免疫銀光技術(shù)

免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)一、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展史概述…………………… 二、免疫熒光組織化學(xué)的原理………………… （一）直接方法…………… 檢查抗原方法…………………… 檢查抗體方法…………………… （二）間接方法…………… 1．檢查抗體(夾心法)方法…………… 2．檢查抗體方法…………………… 3．檢查抗原法……………………… （三）補體法……………… 1．直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物方法……………… 2．間接檢查組織內(nèi)抗原方法……… （四）雙重免疫熒光組織化學(xué)標(biāo)記方法………………… （五）對照實驗…………… 直接方法………… 間接方法………… 補體方法………… 三、熒光抗體的制備……………… （一）熒光素……………… 異硫氰酸熒光素………………… 四甲基異硫氰酸羅達(dá)明………… 得克薩斯紅(Texasred)…………… 4．其它熒光素………… （二）熒光素標(biāo)記抗體的方法…………… 1．FITC標(biāo)記抗體的方法…………… 2．四甲基異硫氰酸羅達(dá)明標(biāo)記抗體方法…………… 3．藻紅蛋白標(biāo)記抗體方法…………… 4．藍(lán)色熒光素標(biāo)記抗體方法………… （三）熒光抗體的質(zhì)量控制……………… 1．染色特異性和敏感性的測定方法………………… 2．F/P比值的測定方法……………… 3．熒光抗體的保存…………………… 四、免疫熒光組織化學(xué)染色方法……………… （一）熒光抗體染色方法………………… 1．直接方法…………… 2．間接方法(雙層法)……………… 3．間接方法(夾心法)……………… 4．補體方法…………… 5．膜抗原熒光抗體染色方法……… 6．雙重染色方法……………………… 7．熒光抗體再染色方法……………… （二）熒光抗原染色方法………………… 五、熒光顯微鏡檢查方法……………………… （一）熒光和熒光顯微鏡………………… （二）熒光顯微鏡標(biāo)本制作規(guī)定………… 1．載玻片…………… 2．蓋玻片…………… 3．標(biāo)本………………… 4．封裱劑……………… 5．鏡油………………… （三）使用熒光顯微鏡注意事項………… （四）熒光圖像的記錄方法……………… 六、非特異性染色的消除方法………………… （一）非特異性染色的重要因素………… （二）消除非特異性染色的方法………… 1．葡聚糖凝膠G-50柱層析法……… 2．DEAE纖維素柱層析法…………… 3．熒光抗體稀釋法………………… 4．純化抗原方法……………………… 5．純化抗體方法——免疫吸取方法……………… 6．伊文氏藍(lán)(Evansblue)襯染色方法……………… 七、現(xiàn)狀與展望………………… 免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)一、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展史概述免疫熒光組織化學(xué)是現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一，是由Coons和他的同事(1941)建立，免疫熒光技術(shù)與形態(tài)學(xué)技術(shù)相結(jié)合發(fā)展成免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)。它與葡萄球菌A蛋白(SPA)、生物素與卵白素、植物血凝素(ConA等)相結(jié)合拓寬了領(lǐng)域；與激光技術(shù)、電子計算機，掃描電視和雙光子顯微鏡等技術(shù)結(jié)合發(fā)展為定量免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)；熒光激活細(xì)胞分類器Fluorescinactivatedcellsorter(FACS)的應(yīng)用，激光共聚焦顯微鏡的問世，使免疫熒光細(xì)胞技術(shù)發(fā)展到更高的階段，開創(chuàng)了免疫熒光技術(shù)的新領(lǐng)域。細(xì)胞顯微分光光度計與圖像分析儀的結(jié)合使免疫熒光組織化學(xué)的定量檢測更加準(zhǔn)確。80年代到90年代相繼又有新的熒光素出現(xiàn)如R-藻紅朊，B-藻紅朊，C-藻青蛋白，cy2,cy3,cy5,cy7均在流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡中廣泛應(yīng)用。由于免疫熒光組織化學(xué)的特異性，快速性和在細(xì)胞水平定位的準(zhǔn)確性，已在免疫學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、腫瘤學(xué)以及臨床檢查等許多方面得到廣泛應(yīng)用，日益發(fā)揮重要的作用。二、免疫熒光組織化學(xué)的原理免疫熒光組織化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反映的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上具有標(biāo)記的熒光素，熒光素受激發(fā)光的照射，由低能態(tài)進(jìn)入高能態(tài)，而高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到本來的低能態(tài)，這時發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，運用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而擬定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及運用定量技術(shù)測定含量（圖3-2-1）。圖3-2-1紫外光激發(fā)熒光物質(zhì)放射熒光示意圖用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法。用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。免疫熒光組織化學(xué)分直接法、間接法和補體法。（一）直接方法檢查抗原方法這是最簡便、快速的方法，用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成特異性熒光抗體，直接用于細(xì)胞或組織抗原的檢查。此法特異性強，常用于腎穿刺，皮膚活檢和病原體檢查，其缺陷是一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。（圖3-2-2）圖3-2-2直接法檢查抗體方法將抗原標(biāo)記上熒光素，用此熒光抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反映，而將抗體在原位檢測出來。（二）間接方法1．檢查抗體(夾心法)方法此法是先用特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反映，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。2．檢查抗體方法用已知抗原細(xì)胞或組織切片，加上待檢血清，假如血清具有切片中某種抗原的抗體，抗體結(jié)合在抗原上，再用間接熒光抗體(抗種屬特異性IgG熒光抗體)與結(jié)合在抗原上的抗體反映，在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反映部位呈現(xiàn)明亮的特異性熒光。此法是檢查血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段。3．檢查抗原法此法是直接法的重要改善，先用特異性抗體與細(xì)胞標(biāo)本反映，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體與結(jié)合在抗原上的抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。同直接法相比熒光亮度可增強3或4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以合用于同一種屬產(chǎn)生的多種第一抗體的標(biāo)記顯示，這是現(xiàn)在最廣泛應(yīng)用的技術(shù)。（三）補體法1．