GFP融合蛋白進行蛋白質(zhì)亞細胞定位

本節(jié)課的主要內(nèi)容蛋白質(zhì)定位綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白融合蛋白的構建綠色熒光蛋白融合蛋白的檢測其它熒光蛋白簡介第一頁，共24頁。蛋白質(zhì)定位真核細胞具有復雜的亞細胞結構。每種細胞器都有一組特定的蛋白。真核細胞除葉綠體，線粒體能少量合成蛋白外，絕大部分蛋白是在胞漿或糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，最終運至不同地點，形成成熟的蛋白質(zhì)并行使功能。譯產(chǎn)物中很大一部分是以前體蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信號，可引導蛋白質(zhì)在胞內(nèi)定位。蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的定位問題，是細胞生物學研究的中心問題，也是分子生物學研究的熱門話題。理解某些蛋白質(zhì)的定位從而分析探索其生物學功能，意義重大。第二頁，共24頁。蛋白質(zhì)定位蛋白質(zhì)的亞細胞定位常用方法：蔗糖密度梯度離心；免疫膠體金標記；免疫熒光；與GFP構建融合基因表達融合蛋白；多糖序列分析等。第三頁，共24頁。綠色熒光蛋白

(greenfluorescentprotein，GFP)2008年諾貝爾化學獎GFP的結構特點GFP的發(fā)光機理GFP的熒光特性GFP的優(yōu)點GFP的改進GFP的應用第四頁，共24頁。2008年諾貝爾化學獎日裔美國科學家下村修美國科學家馬丁·查爾非美國華裔科學家錢永健諾貝爾獎委員會將化學獎授予美籍日裔科學家下村修、美國科學家馬丁·沙爾菲和美籍華裔科學家錢永健三人，以表彰他們發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了綠色熒光蛋白質(zhì)技術。第五頁，共24頁。2008年諾貝爾化學獎下村修：于1962年在水母Aequoreavictoria發(fā)現(xiàn)并分離得到GFP，并發(fā)現(xiàn)該蛋白在紫外線下會發(fā)出明亮的綠色。馬丁·查爾菲

：證明了GFP作為多種生物學現(xiàn)象的發(fā)光遺傳標記的價值，這一技術被廣泛運用于生理學和醫(yī)學等領域。錢永?。鹤屓藗兝斫饬薌FP發(fā)出熒光的機制。同時拓展出綠色之外的可用于標記的其他顏色，使得同一時刻跟蹤多個不同的生物學過程成為現(xiàn)實。第六頁，共24頁。GFP的結構特點一級結構GFP由238個氨基酸殘基組成,分子量為26.9kDGFP的生色團位于氨基酸序列64~69位GFP的第65、66、67位氨基酸分別是絲氨酸、脫氫酪氨酸、甘氨酸，為構成GFP生色團的核心第七頁，共24頁。GFP的結構特點空間結構特點：由11條β桶狀結構(β-barrel)繞成的一個圓柱體，直徑約3nm，長約4nm。一條α螺旋纏繞在圓柱體的軸位置生色團附著在α螺旋上，幾乎完美地包埋于圓柱體中心這種方式被稱為β罐(β-can)晶體結構第八頁，共24頁。GFP的發(fā)光機理GFP的生色團是GFP發(fā)出熒光的物質(zhì)基礎。實質(zhì)：由第65、66、67位的絲氨酸—脫水酪氨酸—甘氨酸形成對羥苯甲基咪唑環(huán)酮第九頁，共24頁。GFP的熒光特性GFP的最大吸收峰為395nm(紫外)，并有一個479nm的副峰(藍光)；發(fā)射光譜最大峰值為509nm(綠光)盡管450～490nm(藍光)是GFP的副吸收峰，但由于長波能量低，細胞忍受能力強，因此更適合于活體檢測。第十頁，共24頁。GFP的熒光特性GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似，因此為熒光素FITC設計的熒光顯微鏡濾光片組合同樣適用于GFP觀察。

GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下的抗光漂白能力比熒光素強，特別在450～490nm藍光波長下更穩(wěn)定。GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问剑坏┲匦卤┞对诳諝饣蜓鯕庵?，GFP熒光便立即得到恢復。而一些弱還原劑并不影響GFP熒光。中度氧化劑對GFP熒光影響也不大，如生物材料的固定、脫水劑戊二酸或甲醛等。第十一頁，共24頁。GFP的熒光特性

