基因、分子生物學(xué)課件

7基因的表達與調(diào)控(上)——原核基因表達調(diào)控模式

原核生物具有根據(jù)環(huán)境條件改變合成不同蛋白質(zhì)的能力，從而使代謝過程適應(yīng)環(huán)境的變化，維持自身的生存和繁衍。自然選擇傾向于保留高效率的生命過程。在每30分鐘增殖一次的109細菌群體中，若一個細菌變成29.5分鐘增殖，經(jīng)過80天的連續(xù)生長后，這個群體中的99.9%都將具有29.5分鐘增殖一倍的生長速度。原核生物細胞的基因和蛋白質(zhì)種類較少。如大腸桿菌基因組約為4.60×106bp共有4288個開放讀碼框。據(jù)估計，一個細胞中總共含有107個蛋白質(zhì)分子。但不是每種蛋白分子都呈平均表達。例子如，每個大腸桿菌細胞有約15000個核糖體，50種核糖體蛋白、糖酵解體系的酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代謝過程中必需的，其合成速率不受環(huán)境變化或代謝狀態(tài)的影響，這一類蛋白質(zhì)被稱為永久型（constitutive）合成的蛋白質(zhì)。

另一類則被稱為適應(yīng)型或調(diào)節(jié)型（adaptiveorregulated），因為這類蛋白質(zhì)的合成速率明顯地受環(huán)境的影響而改變。如大腸桿菌細胞中一般只有15個β-半乳糖苷酶，但若將細胞培養(yǎng)在只含乳糖的培養(yǎng)基中，每細胞中這個酶的量可高達幾萬個分子。因此，原核生物的某些蛋白表達存在開關(guān)機制。這種機制主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上。即原核生物的某些基因表達是受到調(diào)控的。6.1原核基因表達調(diào)控總論隨著生物個體的發(fā)育，DNA分子能有序地將其所承載的遺傳信息，通過密碼子-反密碼子系統(tǒng)轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)，執(zhí)行各種生理生化功能?？茖W(xué)家把從DNA到蛋白質(zhì)的過程稱為基因表達（geneexpression），對這個過程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達調(diào)控（generegulation或genecontrol）。

圖7-1基因表達的第一步是由RNA聚合酶拷貝DNA雙鏈中的模板鏈，生成與該序列完全互補的RNA鏈。

基因表達調(diào)控主要表現(xiàn)在以下二方面：轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控（transcriptionalregulation）；轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控（post-transcriptionalregulation），包括（1）mRNA加工成熟水平調(diào)控（differentialprocessingofRNAtranscript）；（2）翻譯水平調(diào)控（differentialtranslationofmRNA）。

原核生物：營養(yǎng)狀況和環(huán)境因素對基因表達起著舉足輕重的作用。

真核生物特別是高等真核生物：激素水平和發(fā)育階段是基因表達調(diào)控的最主要手段，而營養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下降。

基因調(diào)控指揮系統(tǒng)的多樣化

細菌的轉(zhuǎn)錄與翻譯過程幾乎發(fā)生在同一時間間隔內(nèi)，轉(zhuǎn)錄與翻譯相耦聯(lián)（coupledtranscriptionandtranslation）

真核生物中，原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（primarytranscript）只有從核內(nèi)運轉(zhuǎn)到核外，才能被核糖體翻譯成蛋白質(zhì)（圖7-2）。

原核基因調(diào)控機制的類型和特點

原核生物的基因調(diào)控主要是轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括負轉(zhuǎn)錄調(diào)控和正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在負轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白（repressor），阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。根據(jù)其作用特征又分為負控誘導(dǎo)和負控阻遏二大類。在負控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，（活性）阻遏蛋白不與效應(yīng)物（誘導(dǎo)物）結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄；在負控阻遏系統(tǒng)中，（非活性）阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。阻遏蛋白作用于操縱區(qū)。在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator）。根據(jù)其作用特性分為正控誘導(dǎo)系統(tǒng)和正控阻遏系統(tǒng)。在正控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子（誘導(dǎo)物）的存在使（非活性）激活蛋白處于活性狀態(tài)；在正控阻遏系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子的存在使（活性）激活蛋白處于非活性狀態(tài)。圖7-3細菌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控體系。a.負控誘導(dǎo)系統(tǒng)；b.正控誘導(dǎo)系統(tǒng)；c.負控阻遏系統(tǒng)；d.正控阻遏系統(tǒng)。