直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物方法用抗補體C3熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補體反映，而形成抗原-抗體-補體—抗補體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復(fù)合物上補體存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。2．間接檢查組織內(nèi)抗原方法常將新鮮補體與第一抗體混協(xié)議時加在抗原標(biāo)本切片上，經(jīng)37℃孵育后，如發(fā)生抗原抗體反映，補體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補體熒光抗體與結(jié)合的補體反映，形成抗原-抗體-補體—熒光抗體的復(fù)合物，此法優(yōu)點是只需一種熒光抗體可合用于各種不同種屬來源的第一抗體的檢查。（四）雙重免疫熒光組織化學(xué)標(biāo)記方法在同一組織標(biāo)本上需要同時檢查兩種抗原時要進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧?，一般均采用直接法，將兩種熒光抗體(如抗A和抗B)以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標(biāo)記，發(fā)黃綠色熒光；抗B抗體用TMRITC或RB200標(biāo)記，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。（五）對照實驗為了保證免疫熒光組織化學(xué)染色的準(zhǔn)確性，排除某些非特異性染色，必須在初次實驗時進(jìn)行以下對照實驗：1．直接方法（1）標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本只加PBS或緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀測組織內(nèi)假如有熒光，稱為自發(fā)熒光。（2）克制實驗：可分為二步方法和一步方法。1）一步克制方法：先將熒光抗體與過量未標(biāo)記特異性抗體作等量混合，再加在標(biāo)本上染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。2）二步克制方法：標(biāo)本先加未標(biāo)記的特異性抗體，水洗后再加標(biāo)記熒光抗體，結(jié)果應(yīng)呈陰性或明顯減弱的熒光。（3）陽性對照：用已知陽性標(biāo)本做直接法免疫熒光組織化學(xué)染色，結(jié)果應(yīng)呈陽性熒光。結(jié)果：如對照1和2無熒光或弱熒光，3待檢查標(biāo)本呈強熒光即為特異性陽性熒光。2．間接方法（1）自發(fā)熒光對照：同直接法。（2）熒光抗體對照：標(biāo)本只加間接熒光抗體染色，結(jié)果陰性。（3）克制實驗：同直接法。（4）陽性對照：同直接法。結(jié)果：如對照（1）、（2）、（3）均呈陰性，陽性對照和待檢標(biāo)本呈陽性熒光則為特異性熒光。3．補體方法（1）自發(fā)熒光對照（2）熒光抗體對照（3）克制實驗（4）補體對照：取新鮮豚鼠血清1:10稀釋先作用標(biāo)本，洗后再用抗補體熒光抗體染色，結(jié)果陰性。（5）克制實驗：標(biāo)本加滅活的第一抗體，再加1:10稀釋的新鮮豚鼠血清孵育后，再加未標(biāo)記的抗補體血清與抗補體熒光抗體等量混合稀釋液，結(jié)果應(yīng)為陰性。（6）陽性對照。（1）~（5）結(jié)果陰性，6和待檢標(biāo)本陽性時，則為特異性熒光。三、熒光抗體的制備制備熒光抗體是免疫熒光組織化學(xué)的重要技術(shù)之一，制備特異性強和高效價的熒光抗體必須選用高質(zhì)量的熒光素和高效價的抗體。（一）熒光素?zé)晒馐侵敢粋€分子或原子吸取了給予的能量后即刻引起發(fā)光，停止能量供應(yīng)，發(fā)光也瞬時停止。異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）FITC是一種呈黃色粉末狀，性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫下能保存2年以上，在低溫中可保存數(shù)年。易溶于水和酒精。最大吸取光譜為490~495nm，最大發(fā)射光譜為520~530nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光，分子量為389.4。（圖3-2-3）圖3-2-3FITC的分子結(jié)構(gòu)式在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵結(jié)合,成為標(biāo)記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個IgG分子上最多能標(biāo)記15~20個FITC分子。2．四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TMRITC)TMRITC是一種紫紅色粉末，較穩(wěn)定。其最大吸取光譜為550nm，最大發(fā)射光譜620nm呈橙紅色熒光，與FITC的黃綠色熒光對比清楚，與蛋白質(zhì)結(jié)合方式同F(xiàn)ITC。它可用于雙標(biāo)記示蹤研究(圖3-2-4)。3．得克薩斯紅(texasred)得克薩斯紅是一種褐色粉末狀，易溶于有機溶劑，性質(zhì)穩(wěn)定，在4℃下能保存2年以上，最大吸取光譜為590-595nm，最大發(fā)射光譜為620-630mm，共有四種結(jié)構(gòu)，常用的分子量為625.15(圖3-2-5)。圖3-2-4TMRITC的分子結(jié)構(gòu)式圖3-2-5Texasred的分子結(jié)構(gòu)式4．其它熒光素如4-乙酰胺-4-異硫氰酸-2-硫酸芪(SITS)7-氨基甲基香豆素AMC呈蘭色熒光；藻紅素R(phycoerythrin-R)；花青(Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5,Cy7)等。（二）熒光素標(biāo)記抗體的方法1．FITC標(biāo)記抗體的方法（1）Marsshall氏法1）材料：抗體溶液、0.5mol/LpH9.0碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、三角燒瓶(25-50ml)、冰及冰槽(或1000ml燒杯)、電磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋、玻棒、棉線及燒杯(500ml)、pH7.2的0.01mol/LPBS葡聚糖凝膠G-25層析柱等。2）方法及環(huán)節(jié)：①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知抗體濃度之溶液，加入三角燒瓶中，再加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使最后抗體濃度為20mg/ml，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌(速度適當(dāng)以不起泡沫為宜)5~10min。②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)標(biāo)記的抗體總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素，用分析天平準(zhǔn)確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。③結(jié)合：邊攪拌邊將稱取的熒光素漸漸加入抗體溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上(大約在5~10min內(nèi)加完)，加完后，在4℃左右繼續(xù)攪拌12~18h，通常將裝置安放4℃冰箱或冰庫中進(jìn)行。④透析：結(jié)合完畢后，將標(biāo)記的抗體溶液離心(2023r/min)10min，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中再置于燒杯中用0.01MpH7.2緩沖鹽水透析(0~4℃)過夜。⑤過柱：取透析過夜的標(biāo)記物，通過葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行鑒定。（圖3-2-6，圖3-2-7）圖3-2-6SephadexG-25對FITC標(biāo)記抗體液(羊抗兔)柱層析洗脫模型圖3-2-7FITC與家兔IgG球蛋白在25℃和2℃時結(jié)合的動力學(xué)(Kawamura1964)（2）Chadwick氏法1）試劑和材料：抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%重碳酸鈉水溶液、0.01mol/LpH8.0磷酸鹽緩沖鹽水、1%硫柳汞、離心機及離心管、三角燒瓶(25ml)、冰槽、無菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯(500ml)透析袋、棉線、玻棒等。