基因工程的基本操作程序課件【核心素養(yǎng)提升+備課精講精研】 高二下學(xué)期生物人教版選修3

基因工程的基本操作程序轉(zhuǎn)基因食品是如何培育出來的呢？基因工程?。』蚬こ痰幕静僮鞒绦?、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取1.目的基因的概念：主要是

編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子3.目的基因的來源：可以從

分離出來，

也可以

4.目的基因的獲取方法：（1）

（2）

（3）

2.目的基因的結(jié)構(gòu)：啟動子RNA聚合酶結(jié)合位點基因非編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)mRNA蛋白質(zhì)(多肽鏈)起始密碼子終止密碼子DNA雙鏈終止子原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)注:非編碼區(qū)不編碼蛋白質(zhì)，但是調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游有RNA聚合酶結(jié)合位點(啟動子)。DNA雙鏈非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點前體mRNA蛋白質(zhì)(多肽鏈)基因外顯子內(nèi)含子成熟mRNA加工起始密碼子終止密碼子12341234注：外顯子數(shù)目=內(nèi)含子數(shù)目+1真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點編碼區(qū)是_____的，邊_________邊_________編碼區(qū)是間隔的、_____的，先_____后_____相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼轉(zhuǎn)錄翻譯轉(zhuǎn)錄翻譯

科學(xué)工作者分離得到了某原核生物基因，并將其解離成兩條單鏈。現(xiàn)讓其中一條鏈與由該基因轉(zhuǎn)錄而來的信使RNA雜交配對，結(jié)果如圖所示。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)mRNA基因的一條鏈ＡＢＣ真核生物基因的有關(guān)實驗成熟mRNA對應(yīng)基因的一條鏈編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)ＡＢＣ一、目的基因的獲取2.目的基因的結(jié)構(gòu)：編碼區(qū)非編碼區(qū)原核生物：編碼合成mRNA,進(jìn)而編碼蛋白質(zhì)的合成真核生物：外顯子：內(nèi)含子編碼成熟mRNA,進(jìn)而編碼蛋白質(zhì)的合成啟動子位置：功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄?；虻氖锥耍ㄒ欢斡刑厥饨Y(jié)構(gòu)的DNA片段）終止子位置：功能：位于基因的尾端（一段特殊的DNA片斷）終止mRNA的轉(zhuǎn)錄一、目的基因的獲取1.目的基因的概念：主要是

編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子3.目的基因的來源：可以從

分離出來，

也可以

4.目的基因的獲取方法：（1）

（2）

（3）

2.目的基因的結(jié)構(gòu)：自然界已有的物種中用人工的方法合成從基因文庫中獲取利用PCR技術(shù)擴增目的基因人工合成3.目的基因的獲取方法：（1）從基因文庫中獲取目的基因基因文庫概念

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫?；蛭膸斓姆N類部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫基因組文庫：含有一種生物的全部基因基因文庫的構(gòu)建對于真核生物，從基因文庫中選出的目的基因包含編碼區(qū)和非編碼區(qū)（啟動子和終止子）從cDNA文庫中選出的目的基因只包含編碼區(qū)的外顯子基因組文庫與cDNA文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫基因多少文庫大小啟動子內(nèi)含子物種間的基因交流某種生物部分基因某種生物全部基因小大無有無有可以部分基因可以

村長,為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物中提取不行嗎？？？

當(dāng)然行啊。構(gòu)建基因文庫只是獲取目的基因的方法之一。但是，有時我們完全不知道目的基因序列，或者想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道幾種生物之間有哪些基因不同，或者想知道一種生物在不同的發(fā)育階段都表達(dá)哪些基因，或者想得到一種生物的全部基因序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫。④構(gòu)建基因文庫的目的

基因文庫構(gòu)建好了，怎么從中得到我們所需的目的基因呢？？？

目前來說，這還是一件比較復(fù)雜的。事情，簡單的說就是根據(jù)目的基因的相關(guān)信息，如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，以及基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因⑤目的基因的獲取依據(jù)：3.目的基因的獲取方法：（1）從基因文庫中獲取目的基因（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因（已知目的基因的核苷酸序列且基因較大）①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制_______________________的核酸合成技術(shù)。②原理：______________________多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA雙鏈復(fù)制③前提條件：______________________條件：_________、______

_____、________________、

、

。熱穩(wěn)定DNA聚合酶模板DNA四種脫氧核苷酸有已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列形成引物。引物能量變性復(fù)性延伸利用PCR技術(shù)擴增目的基因使目的基因的片段在短時間大量合成④過程：變性：加熱至90～95℃目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈復(fù)性：冷卻至55～60℃引物與模板的單鏈DNA相應(yīng)互補序列結(jié)合延伸：加熱至70～75℃Taq酶從引物起始進(jìn)行互補鏈的合成⑥結(jié)果：⑤方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n925575℃3`5`5`3`Taq聚合酶引物1引物2原料模板DNA目的基因αβ925575℃變性3`5`5`3`αβ925575℃退火3`5`5`3`αβ引物1引物2925575℃延伸3`5`5`3`αβ引物1引物2925575℃變性925575℃退火αβ925575℃延伸925575℃變性925575℃退火925575℃延伸PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的比較比較項目細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋場所主要在細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞外(主要在PCR擴增儀內(nèi))酶解旋酶、DNA聚合酶等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件控制溫度，需在不同溫度下進(jìn)行結(jié)果合成整個DNA分子擴增特定的DNA片段或基因聯(lián)系①模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板②原料:均為四種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物開始進(jìn)行互補鏈的合成3.目的基因的獲取方法：（1）從基因文庫中獲取目的基因（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因（已知目的基因的核苷酸序列且基因較大）（3）通過DNA合成儀用化學(xué)方法人工合成（已知目的基因的核苷酸序列且基因較?。┩ㄟ^DNA合成儀用化學(xué)方法人工合成蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRNA核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因推測