參與大腸桿菌基因表達調(diào)控最常見的蛋白質(zhì)可能是σ因子。除σ54

，

σ因子在結(jié)構(gòu)上具有同源性，統(tǒng)稱σ70為家族，含有4個保守區(qū)（圖7-4），其中第2個和第4個保守區(qū)參與結(jié)合啟動區(qū)DNA，第2個保守區(qū)的另一部分還參與雙鏈DNA解開成單鏈的過程。圖7-4大腸桿菌中的б因子（以б70為例）主要包括四個結(jié)構(gòu)域。

σ54因子識別并與DNA上的-24和-12區(qū)相結(jié)合（圖6-5）。

σ70啟動子只有在核心酶結(jié)合到DNA鏈上之后才能與啟動子區(qū)相結(jié)合，而σ54則類似于真核生物的TATA區(qū)結(jié)合蛋白（TBP），可以在無核心酶時獨立結(jié)合到啟動子上。圖6-5σ70（上）和σ54（下）

因子識別并結(jié)合在所調(diào)控基因上游的不同區(qū)域?？烧T導(dǎo)調(diào)節(jié)：

指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鞯臓顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導(dǎo)下使基因活化?！烧T導(dǎo)酶，誘導(dǎo)物可阻遏調(diào)節(jié)：這類基因平時都是開啟的，處在蛋白質(zhì)或酶的工作過程中，由于一些特殊的代謝物或化合物的積累而將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達?！勺瓒裘?，阻遏物原核基因調(diào)控的主要特點（1）弱化子對基因活性的影響（2）降解物對基因活性的影響：當(dāng)葡萄糖存在時，在培養(yǎng)基中加入乳糖，乳糖操縱子也不啟動，這是因為萄萄糖的降解物對其具有抑制作用。（3）細菌的應(yīng)急反應(yīng)7.2乳糖操縱子與負控誘導(dǎo)系統(tǒng)大腸桿菌乳糖操縱子（lactoseoperon）包括3個結(jié)構(gòu)基因：Z、Y和A，以及啟動子、控制子和阻遏子等，如圖所示。轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是在啟動區(qū)和操縱區(qū)進行的。

3個結(jié)構(gòu)基因各決定一種酶：Z編碼-半乳糖苷酶；Y編碼-半乳糖苷透過酶；A編碼-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶。β-半乳糖苷酶是一種β-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透過酶的作用是使外界的β-半乳糖苷透過大腸桿菌細胞壁和原生質(zhì)膜進入細胞內(nèi)。β-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶的作用是把乙酰輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。7.2.1酶的誘導(dǎo)—lac體系受調(diào)控的證據(jù)一般情況下，lac+基因型大腸桿菌細胞內(nèi)-半乳糖苷酶和透過酶的濃度很低，每個細胞只有1～2個酶分子。但是，在乳糖培養(yǎng)基上酶的濃度很快達到細胞總蛋白量的6%或7%，超過105個酶分子/細胞。在無葡萄糖、有乳糖的培養(yǎng)基中，lac+細菌中將同時合成-半乳糖苷酶和透過酶。用32P標(biāo)記的mRNA與模板DNA進行定量分子雜交，表明培養(yǎng)基中加入乳糖1～2分鐘后，編碼-半乳糖苷酶和透過酶的lacmRNA量就迅速增加，去掉乳糖后，lacmRNA量立即下降。

實驗室常用兩種乳糖類似物—異丙基巰基半乳糖苷（IPTG）和巰甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用發(fā)色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。因為它們都不是半乳糖苷酶的底物，所以又稱為安慰性誘導(dǎo)物（gratuitousinducer）。