2）方法及環(huán)節(jié)：①抗體準(zhǔn)備：用0~4℃的pH8.0磷酸鹽緩沖鹽水將抗體蛋白溶液稀釋至濃度為30~40mg/ml，置入三角燒瓶內(nèi)，放于冰槽中。②熒光素準(zhǔn)備：按每毫克蛋白加入熒光素0.01mg計算，稱取所需之熒光素量，用3%重碳酸鈉水溶液溶解。③將準(zhǔn)備的抗體與熒光素溶液等量混合，充足攪勻，在0~4℃冰箱中結(jié)合18~24h。④透析和柱層析：方法同Marshall氏法。（3）改良法試劑：1）0.01mol/LpH7.2PBS配法：NaCl18g、Na2HPO41.15g、KH2PO40.2g，溶于2023ml蒸餾水中，校定pH至7.2。2）0.5mol/LpH9.0碳酸鹽緩沖液配法：取0.5mol/LNa2CO3(5.3%)10ml加入0.5mol/LNaHCO3(4.2%)90ml，混勻后，校定pH至9.0。3）3%重碳酸鈉水溶液配法：稱1.5g無水碳酸鈉充足溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。方法及環(huán)節(jié)：取高效價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水(0.15mol/LNaCI)及緩沖液(0.5mol/LNaHCO3-Na2CO3pH9.0)稀釋使每ml內(nèi)含抗體10mg，緩沖液為總量的10%，降溫至4℃，加入異硫氰酸熒光素，(蛋白：熒光素=80mg:1mg)，在0~4℃下電磁攪拌12~14h。然后用半飽和的硫酸銨將標(biāo)記球蛋沉淀分離，除去未結(jié)合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨(用Nessler氏試劑測驗至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為止)。將制備好的熒光抗體加疊氮鈉0.01%，分裝在1ml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，-20保存可達(dá)2年以上。2．四甲基異硫氰酸羅達(dá)明標(biāo)記抗體方法（1）取IgG10ml(6mg/ml)在0.1mol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液中透析過夜。（2）將四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(每毫克IgG加入5~20g)溶于二甲亞砜(1mg/ml)，取此溶液300l,一滴一滴加入抗體溶液中，同時電磁攪拌。（3）在室溫中攪拌2h，避光。（4）把結(jié)合物移入直徑3cm，高30cm大小的Bio-GelP-6層析柱，用0.01mol/LpH8.0的PBS平衡過柱，流速為1.5ml/min。（5）收集先流出的紅色結(jié)合物，即為標(biāo)記抗體，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?．藻紅蛋白標(biāo)記抗體方法（1）巰基化藻紅蛋白(phycoerthrin,PE)的制備600μl的15.5mg/ml鹽酸巰醇亞胺(iminothiolanehydrochloride)加到1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2mlPB(pH6.8)混合，裝入透析袋置入50mmol/LpH6.8PB中透析，4℃過夜，再換用pH7.5PB透析6h。每個PE分子中可結(jié)合8個巰基。（2）巰基PE-IgG制備異雙功能試劑SPDP[N-Succinimdyl3-(2-pyridyldithio)propionate]30g(1.1mg/ml)的乙醇溶液，加入700μl的4.2mg/mlIgGPB溶液(50mmol/LpH7.5)，在室溫中反映2.5h。再加入巰基化PE400μl(1.7mg/ml)加到500μl反映混合液中，室溫反映12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸鈉封閉殘余巰基，在4℃用PB透析過夜。加入0.01%NaN3分裝，4℃保存半年。（3）PE-標(biāo)記蛋白A方法1）取4.08mgPE溶于0.1mol/LpH7.4PB(含0.1mol/LNaCl)1ml中，溶解后，取出0.5ml，再加入10μlSPDP無水甲醇液(2.6mg/ml)，SPDP/蛋白摩爾比為10,22℃反映5min，過SephadexG-50(1×17cm)，用100mmol/LpH7.4PBS(含0.1mol/LNaCl)平衡和洗脫。2）0.5ml蛋白(2mg/ml)100mmol/LPBS(具有100mmol/LNaClpH7.4)，加入2.6μl上述SPDP甲醇液，SPDP：蛋白A=9：5，22℃，40min,加入25μl二硫蘇糖醇(DTT)pH7.4緩沖液，22℃，25min，同上過sephadexG-25，收集蛋白A峰。3）取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22℃反映6h，混合物4℃保存?zhèn)溆?，以上兩種PE標(biāo)記制品，可最后溶于0.01mol/LpH7.4PB(具有0.1mol/LEDTA、1mol/L碘乙酰胺、1%BAS和0.1%NaN3)，0~4℃保存。4．藍(lán)色熒光素標(biāo)記抗體方法Kbaffan等(1986)一方面創(chuàng)建了藍(lán)色熒光素標(biāo)記和染色技術(shù)，可進(jìn)行雙標(biāo)記或多標(biāo)記。（1）取7-氨基-甲基香豆素(7-amino-4-methylcoumarin,AMC)260μg溶于二甲亞砜25μl中。（2）將上液加入10mlIgG-

巴比妥緩沖液(0.5mol/L,pH8.5,內(nèi)含50~100mgIgG)中，室溫反映2h，過SephadexG-50除去游離熒光素,最大熒光波長430nm,最大吸取波長354nm。（三）熒光抗體的質(zhì)量控制1．染色特異性和敏感性的測定方法（1）特異性染色和效價測定直接染色效價以倍比稀釋熒光抗體溶液如1：2，1：4，1：8……，與相應(yīng)抗原標(biāo)本作一系列染色，熒光強度在“+++”的最大稀釋度，為其染色滴度(效價)或單位。實際染色應(yīng)用時，可取低一個或兩個稀釋度(即2~4個單位)，如染色效價為1：64，實際應(yīng)用時可取1：32或1：16。間接染色效價可按抗核抗體熒光染色法環(huán)節(jié)，先用不同稀釋度的熒光抗體染色，結(jié)果以抗核抗體熒光強度“++”為標(biāo)準(zhǔn)，染色用效價和直接法相同。（2）非特異性染色測定根據(jù)熒光抗體的用途不同，可用相類似的抗原切片或涂片，倍比稀釋熒光抗體，按常規(guī)染色，結(jié)果在標(biāo)本上出現(xiàn)的非特異染色應(yīng)顯著低于特異染色，否則應(yīng)采用消除非特異性染色的方法解決熒光抗體。（3）吸取實驗在熒光抗體中加入過量相應(yīng)抗原，于室溫中攪拌2h后，移入4℃中過夜，3000r/min,離心30min，收集上清液，再用于相應(yīng)抗原陽性標(biāo)本染色，結(jié)果應(yīng)不出現(xiàn)明顯陽性熒光。2．F/P比值的測定方法F(熒光素)和P(抗體蛋白)的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，一般規(guī)定F/P的克分子比值為1~2。過高時，非特異性染色增強；過低時，熒光很弱，減少敏感性。（1）蛋白質(zhì)定量測定熒光抗體的蛋白質(zhì)mg/ml量。（2）結(jié)合熒光素定量先制作熒光素定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，即準(zhǔn)確稱取FITC1mg，溶于10ml0.5mol/LpH9.0碳酸鹽緩沖液中，再用0.01mol/LpH7.2PBS稀釋到100ml，此時熒光素含量為10μg/ml，以此為原液，再倍比稀釋9個不同濃度的溶液，用分光光度計在490nm波長測定光密度值（OD），以光密度為縱坐標(biāo)，熒光素含量為橫座標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)圖。熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其吸取光譜峰值向長波方向位移約5nm，F(xiàn)ITC和蛋白質(zhì)結(jié)合后由490nm變?yōu)?93-495nm，RB200和蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)?95nm。