通過對GFP的結構和生化特性進行改造，已獲得許多具有不同發(fā)射峰和激發(fā)峰的突變體，使GFP的熒光強度和作為報告基因的檢測靈敏度大大提高。項目激發(fā)峰發(fā)射峰野生型（wt-GFP）紅移突變體RSGFP黃綠突變體YGFP藍色突變體BFP增強型突變體OGFP半衰期短的突變體395471-490513385385488509502-511527445510507GFP及其主要突變體的熒光特征nm第十二頁，共24頁。GFP的優(yōu)點易于檢測熒光穩(wěn)定無毒害通用性易于構建載體可進行活細胞定時定位觀察易于得到突變體第十三頁，共24頁。GFP的改進

盡管GFP作為報告基因或分子探針有許多無可比擬的優(yōu)點，但是野生型GFP（wtGFP）具有一定的缺點：GFP有兩個激發(fā)峰影響了其特異性，并且長波激發(fā)峰強度較小，不易觀察GFP合成及折疊產(chǎn)生熒光的過程慢，蛋白質(zhì)折疊受溫度影響大，表達量較低GFP在某些植物細胞中并不表達第十四頁，共24頁。GFP的改進除去GFP基因中隱蔽型內(nèi)含子消除編碼蛋白的積累將GFP定位到特定細胞器中改變堿基組分更換GFP生色團氨基酸插入植物內(nèi)含子增加增強子和更換強啟動子

第十五頁，共24頁。GFP的應用蛋白質(zhì)定位作為報告基因藥物篩選融合抗體生物傳感器其他方面第十六頁，共24頁。GFP融合蛋白的構建

應用亞克隆技術，將目的基因與GFP基因構成融合基因，通過愈傷組織轉(zhuǎn)化法、基因槍、顯微注射、電激轉(zhuǎn)化等方法轉(zhuǎn)化到合適的細胞，利用目的基因的基因表達調(diào)控機制，如啟動子和信號序列來控制融合基因的表達，最終得到融合蛋白，可以研究目的蛋白的定位。目的基因gfp基因融合基因轉(zhuǎn)化表達檢測第十七頁，共24頁。GFP融合蛋白的構建最關鍵的就是：要盡可能的不影響目的蛋白的定位和功能。具體蛋白要具體分析。將目的基因與gfp基因融合有以下幾種方式:將gfp置于目的基因后面，即目的基因-gfp將gfp置于目的基因前面，即gfp-目的基因。第十八頁，共24頁。GFP融合蛋白的構建注意事項：兩個基因之間用Linker連接。在兩個基因交接處可以增加一段核苷酸(3的倍數(shù))，如增加幾個為甘氨酸或賴氨酸等編碼的三核苷酸。目的是使得兩個基因的蛋白產(chǎn)物的空間結構相互影響較小，有利于GFP發(fā)光。前一基因必須要有起始密碼，而不能帶有終止密碼；后一基因要保證有終止密碼。構建了融合基因后，必須測序進行驗證，確保融合基因讀框正確之后才能進行后續(xù)研究，以免浪費人力、物力和寶貴的時間。第十九頁，共24頁。GFP融合蛋白的檢測定性檢測：可以用常規(guī)的落射熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡觀察；

定量檢測：免疫印跡法酶聯(lián)免疫吸附法可以在活細胞中進行圖像分析，也可以檢測固定細胞中的GFP。第二十頁，共24頁。GFP融合蛋白的檢測注意事項：以gfp作為報告基因研究蛋白亞細胞定位，必須做對照。由于某些細胞本身也有自發(fā)熒光，必須識別自發(fā)熒光與GFP的綠色熒光，以免假象干擾實驗，避免得出錯誤結論。并不是所有的構建正確的融合基因都能正常表達，因此要盡可能多的獲得轉(zhuǎn)基因細胞，如果數(shù)目較少，可能會檢測不到熒光。第二十一頁，共24頁。其它熒光蛋白簡介根據(jù)發(fā)射光譜，熒光蛋白有以下類型，幾乎跨越整個可見光譜。BFPs440–470nmCFPs471–500nmGFPs501–520nmYFPs521–550nmOFPs551–575nmRFPs576–610nmFRFPs611–660nm第二十二頁，共24頁。參考文獻[1]崔志芳,鄒玉紅,季愛云.綠色熒光蛋白研究三個里程碑—2008年諾貝爾化學獎簡[J].ChineseJouralofNature,2008,30(6):324—328.[2]徐飛虎,龔興國.綠色熒光蛋白應用研究進展[J].細胞生物學雜志,2002,24(6):332—334.[3]岳莉莉,齊義鵬.綠色熒光蛋白—現(xiàn)代細胞生物學與分子生物學研究領域的新標記物[J].生物工程進展,1997,17(4):40—45[4]張敬之,郭歆冰,謝書陽等.用慢病毒載體介導產(chǎn)生綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠[J].自然科學,2006,16(5):571—577[5]ElenaPopova,BritRentzsch,MichaelBader.

GenerationandcharacterizationofaGFPtransgenicratlineforembryologicalre