7.2.2操縱子模型及其影響因子

Jacob和Monod認為誘導(dǎo)酶（他們當(dāng)時稱為適應(yīng)酶）現(xiàn)象是個基因調(diào)控問題，而且可以用實驗方法進行研究，他們通過大量實驗及分析，建立了現(xiàn)在已經(jīng)被人們廣泛接受的乳糖操縱子的控制模型。圖7-9Lac操縱子的調(diào)控模式。

Z、Y、A基因產(chǎn)物由同一條多順反子mRNA分子所編碼。B.該mRNA分子的啟動區(qū)（P）位于阻遏基因（I）與操縱區(qū)（O）之間，不能單獨起始半乳糖苷酶和透過酶基因的高效表達。C.操縱區(qū)是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結(jié)合位點。D.當(dāng)阻遏物與操縱區(qū)相結(jié)合時，lacmRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制。E.誘導(dǎo)物通過與阻遏物結(jié)合，改變其三維構(gòu)象，使之不能與操縱區(qū)相結(jié)合，誘發(fā)lacmRNA的合成。乳糖操縱子的控制模型主要內(nèi)容lac操縱子本底水平的表達lac操縱子本底水平的表達是必須的。為什么？大約每個世代中有1-5個mRNA分子。大腸桿菌對乳糖的反應(yīng)酶的合成是受到乳糖的誘導(dǎo)的。圖7-10培養(yǎng)基中有無誘導(dǎo)物對LacmRNA及β-半乳糖苷酶活性的影響

阻遏物lacI基因產(chǎn)物及功能lac操縱子阻遏物mRNA是由弱啟動子控制下永久型合成的，該阻遏蛋白有4個相同的亞基，每個亞基均含有347個氨基酸殘基，并能與1分子IPTG結(jié)合,每個細胞中有5～10個阻遏物分子。

β-半乳糖苷酶在乳糖代謝中的作用是把前者分解成葡萄糖及半乳糖。如果將葡萄糖和乳糖同時加入培養(yǎng)基中，大腸桿菌在耗盡外源葡萄糖之前不會誘發(fā)lac操縱子（圖7-11）。葡萄糖對lac操縱子的影響

為什么大腸桿菌在耗盡外源葡萄糖之前不會誘發(fā)lac操縱子？cAMP與代謝物激活蛋白將細菌放在含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，cAMP的濃度就低；如果培養(yǎng)基中只有甘油或乳糖等不進行糖酵解途徑的碳源，cAMP的濃度就會很高。

cAMP是在腺苷酸環(huán)化酶的作用下由ATP轉(zhuǎn)變而來的，在真核生物的激素調(diào)節(jié)過程中也起著十分重要的作用。

大腸桿菌中的代謝物激活蛋白(CRP)，由Crp基因編碼，能與cAMP形成復(fù)合物。CRP和cAMP都是合成lacmRNA所必需的，cAMP-CRP是一個不同于阻遏物的正調(diào)控因子，而lac操縱子的功能是在阻遏物和cAMP-CRP這兩個相互獨立的調(diào)控體系作用下實現(xiàn)的。半乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、山梨醇等在降解過程中均轉(zhuǎn)化成葡萄糖或糖酵解途徑中的其他中間產(chǎn)物，這些糖代謝中有關(guān)的酶都是由可誘導(dǎo)操縱子控制的，被稱為降解物敏感型操縱子(catabolitesensitiveoperon），由cAMP-CRP調(diào)控。圖7-13gal，lac和ara操縱子上游啟動子區(qū)與CRP-cAMP結(jié)合位點的相對位置分析

圖7-14大腸桿菌lac操縱子啟動區(qū)CRP-cAMPx結(jié)合位點及-35區(qū)，-10區(qū)序列分析。

cAMP-CRP復(fù)合物與啟動子區(qū)的結(jié)合是lacmRNA合成起始所必需的，因為這個復(fù)合物結(jié)合于啟動子上游，能使DNA雙螺旋發(fā)生彎曲，有利于形成穩(wěn)定的開放型啟動子-RNA聚合酶結(jié)構(gòu)。阻遏物則是一個抗解鏈蛋白，阻止形成開放結(jié)構(gòu)，從而抑制RNA聚合酶的功能。