F/P比值的計算：可按以下公式計算。FITCg/ml160000×103FITCg/mlF/P克分子比值=———————×——————=0.41×蛋白質(zhì)mg/ml390×106蛋白質(zhì)mg/ml式中160000為抗體蛋白質(zhì)的分子量，390為FITC的分子量。蛋白質(zhì)從克換算為毫克需再乘以103，而熒光素從克換算為微克需要再乘以106。測定RB200熒光抗體的克分子比值公式如下：(RB200g/ml×10-3)÷580RB200熒光抗體的克分子比值=—————————————蛋白質(zhì)mg/ml÷160000(IgG)A515nmOD160000TMRITC熒光抗體克分子量比值=————或=重量比(g/g)×————A280nmOD5803．熒光抗體的保存以0~4℃或-20℃低溫保存，防止抗體活性減少和蛋白變性。最佳加入濃度為1：5000的硫柳汞或者1：10000，疊氮納防腐，小量分裝如0.1~1ml，真空干燥后更易長期保存。四、免疫熒光組織化學(xué)染色方法（一）標(biāo)本制作（二）熒光抗體染色方法直接方法（1）染色切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價如1：8或1：16的熒光抗體，在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。（2）洗片傾去熒光抗體，將切片浸入pH7.2PBS中洗兩次，電磁振動，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。（3）50%緩沖(0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0~9.5)甘油封固、鏡檢。直接法比較簡樸，適合做細(xì)菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應(yīng)的抗原，特異性高而敏感性較低。2．間接方法(雙層法)（1）切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mol/LpH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水紙吸去多余的液體。（2）再滴加間接熒光抗體(如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等)，同上環(huán)節(jié)，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，振動，緩沖甘油封固，鏡檢。3．間接方法(夾心法)（1）切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)。（2）滴加未標(biāo)記的特異性抗原作用切片于37℃，30min。（3）緩沖鹽水洗2次，每次5min，吹干。（4）滴加特異性熒光抗體在切片上37℃，30min。（5）如（3）水洗。（6）緩沖甘油封固，鏡檢。4．補體方法（1）材料和試劑1）免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補體熒光抗體等，按下述的補體法染色。免疫血清補體結(jié)合的效價如為1：32則免疫血清應(yīng)用1：8稀釋。2）補體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補體結(jié)合反映試管法所測定的結(jié)果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4的0.1mol/LPBS中溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。3）抗補體熒光抗體：在免疫血清效價為1：4，補體為2單位的條件下，用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價，然后按染色效價1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。（2）方法環(huán)節(jié)1）涂片或冰凍切片用冷丙酮10min固定和PBS洗一次，3min，吹至組織表面無水份。2）吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清及補體的等量混合液(此時免疫血清及補體又都各稀釋一倍)滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。3）用緩沖鹽水洗2次，攪拌或振動，每次5min，吸干標(biāo)本周邊水份。4）滴加通過適當(dāng)稀釋的抗補體熒光抗體30min，37℃，水洗同(3)。5）蒸餾水洗1min，緩沖甘油封固。5．膜抗原熒光抗體染色方法本法應(yīng)用直接法或間接法的原理和環(huán)節(jié)，可對活細(xì)胞在試管內(nèi)進(jìn)行染色，常用于T和B細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、瘤細(xì)胞抗原和受體等的研究，陽性熒光重要在細(xì)胞膜上。FACS即采用此原理和方法。6．雙重染色方法在同一標(biāo)本上有兩種抗原需要同時顯示(如A抗原和B抗原)，A抗原的抗體用FITC標(biāo)記，B抗原的抗體用羅達(dá)明標(biāo)記，可采用以下染色方法：（1）一步法雙染色方法先將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合(A+B)，按直接方法進(jìn)行染色。（2）二步法雙染色方法先用RB200標(biāo)記的B抗體染色，不必洗去，再用FITC標(biāo)記的A抗體染色，按間接法進(jìn)行。結(jié)果：A抗原陽性熒光呈現(xiàn)綠色，B抗原陽性呈現(xiàn)桔紅色熒光。（三）熒光抗原染色方法某些抗原可以用熒光素標(biāo)記，制成熒光抗原，標(biāo)記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同。用熒光抗原可以直接檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗體，特異性較好，敏感性較差。染色方法同熒光抗體染色的直接方法。由于多數(shù)抗原難以提純或量少昂貴，一般很少采用此法。五、熒光顯微鏡檢查方法（一）熒光顯微鏡熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具，分透謝和落射二種類型，落射光無需鏡內(nèi)操作方便，效果更好。它是由超高壓光源、濾板系統(tǒng)(涉及激發(fā)和壓制濾板)和光學(xué)系統(tǒng)等重要部件組成。是運用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀測標(biāo)本的熒光圖像。（二）熒光顯微鏡標(biāo)本制作規(guī)定1．載玻片載玻片厚度應(yīng)在0.8-1.2mm之間，太厚的玻片，一方面光吸取多，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚焦。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時需用石英玻璃載玻片。2．蓋玻片蓋玻片厚度在0．17mm左右，光潔。為了加強激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光又可激發(fā)標(biāo)本。3．標(biāo)本組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀測到的上部不能充足激發(fā)。此外，細(xì)胞重疊或雜質(zhì)掩蓋，背景非特異染色引起的熒光影響判斷。4．封裱劑封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易不久褪去。所以，常用甘油和0.5mol／L,pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。假如用抗褪色劑封裱熒光染色標(biāo)本更有助于顯微攝影。配方是將P—次苯基二胺二氫氯100mg加入PBS10m1中，調(diào)pH至9.0～9.5，再加入甘油90ml，混勻，在室溫放置過夜，待其中小氣泡完全消失即可使用。5．鏡油一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀測標(biāo)本時，必須使用鏡油，最佳使用特制的無熒光鏡油可用甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質(zhì)量略有影響。對于落射光熒光顯微鏡BX60，NikonE-1000無須鏡油。（三）使用熒光顯微鏡注意事項1．嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書規(guī)定進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。2．應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5~15min，待光源發(fā)出強光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀測標(biāo)本。3．防止紫外線對眼睛的損害。在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。4．檢查時間每次以1~2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色；所以最多不得超過2~3h。5．熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護(hù)光源。天熱時，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充足冷卻后才干點燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。6．標(biāo)本染色后立即觀測，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)。7．熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般為四級，即“—”——無或可見薄弱自發(fā)熒光?！?”——僅能見明確可見的熒光?！?+”——可見有明亮的熒光。“+++”——可見耀眼的熒光。（四）熒光圖像的記錄方法熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特性，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時，必須將兩者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo)，即憑工作者目力觀測，作為一般定性觀測，基本上是可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展，采用細(xì)胞分光光度計，流式細(xì)胞儀，激光共聚焦顯微鏡和圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果，也必須結(jié)合主觀的判斷。熒光顯微鏡攝影技術(shù)對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易減弱褪色，要及時攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微鏡攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24o以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標(biāo)記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度就有減少。有的熒光強度不夠，曝光速度太慢，只能用人工掌握曝光時間，將熒光圖像拍攝下來。研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微數(shù)碼相機攝影系統(tǒng)裝置，如Nikon公司2023年在我國推出了NikonE-1000全自動熒光顯微鏡配備有CoolCCD與計算機聯(lián)接將圖像采集在軟盤上再與彩色打印機連接直接打印照片。六、非特異性染色的消除方法（一）非特異性染色的重要因素組織的非特異性染色的機理很復(fù)雜，其產(chǎn)生的因素重要可分以下幾點：1．一部分熒光素未與抗體結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去引起非特異性染色。2．抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分非特異結(jié)合。3．除去檢查的抗原以外，組織中還也許存在類屬抗原(如Forssman氏抗原)，可與組織中特異性抗原以外的相應(yīng)抗原結(jié)合。4．從組織中難以提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。5．抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，這種過量標(biāo)記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。6．熒光素不純，標(biāo)本固定不妥等。（二）消除非特異性染色的方法消除熒光抗體非特異性染色的方法應(yīng)根據(jù)產(chǎn)生的因素采用適當(dāng)?shù)姆椒?，常用的方法有以下幾種：1．透析法熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，可將未與蛋白結(jié)合的熒光素透析除去。（1）將標(biāo)記完畢的熒光抗體液裝入一透析袋或玻璃紙袋內(nèi)，液面稍留空隙，緊扎。（2）浸人0.01mol／LpH7.2的PBS中(懸于大于標(biāo)記物體積約50—100倍的PBS內(nèi))，在4℃中透析，每日更換3～4次PBS，透析液中無熒光即可(在熒光光源照射下)。2．葡聚糖凝膠G-50柱層析法除去游離熒光素可用葡聚糖凝膠G-25或G-50柱層析方法，加入熒光抗體15～18ml(按床體積的5％～10％加樣)，使其緩慢滲人柱內(nèi)，待即將所有入柱時，加入PBS少許，關(guān)閉下口，停留30—40min，使游離熒光素充足進(jìn)入分子篩孔中，然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的距離界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，兩者分離距離越來越大，熒光抗體最先流出，分前、中、后三部分，收集中間部分，測F／P比值，合格者濃縮，分裝。如僅用小量熒光抗體，可用1cm×20cm的層析柱，取2gSephadexG-50裝柱，即可過濾2～3.5ml熒光抗體。3.熒光抗體稀釋法先測定熒光抗體的特異性染色與非特異性染色效價，若兩者效價相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價測定方法相同。4.純化抗原方法用各種方法提純單一成分的抗原是產(chǎn)生單價特異性抗體的最重要條件?，F(xiàn)代免疫化學(xué)技術(shù)(免疫吸取法)和柱層析法等提供了很大的也許性。5．伊文藍(lán)（Evanblue）襯染色方法用0.01%伊文藍(lán)的0.01mol/LpH7.2PBS溶液稀釋熒光抗體，可將背景細(xì)胞和組織染色呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對比，減少了非特異性熒光，宜作常規(guī)應(yīng)用。伊文藍(lán)一般配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀釋至0.01%用以稀釋熒光抗體。此外，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染色。七、現(xiàn)狀與展望免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)通過半個多世紀(jì)的不斷改善和創(chuàng)新，已成為現(xiàn)代研究生物和醫(yī)學(xué)的重要手段之一。由于免疫熒光技術(shù)與形態(tài)、機能相結(jié)合不斷完善和發(fā)展，特別是合成了多種新熒光素與抗體容易結(jié)合，結(jié)合物穩(wěn)定?？梢院虵ITC結(jié)合進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)記或三標(biāo)記。至今，它已和親合化學(xué)技術(shù)如SPA，Biotin及avidin,ConA相結(jié)合，應(yīng)用領(lǐng)域也日益擴大，又與現(xiàn)代的電子計算機和掃描電視技術(shù)，共聚焦顯微鏡，熒光激活細(xì)胞分類器（FACS）以及數(shù)碼相機攝影技術(shù)的應(yīng)用，使得快速性、簡便性有了更大的提高，使得定量更加準(zhǔn)確。90年代又開展了熒光原位末端標(biāo)記和熒光原位雜交技術(shù)，使得范圍更廣大。雖然免疫組織化學(xué)有了很大的發(fā)展，如免疫金銀法，免疫膠體鐵法，SP，Evision和CSA法，但由于它有自己獨特的優(yōu)點，特異性強，定位準(zhǔn)確、簡便、快速、鮮明，在許多領(lǐng)域中仍占有不可取代的地位。