/min離心5min。棄上清后,菌體用0.1PBS緩沖液重新懸浮。用分光光度計測定菌懸液的吸光值(D600),并用PBS緩沖液將菌懸液的D600值調節(jié)至0.3(菌體濃度約為1108cfu/mL。最后用0.1PBS緩沖液將菌懸液的濃度分別調節(jié)至1103、1105、1107cfu/mL。1.3Aac接種與病害調查參考王曉東的方式方法用不同濃度的菌懸液處理葫蘆砧木種子。砧木種子用5%NaClO消毒5min,隨后用無菌水中浸洗3次,并將其浸泡在各濃度Aac菌懸液中1h。以浸泡在無菌水中的種子作為對照,各處理48粒種子。最后將清洗后的種子在室溫下晾干過夜,在30℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽72h,將葫蘆砧木種子播種在穴盤內的基質中,每穴1粒種子。將穴盤置于日溫為28~32℃,夜溫為20~22℃的溫室中(無補光措施)進行育苗。分別在接種后4、6、8、10、12d逐株檢查幼苗發(fā)病情況,統(tǒng)計發(fā)病率與病情指數(shù)。病害等級分級標準參考金巖的方式方法并略加修改,即根據(jù)病斑面積占總子葉面積百分比進行分級:0級,不發(fā)病;1、2、3、4、5級,病斑面積分別為5%、5%~20%、20%~40%、41%~60%、60%。各處理重復3次。1.4Aac侵染觀察與病菌分離用濃度為1107cfu/mL的Pslb96菌液浸泡葫蘆砧木種子1h,并將種子播種在穴盤中,在溫室播種后連續(xù)觀察幼苗的發(fā)病情況和發(fā)病部位,再分別在播種4、6、8、10d后取子葉下胚軸0~3cm和3~6cm處進行Aac的分離。將幼苗的不同部位在5%的NaClO溶液中外表消毒3min,用無菌水沖洗3次后,將病組織浸入無菌水中并搗碎,靜置20min使組織中病菌釋放入水中。然后將組織懸液進行梯度稀釋,涂布于含有氨芐青霉素(1mg/mL)和黃連素(20mg/mL)的選擇性培養(yǎng)基上,28℃下培養(yǎng)48h。統(tǒng)計類似Aac菌落數(shù)量。為驗證分離的細菌是Aac,在平板上挑取疑似Aac單菌落5個,接種在含氨芐青霉素(1mg/mL)和黃連素(20mg/mL)的KB培養(yǎng)基中搖培過夜,菌液用Aac特異性引物WFB1和WFB2進行PCR擴增以確定目的菌能否為Aac。1.5Aac在葫蘆幼苗中定殖的觀察。取下胚軸有明顯細菌性果斑病病癥的砧木幼苗,將其下胚軸發(fā)病部位剪下,并進行FAA固定,梯度乙醇脫水,石蠟浸透包埋、切片、去蠟、蕃紅固綠染色、二甲苯透明、香脂封固,最后制成石蠟切片。石蠟切片的操作參考方中達的方式方法。制成的石蠟切片在微分干預顯微鏡下進行觀察,明確樣品中Aac在砧木下胚軸中的定殖部位。2、結果與分析2.1Aac接種量對葫蘆苗期BFB發(fā)生的影響試驗結果表示清楚,在一樣的高溫高濕育苗環(huán)境條件下,Aac菌株Pslb96不同接種量浸泡處理均可引起葫蘆幼苗發(fā)生BFB,且處理間發(fā)病率及病情指數(shù)均存在顯著差異。隨著浸種菌體濃度的增加,在播種后不同時間觀察葫蘆苗期發(fā)病率和病情指數(shù)均呈上升趨勢,4~8d時發(fā)病率和病情指數(shù)上升較快,8~12d時趨于緩慢(圖1)。