圖6-15CRP-cAMP與上游DNA位點結(jié)合后造成模板DNA沿對稱序列中央發(fā)生>90°的彎曲

7.2.3lac操縱子的調(diào)控區(qū)域—P、O區(qū)

P區(qū)（即啟動子區(qū)）一般是從I基因結(jié)束到mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點下游5-10bp，而O區(qū)（即阻遏物結(jié)合區(qū)）位于-7～+28位，該區(qū)的堿基序列有對稱性，其對稱軸在+11位堿基對。圖7-16不同操縱子啟動區(qū)及O區(qū)相對位置的比較。

7.2.4lac操縱子中的其他問題1、A基因及其生理功能A基因：編碼-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶。該酶不參與乳糖的代謝。該酶作用：將某些能形成有害產(chǎn)物的半乳糖苷分子乙?；?，使之不能被-半乳糖苷酶降解。2、lac基因產(chǎn)物數(shù)量上的比較在完全被誘導(dǎo)的細胞中，β-半乳糖苷酶、透過酶及乙?；D(zhuǎn)移酶的拷貝數(shù)比例為1：0.5：0.2，這個比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作為唯一碳源時細胞的需要。為什么三種酶拷貝數(shù)不一樣？不同的酶在數(shù)量上的差異是由于在翻譯水平上受到調(diào)節(jié)所致：（1）lacmRNA與翻譯過程中核糖體脫離，終止翻譯，形成從mRNA從5’到3’的蛋白質(zhì)合成梯度；（2）lacmRNA中，A基因比Z基因更易降解。3、lac操縱子的融合與基因工程

lac操縱子的啟動子是強啟動子，可將其應(yīng)用于基因工程。7.3色氨酸操縱子與負控阻遏系統(tǒng)trp體系參與生物合成，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的調(diào)控。色氨酸的合成主要分5步完成，有7個基因參與整個合成過程（圖7-17）。圖7-17細菌中色氨酸生物合成途徑

trpE和trpG編碼鄰氨基苯甲酸合酶，trpD編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，trpF編碼異構(gòu)酶，trpC編碼吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB則分別編碼色氨酸合酶的α和β亞基。在許多細菌中，trpE和trpG，trpC和trpB分別融合成一個基因，產(chǎn)生具有雙重功能的蛋白質(zhì)。

trpE基因是第一個被翻譯的基因，與trpE緊鄰的是啟動子區(qū)和操縱區(qū)。前導(dǎo)區(qū)和弱化子區(qū)分別定名為trpL和trpa。

trp操縱子中產(chǎn)生阻遏物的基因是trpR，該基因距trp基因簇很遠。其間還有一個trpS（色氨酸t(yī)RNA合成酶），它與攜帶有色氨酸的tRNATrp共同參與trp操縱子的調(diào)控作用。

trp操縱子的轉(zhuǎn)當(dāng)調(diào)控包括阻遏系統(tǒng)和弱化系統(tǒng)。7.3.1trp操縱子的阻遏系統(tǒng)trpR基因突變常引起trpmRNA的永久型合成，該基因產(chǎn)物因此被稱為輔阻遏蛋白（aporepressor）。除非培養(yǎng)基中有色氨酸，否則這個輔阻遏蛋白不會與操縱區(qū)結(jié)合。輔阻遏蛋白與色氨酸相結(jié)合形成有活性的阻遏物，與操縱區(qū)結(jié)合并關(guān)閉trpmRNA轉(zhuǎn)錄。