如腎活檢、皮膚活檢中IgG,IgM,IgA,C3等檢測，自身抗體的檢查，傳染病的快速診斷，單克隆抗體的篩選及鑒定等。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域，放射出更加燦爛五彩繽紛的熒光。參考文獻(xiàn)Akivoshi.Kawamura,JR.Fluorescentantibodytechniquesandtheirapplication.UniversityofTokyoPress.1969王伯沄免疫熒光組織化學(xué)和熒光組織化學(xué)技術(shù)。第四軍醫(yī)大學(xué)科技資料增刊，1974;2:5~30HuangSN,etal.Applicationofimmunofluorescentstainingonparaffinsectionimprovedbytrypsindigestion.LabInvest,1976;35:383WickG,TraillKN,SchouestenK.ImmunofluorescenceTechnology,SelectedTheoreticalandClinicalAspects.ElseriesBiomedicalpress.Amsterdom,1982:P27~36,P181,P229~262,P317~323AkiyoshiKawamuraJr.Fluorescentantibody.TechniqueandTheirApplications.SecondEditionUniversityofTokyoPress,Tokyo,1977.P79,P141~281蔡文琴，王伯沄主編.實用免疫細(xì)胞化學(xué).成都：四川科技出版社1990，P968~977李成文.現(xiàn)代免疫化學(xué)技術(shù).上海：上?？萍汲霭嫔?992；P97~100Mahmudi-A3er-s;Lacy-P;Bablit2-B;Mogbel-RInhibitionofnonspecificbindingoffluorescent-labelledantibodiestohumaneosinophils.J.Immunol-Methods.1998;227(1-2):113-9Magro-C-M;Cronison-ANTheimmunofluorescentprofileofdermatomyositis:acomparativestudywithlupuserythermatosus.J-Cutan-Pathol.1997;24(9):543-52Bausch-SB.Amethodfortriplefluorescencelabelingwithviciavillosaagglutinin,ananti-parvalubuminantibodyandananti-G-Protein-coupledreceptorantibody.Brain-Res-Brain-Prtoc.1998;2(4):286-98GregoniWeber,1916-1917.Afluorescentlifetime.Jameson-DM,Biophys-J,1998;75(1):419-22Savige-JA,Paspalians-B,Silvestrini-R,etal.Areviewofimmunofluorescentpatternsassociatedwithantineutrophilcytoplasmicantibodies(ANCA)andtheirdifferentiationfromotherantibodies.J-Clin-Pathol1998;51(18)568-751BallouB,FisherGW,DengJS,etal.Cyaninefluorochenome-labededantibodiesinvivo:assessmentoftumorimagingusingCy3,Cy5,Cy5.5andCy7.Cancer-Detect-Prev1998;22(3)251-7GruberHJ,HahnCD,KadaG,etal.AanomalousfloworescenceenhancementofCy3andCy3.5versusanomalousfluorescemcelossofCy5andCy7uponcovalentlinkingtoIgGandnoncovalentbindingtoavidin.BioconjugChem2023;11(5):696-704SouthweelBR,FumessJB.ImmunohistochemicaldemonstrationoftheNKCDtachykininreceptoronmuscleandepitheliainguineapigintestine.2023;120(5):1140-51ArsenievL,PickerdN,GoudevaL,etal.CompasativeevaluationofcommonlyusedcloneandfluorochromeconjugatesofmonoclonalantibodiesforCD34antigendetection.JHematotherStemCellRes1999;8(5):547-59O’BrjenTE,MetheneyCD,PolanskyJR.Immunoflnorescencemethodforquantitythetrabecularmeshworkqlncocorticoidresponsee(TIGR)proteinintrabecularmeshworkandschlemm’scanalcells.CurrEyeRes1999;19(6):517HuangMC,KaboO,TajikaY,etal.Detectionofmammosomatotrophsinparaffinembeddedspecimensofvariouspituitaryadenomas.ChungHuaHsssuehTsaChih(Taipei).1999;62(12):845-51王伯沄,李玉松，黃高昇,張遠(yuǎn)強主編。病理學(xué)技術(shù)北京：人民衛(wèi)生出版社出版；2023年6月P380-396第三節(jié)免疫金銀組織化學(xué)技術(shù)一、免疫金銀組織化學(xué)技術(shù)發(fā)展史概述 ……………… 二、溶膠的基本概念 …………………… （一）膠體金 …………………… 1．離子分散體系 ……………… 2．膠體分散體系 ……………… 3．粗分散體系 ……………… （二）膠體金的一般性狀 ………… 1．膠體金的顏色 ……………… 2．膠體金的穩(wěn)定性 ………… 3．溶膠的聚沉現(xiàn)象 ………… 三、膠體金的制備方法 ……………… （一）制備膠體金的準(zhǔn)備 ………… 1．玻璃器皿的清潔 ………… 2．試劑的配制規(guī)定 ………… （二）制備膠體金的方法和環(huán)節(jié) ……………… 1．白磷還原法 ……………… 2．抗壞血酸還原法(StathisandFabrikanos1958) ………… 3．檸檬酸三鈉還原法(Frens1973) ………… 4．鞣酸-檸檬酸三鈉還原法(Slot與Gueeze1985年)……… 5．乙醇超聲波還原法(BaigentandMuller1980) ………… 6．硼氫化鈉還原法(Tschoppetal1982) …… 7．放射性膠體金的制備方法(KentandAllen1981) ………… 四、膠體金的質(zhì)量鑒定 ……………… （一）膠體金顆粒直徑測定 …………………… （二）膠體金顆粒均勻度測定 …………………… （三）影響膠體金顆粒大小的因素 ……………… 五、膠體金標(biāo)記的準(zhǔn)備 ……………… （一）待標(biāo)記蛋白質(zhì)的準(zhǔn)備 …………………… 1．透析除鹽: …………………… 2．去除蛋白質(zhì)中的沉淀 …………………… （二）膠體金pH值的調(diào)整 ………… （三）待標(biāo)記蛋白質(zhì)最適穩(wěn)定性的測定 ………… 1．光電比色法: ……………… 2．目測法 …………………… （四）蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記 …………………… （五）膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的純化 ……………… 1．高速與超速離心法 ………… 2．凝膠過濾法 ……………… （六）免疫金探針的鑒定 ………… 六、光鏡免疫金銀組織化學(xué) ………… （一）免疫金染色 ……………… 1．免疫金法(IGS) ……………… 2．蛋白A-金(PAG)放大法 …………………… （二）免疫金銀法（IGSS）………… 1．石蠟切片的IGSS染色 …………………… 2．冰凍切片的IGSS染色 …………………… 3．半薄切片的IGSS染色 …………………… （三）彩色免疫金銀法(CIGSS) …………………… （四）免疫金及免疫金銀技術(shù)的優(yōu)點 ………… 1．