單克隆抗體的制備

關于單克隆抗體的制備第一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日什么是單克隆抗體？1、單克隆抗體（monoclonalantibodies,mAb）：

由單個B淋巴細胞經過無性繁殖（克?。纬苫蛐拖嗤募毎海@一細胞群所產生的化學性質單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體。與多抗相比，單抗純度高，專一性強、重復性好、且能持續(xù)地無限量供應。第二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日單克隆抗體制備原理

-----第三頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日單克隆抗體雜交瘤技術基本流程

第四頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日

在培養(yǎng)基中加入氨基嘌呤，收集增殖細胞！3種雜交細胞：①B-B融合細胞、②雜交瘤細胞③瘤-瘤融合細胞未融合的細胞：④單個的B細胞、⑤單個的骨髓瘤細胞這五種細胞中，

①④沒有分裂能力，逐漸衰老死亡；③⑤的DNA復制只有D途徑，

加入氨基嘌呤后，使D合成途徑阻斷，也逐漸衰老死亡，但②的DNA復制有D、S兩條途徑，雖然D途徑被氨基嘌呤阻斷，但是還可以通過

S途徑進行DNA的復制，使細胞有分裂能力。第五頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日第六頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日單克隆抗體的制備步驟

一：免疫原的制備：1：完全抗原：病毒、細菌、真菌等微生物和蛋白質等分子量大于5000Da生物物質2：半抗原：多糖、藥物、激素、肽類等分子量小于5000Da物質3：半抗原需與BSA、OVA等載體交聯(lián)后成完全抗原才能刺激動物產生可應用的高效價的抗體第七頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日

單克隆抗體的制備步驟

免疫動物的選?。?-8周齡的雌性，純系的BalB/C。免疫原：細胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周

100~200微克抗原，融合前3天，加強免疫。

免疫程序：免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、

間隔時間、佐劑的選擇。二.動物免疫第八頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日單克隆抗體的制備步驟

抗原接種第九頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日

單克隆抗體的制備步驟

三：細胞融合

細胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠產生特異性的B淋巴細胞和骨髓瘤細胞,在PEG

融合劑或是電刺激或是激光刺激來促使細胞融合形成雜交瘤細胞。蹄選得到的雜交瘤

細胞繼承了B淋巴細胞產生特異性抗體以及骨髓瘤細胞無限傳代的特性,并以此進行

大規(guī)模的細胞培養(yǎng),生產出大量的特異性良好的單克隆抗體,為快速診斷試劑的研制

奠定了堅實的基礎。

第十頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日所需試劑：

培養(yǎng)液：RPM1640培養(yǎng)液，DMEM培養(yǎng)液，HAT培養(yǎng)液，HT培養(yǎng)液細胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細胞融合劑

作用機理：誘導細胞膜上脂類物質結構重排，使細胞膜易打開而

有助于細胞融合作用特點：隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度

與毒性有所不同第十一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日

單克隆抗體的制備步驟

三.細胞融合

步驟●·1：飼養(yǎng)細胞為小鼠的腹腔巨噬細胞。第十二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日

單克隆抗體的制備步驟

1：將脾細胞和骨髓瘤細胞5:1混合，加DM液，混勻

2：離心，棄上清，磨成糊狀

3：將離心管置于37°溫水，搖動；邊滴加PEG14504：加入DM液

5：離心，棄上清

6：HAT重懸后加入96孔板，放入CO2培養(yǎng)箱

7：五天后，15%血清的HAT補液

8：八天后，徹底換15%血清DM液三.細胞融合第十三頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日ELISA方法篩選陽性孔單克隆抗體的制備步驟四.雜交瘤細胞及陽性孔的篩選第十四頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日陽性孔單克隆抗體的制備步驟