效應(yīng)物分子色氨酸是trp操縱子所編碼的生物合成途徑的末端終產(chǎn)物。當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸含量較高時，它與游離的輔阻遏蛋白相結(jié)合，并使之與操縱區(qū)DNA緊密結(jié)合；當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸供應(yīng)不足時，輔阻遏物失去色氨酸并從操縱區(qū)上解離，trp操縱子去阻遏。7.3.2弱化子與前導(dǎo)肽1、弱化子在trpmRNA5’端有一個長162bp的mRNA片段被稱為前導(dǎo)區(qū)，其中123～150位堿基序列如果缺失，trp基因表達可提高6-10倍。mRNA合成起始以后，只要培養(yǎng)基中含有色氨酸，轉(zhuǎn)錄總是在這個區(qū)域終止，產(chǎn)生一個僅有140個核苷酸的RNA分子，這個區(qū)域被稱為弱化子，該區(qū)mRNA可通過自我配對形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。

2、前導(dǎo)肽分析前導(dǎo)序列發(fā)現(xiàn)，它包括起始密碼子AUG和終止密碼子UGA，能產(chǎn)生一個含有14個氨基酸的多肽，這個假設(shè)的多肽被稱為前導(dǎo)肽。在前導(dǎo)序列的第10和第11位上有相鄰的兩個色氨酸密碼子。組氨酸操縱子含有7個相鄰的組氨酸密碼子，苯丙氨酸操縱子也有7個苯丙氨酸密碼子，這些密碼子參與了操縱子中的轉(zhuǎn)錄弱化機制。3、mRNA前導(dǎo)區(qū)的序列分析

trp前導(dǎo)區(qū)的堿基序列已經(jīng)全部測定，引人注目的是其中4個分別以1、2、3和4表示的片段能以兩種不同的方式進行堿基配對，有時以1-2和3-4配對，有時只以2-3方式互補配對。

RNaseT1降解實驗（此酶不能水解配對的RNA）表明，純化的trp前導(dǎo)序列中確有1-2和3-4的配對方式，由此定位的3-4配對區(qū)正好位于終止密碼子的識別區(qū)，當(dāng)這個區(qū)域發(fā)生破壞自我配對的堿基突變時有利于轉(zhuǎn)錄的繼續(xù)進行（圖7-23）。

4、轉(zhuǎn)錄弱化作用培養(yǎng)基中色氨酸濃度低，負載有色氨酸的tRNATrp就少，翻譯通過兩個相鄰色氨酸密碼子的速度就慢，當(dāng)4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時，核糖體才進行到1區(qū)（或停留在兩個相鄰的trp密碼子處），前導(dǎo)區(qū)2-3配對，不形成3-4配對的終止結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進行。培養(yǎng)基中色氨酸濃度高，核糖體順利通過兩個相鄰的色氨酸密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前就到達2區(qū)，3-4區(qū)自由配對形成莖-環(huán)狀終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止。所以，弱化子對RNA聚合酶的影響依賴于前導(dǎo)肽翻譯中核糖體所處的位置。圖7-24trp操縱子前導(dǎo)序列的變構(gòu)與轉(zhuǎn)錄的弱化。一般認為，阻遏物從有活性向無活性的轉(zhuǎn)變速度較慢，需要有一個能更快地做出反應(yīng)的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)纳彼崴?。弱化子能較快地通過終止的方法來停止trp基因表達。

那么，為什么還要有阻遏體系呢？阻遏物的作用是在有大量外源色氨酸存在時，阻止非必需的先導(dǎo)mRNA的合成，它使這個合成系統(tǒng)更加經(jīng)濟。7.4其他操縱子7.4.1半乳糖操縱子大腸桿菌半乳糖操縱子（galactoseoperon）包括3個結(jié)構(gòu)基因：異構(gòu)酶（UDP-galactose-4-epimerase，galE），半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)移酶（galactosetransferase，galT），半乳糖激酶（galactosekinase，galK），最終使半乳糖變成葡萄糖-1-磷酸。半乳糖操縱子的調(diào)節(jié)基因是galR。與lac操縱子所不同的是，galR與galE、T、K及操縱區(qū)O等的距離都很遠，而galR產(chǎn)物對galO的作用與lacI-lacO的作用相同。gal操縱子的誘導(dǎo)物主要是半乳糖。

gal操縱子有兩個特點：①它有兩個啟動子，其mRNA可從兩個不同的起始點開始轉(zhuǎn)錄；②它有兩個O區(qū)，一個在P區(qū)上游-67～-73，另一個在結(jié)構(gòu)基因galE內(nèi)部。