制備簡樸 …………………… 2．標(biāo)記簡樸 …………………… 3．合用范圍廣 ……………… 4．特異性強 …………………… 5．敏感性高 …………………… 6．無毒 ………… （五）IGSS染色技術(shù)的質(zhì)量控制 ……………… 1．試劑質(zhì)量 …………………… 2．染色過程 …………………… 3．背景染色的消除 ………… （六）物理顯影液及緩沖液的配制 ……………… 1．緩沖液的配制 ……………… 2．銀顯影液的配制 ………… 3．檸檬酸緩沖液的配制 …………………… 4．氫氧化鈉(NaOH)無水乙醇飽和溶液的配制 ……………… 七、現(xiàn)狀與展望 ………… 第三節(jié)免疫金銀標(biāo)記技術(shù)一、免疫金技術(shù)發(fā)展史早在一個世紀(jì)以前,化學(xué)家就對膠體金進(jìn)行了研究,當(dāng)時只是研究它的結(jié)構(gòu)和金屬性質(zhì)。1939年KauscheandRuska把煙草花葉病毒吸附到金顆粒上在電子顯微鏡下觀測金離子呈高電子密度。然而膠體金技術(shù)作為標(biāo)記物應(yīng)用于免疫組織化學(xué)研究是在1971年,Faulk和Taylor一方面將兔抗沙門氏菌抗血清與抗膠體金顆粒結(jié)合,用直接免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測沙門氏菌的表面抗原。此后,他們還把膠體金與抗膠原血清,植物血凝素,卵白蛋白,人免疫球蛋白輕鏈、牛血清白蛋白結(jié)合應(yīng)用。1974年Romano和他的同事們將膠體金標(biāo)記在馬抗人的IgG上,實現(xiàn)了間接免疫金染色法。1974年Bauer等報道凝集素-金復(fù)合物的應(yīng)用。1978年Geoghegan等應(yīng)用免疫金技術(shù)檢測B淋巴細(xì)胞表面抗原。1981年Danscher建立了銀顯影液增強光鏡下金顆?？梢娦缘拿庖呓疸y染色法(Immunogoldsliverstaining,IGSS)。到了1986年Fritz等人在免疫金銀法基礎(chǔ)上成功地進(jìn)行了彩色免疫金銀染色,使得結(jié)果更加鮮艷奪目。膠體金技術(shù)逐漸地得到完善和成熟,近2023此項技術(shù)得到了迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。應(yīng)用膠體金為標(biāo)記物的免疫金染色(IGS)與免疫金銀染色(IGSS)方法在光鏡和電鏡下可以單標(biāo)記和雙標(biāo)記或多種標(biāo)記,觀測細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu),可以定性,定位以至定量研究。目前它已被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究的眾多領(lǐng)域。二、溶膠的基本概念（一）膠體金1．離子分散體系指分散相以小分子或離子狀態(tài)分散著。這種溶液具有高度穩(wěn)定性,無論放置多久,分散相顆粒都不會因重力而下沉,不會從溶液中分離出來。2．膠體分散體系是指分散相顆粒在1-100nm之間的分散體系叫做膠體分散體系。膠體溶液外觀透明不渾濁,在普通顯微鏡下看不見它的分散相粒子,不易受重力影響與分散介質(zhì)分離沉降,但其中的溶膠粒子有聚結(jié)變大的傾向,即具有聚結(jié)不穩(wěn)定性，膠體金屬于這種體系。3．粗分散體系分散相顆粒是由許多分子組成,因粒子較大,用肉眼或顯微鏡即可看見,不穩(wěn)定,極易因重力而自動沉降,外觀渾濁不透明。（二）膠體金的一般性狀1．膠體金的顏色溶膠的顏色決定于分散相物質(zhì)的顏色、分散相物質(zhì)的散度和入射光線的種類,是散射光還是透射光,粒子越小,分散度越高,則散射光的波長越短。對同一種物質(zhì)的水溶膠來說,粒子大小不同,顏色亦不同,膠體金顆粒在5-20nm之間,吸取波長520nm,呈葡萄酒紅色,20-40nm之間吸取波長530nm,液體為深紅色,60nm的金溶液重要吸取波長600nm金溶液呈蘭紫色,若離心去掉較大的金顆粒,溶膠呈紅色。2．膠體金的穩(wěn)定性影響溶膠穩(wěn)定性的重要因素有三點:①膠粒間的互相吸引力。當(dāng)膠粒相距很近時,這種吸引力也許導(dǎo)致膠粒合并變大。②膠粒及其溶劑化層(溶劑是水就是水化層)的帶電情況。一種溶膠的各個膠粒都帶有相同的電荷。同性電荷相斥,雙電層愈厚,膠粒帶電量愈大,排斥力愈大,愈能阻止膠粒合并聚結(jié),溶膠愈穩(wěn)定。③膠體界面的溶劑膜。當(dāng)二固體間夾有一厚層液體時,這層液體膜有一個反抗二固體接近的排斥力。兩個膠粒要進(jìn)一步接近,只有克服它們之間的溶劑化膜的斥力才有也許,因此溶劑膜的斥力是使溶膠穩(wěn)定的因素之一。3．溶膠的聚沉現(xiàn)象（1）少量電介質(zhì)對溶膠的聚沉作用少量電介質(zhì)即可使溶膠聚沉,但各種電介質(zhì)的聚沉能力可用聚沉值來表達(dá),聚沉值是在一定期間內(nèi)使一升某濃度的溶膠產(chǎn)生聚沉所需電介質(zhì)的最小毫克分子數(shù)。顯然,聚沉值愈小,聚沉能力愈大,聚沉值從實驗中得出如下的價規(guī)則:①電介質(zhì)負(fù)離子對帶正電的溶膠起重要聚沉作用,正離子對帶負(fù)電的溶膠起重要聚沉作用。②同價離子聚沉能力幾乎相等,不同價離子的聚沉能力隨離子價增長而顯著增長。電解質(zhì)為什么能使溶膠聚沉呢？這是由于電解質(zhì)與膠粒帶相反電荷的離子的作用，中和了膠粒所帶的一部分電荷，使膠粒電量減少，擴散層縮小，溶劑化層變薄，而當(dāng)雙電層厚度縮至很小和溶劑化層變得很薄時，兩個膠粒間便可以更加接近即不產(chǎn)生斥力，兩個膠質(zhì)間因引力加大而合并的趨勢增強，甚至引力占絕對優(yōu)勢以致使膠粒聚結(jié)而發(fā)生聚沉。膠粒的雙電層結(jié)構(gòu)電圖3-3-1。（2）溫度對溶膠穩(wěn)定性的影響一般影響不大,當(dāng)溫度升高時,吸附能力減弱,溶劑化限度減少,溶劑化層變薄,膠粒聚結(jié),不穩(wěn)定性增長。（3）濃度對溶膠的穩(wěn)定性的影響濃度增大時,粒子間距離縮小,引力增長,容易聚結(jié)而發(fā)生聚沉,所以制備比較穩(wěn)定的溶膠,要有一定的合適濃度。圖3-1-1膠粒的雙電子層結(jié)構(gòu)示意圖三、膠體金的制備方法膠體金溶液的制備有許多種方法，其中最常用的是化學(xué)還原法，基本的原理是向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子。目前常用的還原劑有：白鱗、乙醇、過氧化氫、硼氫化鈉、抗壞血酸、枸椽酸鈉、鞣酸等，下面分別介紹制備不同大小顆粒的膠體金溶液。（一）制備膠體金的準(zhǔn)備1．玻璃器皿的清潔我們的經(jīng)驗是制備膠體金的所有玻璃器皿先用自來水把玻璃器皿上的灰塵流水沖洗干凈,加入清潔液浸泡24h,自來水洗凈清潔液,然后每個玻璃器皿用洗潔劑洗3-4次,自來水沖洗掉洗潔劑,用蒸餾水洗3-4次,再用雙蒸水把每個器皿洗3-4次,烤箱干燥后備用。2．試劑的配制規(guī)定(1)所有配制試劑的容器均按以上規(guī)定酸解決洗凈,配制試劑用雙蒸餾水或三蒸餾水。(2)氯化金(HAuCl4)水溶液的配制:將1g的氯化金置入棕色細(xì)口試劑瓶中溶解于雙蒸水中配成1%的水溶液。放在4℃冰箱內(nèi)保存長達(dá)幾個月至1年左右,仍保持穩(wěn)定。(3)白磷或黃磷乙醚溶液的配制:白磷在空氣中易燃燒,要格外心小操作。把白磷在雙蒸水中切成小塊,放在濾紙上吸干水份后,迅速放入已準(zhǔn)備好的乙醚中,輕輕搖動,等完全溶解后即得到飽和溶液。儲藏于棕色密閉瓶內(nèi),放在陰涼處保存。（二）制備膠體金的方法和環(huán)節(jié)1．白磷還原法（1）白磷還原法(ZSigmondy192023)1)取1%的HAuCl4水溶液1ml,加雙蒸水99ml配成0.01%的HAuCl4水溶液。2)用0.2mol/LK2CO3調(diào)pH至7.2。3)加熱煮沸,迅速加入0.5ml白磷的飽和乙醚溶液,振蕩數(shù)分鐘至溶液呈現(xiàn)橙紅色時即成。膠體金的顆粒直徑為3nm左右,大小較均勻。（2）白磷還原法(ZSigmondy1905及ZSigmondyThiessen1925)1)取0.6%的HAuCl4水溶液2.5ml,加雙蒸水120ml。2)用0.2mol/LK2CO3調(diào)pH至中性。3)加入1/5飽和度的白磷乙醚溶液1ml(1份白磷4份乙醚),在室溫振蕩約15min,溶液呈紅褐色,再加熱至典型的葡萄酒紅色,加熱可使乙醚蒸發(fā),膠體金液體內(nèi)過量的白磷通入空氣后被氧化,此方法獲得膠體金顆粒的直徑在5-12nm之間。（3）白磷還原法的改良法(Henegouwen1986)1)取20%飽和度白磷乙醚溶液0.5ml,加雙蒸水60ml。2)用1%的HAuCl4水溶液0.75ml,加0.1mol/LK2CO30.6ml,振蕩變成棕色。