當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。DNA合成儀推測合成方法

基因文庫的構(gòu)建PCR技術(shù)擴增人工合成基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）優(yōu)點操作簡單專一性可在短時間內(nèi)大量擴增目的基因?qū)Ｒ恍詮姡僧a(chǎn)生自然界中不存在的新基因缺點工作量大、盲目性大、專一性差操作過程較麻煩、技術(shù)要求過高需要嚴(yán)格控制溫度，技術(shù)要求高適用范圍小提取目的基因的方法與比較二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建單獨的DNA片段─目的基因是不能穩(wěn)定遺傳的。構(gòu)建表達(dá)載體的目的是為了使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用?！诵幕虮磉_(dá)載體的組成：啟動子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因+復(fù)制原點

注意①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵。③啟動子、終止子對于目的基因表達(dá)必不可少。④目的基因不能單獨進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶切割兩個切口獲得目的基因DNA連接酶連接重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個切口兩個黏性末端三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程，稱為受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)化。1、轉(zhuǎn)化：2、導(dǎo)入方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法（技術(shù)）——Ca2+處理法（感受態(tài)細(xì)胞法）（體細(xì)胞）（受精卵細(xì)胞）（大腸桿菌）（1）農(nóng)桿菌特點：農(nóng)桿菌是一種生活在土壤中的微生物，能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。Ti質(zhì)粒上T-DNA的特點：可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

當(dāng)植物受到損傷時，傷口處的細(xì)胞會分泌大量酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞，這時農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的DNA上，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。（2）過程：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色體DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法?；驑尫?-----單子葉植物

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體-DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。常用的金屬顆粒有______粒子和______粒子。這是__________植物中常用的一種基因轉(zhuǎn)化方法，但是成本較高。鎢粉金粉單子葉花粉管通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。目的基因

我國科學(xué)家獨創(chuàng)的方法，十分簡便經(jīng)濟，我國的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是采用的此方法。

受精卵2.受體細(xì)胞：胚胎早期培養(yǎng)將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞1.方法：

顯微注射技術(shù)（法）3.操作過程：提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到輸卵管或子宮受精卵發(fā)育新性狀動物原因：①個體大，易操作。②受精卵全能性高，易培養(yǎng)成完整個體顯微注射法是目前最有效的一種將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞的方法將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）受體細(xì)胞：原核生物

（原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少）

常用菌：大腸桿菌（3）過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA感受態(tài)細(xì)胞：一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)（2）方法：Ca2+處理法（感受態(tài)細(xì)胞法）

四、目的基因的檢測與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？

不一定，需要檢測四、目的基因的檢測與鑒定分子水平檢測個體生物學(xué)水平鑒定①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——方法——方法——DNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)抗原—抗體雜交抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗1、檢測——分子水平的檢測（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因工具：基因探針（指用放射性同位素等標(biāo)記的目的基因的DNA片段）方法——DNA分子雜交技術(shù)

這是目的基因能否在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。a.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；過程:b.在目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針；c.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交④結(jié)果:若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N變性變性目的基因DNA分子雜交分子雜交雜交帶變性探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA1、檢測——分子水平的檢測（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法——分子雜交技術(shù)

這是檢測目的基因能否發(fā)揮功能作用的第一步。提取

轉(zhuǎn)基因生物的mRNA與

探針雜交過程:結(jié)果:若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。目的基因DNA分子雜交分子雜交雜交帶（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交1、檢測——分子水平的檢測方法——過程:結(jié)果:提取

轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì)

與

抗體雜交若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。一個抗蟲或抗病的基因?qū)胫参锛?xì)胞后是否賦予了植物抗蟲或者抗病的特性呢？需要進(jìn)行個體生物水平的鑒定。沒有抗蟲基因的棉植株有抗蟲基因的棉植株接種棉鈴蟲蟲沒有死蟲被殺死沒有表達(dá)目的基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因生物檢測方法觀察指標(biāo)抗蟲植物害蟲吞食害蟲死亡抗病毒(菌)植物病毒(菌)感染未侵染上病斑抗鹽植物鹽水澆灌正常生長抗除草劑植物噴灑除草劑正常生長獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較細(xì)胞產(chǎn)物功能活性正常常見轉(zhuǎn)基因生物在個體水平上鑒定、檢測的方法（列舉如下表）類型步驟檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子檢測第一步目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞DNA分子雜交技術(shù)（DNA和DNA之間）是否成功顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術(shù)（DNA和mRNA之間）是否成功顯示出雜交帶第三步目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交是否成功顯示出雜交帶個體水平鑒定

包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是否相同等。獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（植物）、顯微注射法（動物）、感受態(tài)細(xì)胞法（微生物）目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯1、有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）