用多孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，稀釋度要保證每個孔內不多于一個細胞?？乖贵w雜交法檢測——呈陽性反應四.雜交瘤細胞及陽性孔的篩選間接ELISA方法篩選陽性孔第十五頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日單克隆抗體的制備步驟六：亞克隆是為了獲得穩(wěn)定的陽性菌株對檢測有陽性且敏感性好的細胞要盡早進行克隆化,否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制,因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快,二者競爭的會使產單抗的細胞丟失第十六頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日單克隆抗體的制備步驟篩選陽性細胞孔HAT重懸陽性孔內的細胞取10ul做倍比稀釋目標孔：80-100個細胞將目標孔細胞全部移至適量的HAT溶液中，鋪板每次亞克隆十天后，用ELISA法做抗體檢測，確定陽性孔按上述方法進行第二，第三次亞克隆第三次亞克隆結束后，將確定為陽性孔的細胞進行擴大培養(yǎng)六：亞克隆每次亞克隆后要進行細胞的凍存保種第十七頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日單克隆抗體的制備步驟1：在建立雜交瘤細胞的過程中，有時一次融合產生很多“陽性”孔，來不及對所有的雜交瘤細胞作進一步的工作，需要把其中一部分細

胞凍存起來；另一方面，為了防止實驗室可能發(fā)生的意外事故。2:配制方案：DMEM:血清：DMSO=7：2：1“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

保存數(shù)年至數(shù)十年.

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復蘇.七：雜交瘤細胞的凍存與復蘇細胞冷凍的意義防止污染、

避免染色體丟失、防止非分泌細胞的過度生長、防止細胞密度過高而死亡第十八頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日單克隆抗體的制備步驟八：如何得到大量的單克隆抗體？動物體內誘生法：使用的動物當然首選BALB/c小鼠,將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔內，在小鼠腹腔內生長雜交瘤，并產生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高。體外培養(yǎng)法：a、懸浮培養(yǎng)法b、微載體培養(yǎng)法Microcarrierc、中空纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)d、微囊化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)

第十九頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日收集細胞培養(yǎng)瓶中的雜交瘤細胞以備注入小鼠腹腔誘生腹水時,一定要用無血清培養(yǎng)液多離心幾次,將細胞培養(yǎng)液含有的牛血清洗凈,防止牛血清進入了小鼠腹腔使小鼠死亡。小鼠的選擇上一定要選擇活力好、腹腔大的小鼠。當小鼠腹腔開始發(fā)脹后,每天密切關注小鼠狀態(tài),取出腹水,立即離心,去除上層的腹腔脂肪,下層有時會出現(xiàn)細胞,除去。離心后馬上進行純化。第二十頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日單克隆抗體的制備步驟飽和硫酸銨一DEAE離子交換柱法離子交換是指液相中的離子與固定相上可解離基團的可逆交換反應。利用這個反應先將要分離的混合物在一定pH的溶液中解離,而后流經固定相,使之與固定相上的可解離基團進行離子交換,吸附于固定相上,凡不能進行交換吸附的成分,則流出層析柱外。當pH一7.4時,IgG所帶電荷為零,最先流出柱子。過柱前先用飽和硫酸銨法初步提純。蛋白質在不同濃度的鹽溶液中相對溶解度不同,血清丫球蛋白在一定濃度鹽溶液中易于沉淀,而白蛋白則不易沉淀,據(jù)此可將二者分離辛酸一飽和硫酸銨法_在酸性條件不(pH4.5),非lgG的蛋白成份(包括白蛋白,部分免疫球蛋白),能被辛酸等短鏈脂肪酸沉淀,上清中剩余的蛋白主要為IgG,再用硫酸錢沉淀上清,即可獲得純度較高的IgG。九：單克隆抗體的純化第二十一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日單克隆抗體的鑒定單克隆抗體純度的鑒定:用SDS一PAGE電泳鑒定純度單克隆抗體敏感性(IC50)值的測定:間接競爭ELISA實驗中,一般是通過IC50值來判斷抗體對CAP的敏感性,故用7個不同偶聯(lián)比的HAP一OVA進行ELISA實驗,測定不同偶聯(lián)比的包被抗原對應的IC50值。單克隆抗體特異性的測定(交叉反應)做間接競爭ELIsA,計算各自的ICS。值,計算交叉反應率。如果含有與待測物相似結構或部分相同結構的物質存在交叉反應,將測定結果升高,導致假陽性,一般以交叉反應率表示,交叉反應率越小,說明抗體特異性越好。第二十二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期日7.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價測定

將單抗腹水與Sigma公司的標準抗BALB/C小鼠IgA,IgG1,IgG2a,IgG2b、IgG3,IgM抗體，作雙向瓊脂擴散試驗。ELISA方法用常規(guī)間接ELISA方法檢測單抗腹水效價，腹水效價在