3)加熱煮沸,至溶液變成透明紅色。膠體金顆粒直徑為5.6nm。使用上述方法增長還原次數(shù)使金顆粒直徑不斷增大,兩者之間的關(guān)系見表3-3-1。表3-3-1膠體金顆粒大小與還原次數(shù)之間的關(guān)系還原次數(shù) 顆粒直徑(nm) 正負(fù)誤差1 5.6 0.92 6.7 0.93 7.9 0.94 9.8 1.35 12.0 1.02．抗壞血酸還原法(StathisandFabrikanos1958)(1)將在4℃預(yù)冷的1%HAuCl4水溶液1ml,0.2mol/LK2CO31.5ml、雙蒸水25ml混勻。(2)在攪拌下加入1ml0.7%抗壞血酸水溶液,立即呈現(xiàn)紫紅色。(3)加雙蒸水至100ml,加熱至溶液變?yōu)橥该骷t色為止。膠體金顆粒直徑為8-13nm。3．檸檬酸三鈉還原法(Frens1973)此方法是由Frens在1973年創(chuàng)建的,制備程序很簡樸,膠體金的顆粒大小較一致,廣為采用。該法一般先將0.01%的HAuCl4溶液加熱至沸騰,迅速加入一定量1%檸檬酸三鈉水溶液,開始有些藍(lán)色,然后淺藍(lán),藍(lán)色,再加熱出現(xiàn)紅色,煮沸7-10min出現(xiàn)透明的橙紅色。各種顆粒膠體金制備詳見表3-3-2。表3-3-2檸檬酸三鈉用量與膠體金顆粒直徑的關(guān)系0.01%HAuCl4 檸檬酸三鈉(ml)直徑(nm)100 5.0 10.0100 4.0 15.0100 1.5 25.0100 1.0 50.0100 0.75 60.0100 0.60 70.0100 0.42 98.0100 0.32 147.0100 0.25 160.04．鞣酸檸檬酸三鈉還原法(Slot與Gueeze1985年)該法是以1982年Muhplfordt法為基礎(chǔ),1985年Slot與Geuze對該法進(jìn)行了改良,特點是通過改變鞣酸的用量制備出多種顆粒直徑的膠體金,并且顆粒的直徑均勻一致,很適合于雙標(biāo)及多標(biāo)研究。制備3nm、5nm、10nm、15nm的膠體金顆粒見表3-3-3表3-3-3鞣酸檸檬酸三鈉還原法A液B液直徑(nm)1%檸檬酸內(nèi)0.1mol/LK2CO31%鞣酸H2O1%HAuCl4H2O(ml)(ml)(ml)(ml)(ml)(ml)3.3 4 0.2 4 11.8 1 795 4 0.2 0.715.117910 4 0.0250.115.87517915 40.00250.0115.987179操作環(huán)節(jié):(1)根據(jù)所需要的膠體金顆粒的大小分別配制A液和B液。(2)將配制好的A、B兩液在水浴鍋內(nèi)加熱到60℃,并通過控溫裝置使溫度保持穩(wěn)定。(3)在電磁攪拌A液迅速加入B液,繼續(xù)加熱直至膠體金變成葡萄酒色,時間大約7-10min。在A、B兩液混合后可見溶液立即變成藍(lán)色,大約1-3min就變成紅色。5．乙醇超聲波還原法(BaigentandMuller1980)(1)1%HAuCl4水溶液0.2ml加入100ml雙蒸水。(2)用0.2mol/LK2CO3調(diào)pH至中性,再加入1ml乙醇。(3)用20KC、135W超聲波探頭浸入溶液內(nèi)進(jìn)行超聲振蕩,由此法制得的膠體金顆粒為6-10nm。6．硼氫化鈉還原法(Tschoppetal1982)(1)將預(yù)冷在4℃的40ml雙蒸水中加入0.6ml1%的HAuCl4。(2)再加入0.2mol/LK2CO30.2ml。(3)在攪拌下,迅速加入新鮮配制的硼氫化鈉水溶液(0.5mg/ml)0.4ml,一般反復(fù)加入3-5次,直至溶液的蘭紫色變?yōu)槌燃t色為至。然后再攪拌5min,獲得的膠體金顆粒直徑在2-5nm之間。7．放射性膠體金的制備方法(KentandAllen1981)(1)取0.01%HAuCl4水溶液100ml,加熱至沸騰。(2)加入40μl195Au。(3)迅速加入4ml1%檸檬酸三鈉水溶液,5-7min出現(xiàn)透明的橙紅色。(4)其含量為1×106脈沖數(shù)/min。5nm膠體金顆粒（5萬倍）10nm膠體金顆粒（5萬倍）15nm膠體金顆粒（5萬倍）四、膠體金的質(zhì)量鑒定膠體金制備完畢后須經(jīng)電鏡下質(zhì)量鑒定才干使用。（一）膠體金顆粒直徑測定用預(yù)先解決好的覆有Formvar膜的鎳網(wǎng)浸入膠體金溶液內(nèi),取出放在空氣中干燥或37℃內(nèi)烤干。然后在透射電鏡下觀測,重要觀測金顆粒的大小,符合不符合所需要的顆粒直徑,金顆粒是否均勻一致,有無橢圓形及多角形金顆粒存在。抱負(fù)的金顆粒是大小基本相等的圓形,均勻一致,無橢圓形及多角形的金顆粒存在,還可以拍片放大后測量金顆粒直徑的大小。（二）膠體金顆粒均勻度測定一般需測量100個以上的膠體金顆粒,然后用記錄學(xué)解決,計算膠體金顆粒的平均直徑及標(biāo)準(zhǔn)差,前者反映顆粒的大小,后者說明顆粒是否均勻一致。（三）影響膠體金顆粒大小的因素假如有較多大小不等的金顆粒及有橢圓形,多角形金顆粒存在時應(yīng)重新制備。一般導(dǎo)致這種情況的重要因素是在加還原劑的時候不是迅速一次加入,而是多次加入。再者攪拌不均勻,速度太慢沒有攪拌起來,導(dǎo)致了顆粒大小不等。制備量的多少，容器的大小，加熱的時間等也影響膠體金顆粒大小。制備了合格的膠體金以后，放在室溫或4℃保存。避免低溫凍存，由于凍存可導(dǎo)致膠體金凝集，破壞了膠體狀態(tài)。膠體金在室溫避光無灰塵的環(huán)境中可放置3個月左右。4℃冰箱內(nèi)半年左右。根據(jù)膠體金的性質(zhì)，有不穩(wěn)定和聚沉的也許性，因此，制備完畢后最佳在20天內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記。五、膠體金標(biāo)記的準(zhǔn)備膠體金標(biāo)記蛋白的原理，一般認(rèn)為是由于pH值等于或稍偏堿的蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)呈電中性，此時蛋白質(zhì)分子與膠體金顆?；ハ嚅g的靜電作用較小，但蛋白質(zhì)分子的表面張力卻最大，處在一種薄弱的水化狀態(tài)，較易吸附于金顆粒的表面，由于蛋白分子牢固地結(jié)合金顆粒的表面，形成了一個蛋白層，阻止了膠體金顆粒的互相接觸，而使膠體金處在穩(wěn)定狀態(tài)。假如pH低蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)帶正電荷，膠體金帶負(fù)電荷，兩者極易靜電結(jié)合形成大的聚合物。假如pH高于蛋白質(zhì)等電點，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，與膠體金顆粒的負(fù)電荷互相排斥而不能互相結(jié)合。（一）待標(biāo)記蛋白質(zhì)的準(zhǔn)備1．透析除鹽:蛋白質(zhì)溶液內(nèi)應(yīng)除去多余的電解質(zhì),不然過高的鹽類物質(zhì)會減少膠體金顆粒的Zeta電位,影響蛋白質(zhì)的吸附,因此,標(biāo)記之前必須徹底除鹽。一般將蛋白質(zhì)置入透析袋中然后直接放入雙蒸水或極低濃度的鹽水(0.005mol/LNaCl,pH7.0)透析。2．去除蛋白質(zhì)中的沉淀:長期低溫保存的蛋白質(zhì)或4℃較長時間保存的抗體,特別是在濃度高于2mg/ml的情況下,很容易形成聚合物,聚合物對標(biāo)記過程及免疫金探針的穩(wěn)定性有一定影響,因此,標(biāo)記之前須離心以除去這些聚合物。一般以1000r/min4℃離心15min取上清液,調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至1mg/ml即可用于標(biāo)記。（二）膠體金pH值的調(diào)整膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否,取決于pH值,一般只有在蛋白質(zhì)等電點(PI)略偏堿的條件下兩者才干牢固地結(jié)合,因此,標(biāo)記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點略偏堿。需要提高膠體金的pH值時可用0.1mol/LK2CO3,需要減少膠體金的pH值時可用0.1NHCl。測定金溶液的pH也許損害pH測定計的探頭,因此,一般用精密的pH試紙測定其pH即可。常用標(biāo)記蛋白質(zhì)的膠體金pH值見表3-3-4。（三）待標(biāo)記蛋白質(zhì)最適穩(wěn)定的測定1．光電比色法:制備一系列不同濃度的等體積蛋白質(zhì)溶液(1ml),分別加入5ml膠體金中,迅速混勻,然后,各加入1ml10%NaCl溶液,搖勻,靜置5min后測各管的OD值。根據(jù)膠體金顆粒的大小,OD在520-580nm之間測定,以O(shè)D值為縱座標(biāo),蛋白質(zhì)用量為橫座標(biāo)作一曲線,取曲線最先與