在播種后12d,當Pslb96浸種濃度為1103cfu/mL時,葫蘆幼苗發(fā)病率到達55%,病情指數(shù)為37;當Pslb96浸種濃度為1107cfu/mL時,葫蘆幼苗發(fā)病率可到達99%,病情指數(shù)為90。2.2葫蘆苗期Aac的侵染經(jīng)過對葫蘆幼苗BFB異常感覺和狀態(tài)出現(xiàn)的動態(tài)觀察結果表示清楚,BFB在高溫高濕的育苗環(huán)境條件下發(fā)展迅速。病害發(fā)生初期子葉有稍微水漬狀病斑,隨著葫蘆砧木幼苗的生長,細菌性果斑病開場由發(fā)病子葉逐步向葉基部進行擴展,并侵染幼苗下胚軸(圖2)。Aac病原菌分離試驗結果表示清楚,Pslb96浸種后,隨著葫蘆種子的萌發(fā)及幼苗的生長至4d時,子葉開場出現(xiàn)水漬狀病斑且可在葫蘆砧木幼苗子葉中分離到Aac,下胚軸健康且未分離到Aac(表1)。浸種后6d,子葉出現(xiàn)典型細菌性果斑病水漬狀病斑,下胚軸未表現(xiàn)異常感覺和狀態(tài),但可在下胚軸距子葉0~3cm處分離到Aac;浸種后8d,除子葉外,在下胚軸距子葉0~3cm部分出現(xiàn)水漬狀病斑并可也分離到Aac;浸種后10d,子葉、下胚軸距子葉0~3cm部分及下胚軸距子葉3~6cm部分均出現(xiàn)典型水漬狀病癥和黃褐色病斑并可分離到Aac。2.3Aac在葫蘆砧木苗期下胚軸的定殖發(fā)病砧木幼苗下胚軸組織橫截面的石蠟切片染色觀察結果表示清楚,Aac定殖于下胚軸維管束的木質部和韌皮部中,而下胚軸薄壁組織中未觀察到Aac的存在(圖3)。3、討論病原物能夠侵入成功的影響因素之一是接種體的數(shù)量。病原物需要有一定的數(shù)量才能引起侵染和發(fā)病。本研究結果表示清楚,砧木用葫蘆幼苗期細菌性果斑病發(fā)生的嚴重程度與其種子含有Aac的帶菌量有密切關系。在一樣的育苗環(huán)境中,種子內部Aac含量越多,葫蘆砧木幼苗的發(fā)病率和病情指數(shù)越高,所造成的危害越嚴重。而且,在較低的Aac帶菌量下(103cfu/mL),12d后細菌性果斑病發(fā)病率仍然可到達50%以上,病情指數(shù)到達30以上。除此之外,隨著時間的推移,砧木苗期的發(fā)病會愈發(fā)嚴重,甚至造成砧木的死亡。因而,對于細菌性果斑病發(fā)生嚴重的育苗工廠,砧木種子嚴格的消毒處理是非常有必要的,否則會對工廠化大規(guī)模育苗造成極大的經(jīng)濟損失。到當前為止,關于西瓜細菌性果斑病侵染方面的研究還不夠完善和深切進入。Walcott等的研究表示清楚西瓜細菌性果斑病能夠在花期侵染花瓣而產(chǎn)生帶菌但無病癥的果實,且果實中的種子內能夠檢測到Aac的存在。Lessl等證明Aac在適宜的環(huán)境條件下能夠迅速定殖在西瓜雌花的柱頭上,并可通過輸導組織侵染子房。Dutta等曾解剖被Aac感染的西瓜病果中的種子,發(fā)現(xiàn)Aac在種子的種皮、種殼和胚中均可定殖。但是,關于西瓜細菌性果斑病菌在葫蘆科作物苗期的侵染,十分是關于工廠化育苗中細菌性果斑病對砧木的侵染還鮮有報道。本試驗通過對Aac在病組織內定殖位點的觀察及對砧木幼苗不同部位Aac病原菌進行分離,發(fā)現(xiàn)Aac以種傳途徑作為初侵染來源時,病菌可隨著砧木苗期的發(fā)育進行侵染。研究結果表示清楚,Aac侵染后首先在幼苗子葉表現(xiàn)異常感覺和狀態(tài),環(huán)境條件適宜時發(fā)病迅速,隨著幼