1、cAMP-CRP對gal啟動子的作用有些細菌株能在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中高水平合成半乳糖代謝酶類（gal結(jié)構(gòu)基因高效表達），在另一類細菌株中，沒有葡萄糖，gal基因不表達。在gal操縱子P-O區(qū)有兩個相距僅為5bp的啟動子，gal操縱子可以從兩個啟動子分別起始基因轉(zhuǎn)錄，每個啟動子擁有各自的RNA聚合酶結(jié)合位點S1和S2。

從S1起始的轉(zhuǎn)錄只有在無葡萄糖時才能順利進行，RNA聚合酶與S1的結(jié)合需要半乳糖、CRP和較高濃度的cAMP。當(dāng)腺苷環(huán)化酶突變（cya-）或cAMP受體蛋白突變（crp-）時，gal操縱子不能從S1起始轉(zhuǎn)錄。當(dāng)有cAMP-CRP時，轉(zhuǎn)錄從S1開始；當(dāng)無cAMP-CRP時，轉(zhuǎn)錄從S2開始。從S2起始的轉(zhuǎn)錄完全依賴于葡萄糖，高水平的cAMP-CRP能抑制該啟動子的轉(zhuǎn)錄。2、雙啟動子的生理功能為什么gal操縱子需要兩個轉(zhuǎn)錄起始位點呢？因為半乳糖不僅可以作為唯一碳源供細胞生長，而且與之相關(guān)的物質(zhì)——尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大腸桿菌細胞壁合成的前體，細胞必須隨時合成差向異構(gòu)酶，以保證尿苷二磷酸的供應(yīng)。在沒有外源半乳糖的情況下，細胞通過半乳糖差向異構(gòu)酶（galactoseepimerase，galE基因產(chǎn)物）的作用由UDP-葡萄糖合成UDPgal。如果只有S1一個啟動子，由于這個啟動子的活性依賴于cAMP-CRP，當(dāng)培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時就不能合成異構(gòu)酶。如果S2是唯一的啟動子，那么，即使有葡萄糖存在，半乳糖也將使操縱子處于充分誘導(dǎo)狀態(tài)，能量被浪費。7.4.2阿拉伯糖操縱子

araB、araA和araD基因參與阿拉伯糖的降解，它們是一個基因簇，簡寫為araBAD。araB基因編碼核酮糖激酶，araA編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，araD編碼L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶。araE和araF負責(zé)將阿拉伯糖運入細胞內(nèi)，它們位于遠離這個基因簇的地方，分別編碼一個膜蛋白和一個位于細胞壁與細胞膜之間的阿拉伯糖結(jié)合蛋白。

araBAD具有復(fù)合啟動子區(qū)域，兩個操縱區(qū)（O1，O2）和一個調(diào)節(jié)基因araC。在lac和gal操縱子中，阻遏蛋白只能作為負調(diào)節(jié)因子，而cAMP-CRP蛋白只能是正調(diào)節(jié)因子。AraC蛋白同時顯示正、負調(diào)節(jié)因子的功能。

araBAD和araC基因的轉(zhuǎn)錄是分別在兩條鏈上以相反的方向進行的，araBAD基因簇從啟動子PBAD開始向右進行轉(zhuǎn)錄，而araC基因則是從Pc向左轉(zhuǎn)錄（圖7-27）。圖7-29ara操縱子上游調(diào)控區(qū)序列與功能分析

ara操縱子也是可誘導(dǎo)的，阿拉伯糖本身就是誘導(dǎo)物。在野生型操縱子中，只有阿拉伯糖存在時才轉(zhuǎn)錄出araBADmRNA，而有葡萄糖存在時則不轉(zhuǎn)錄。腺苷酸環(huán)化酶缺陷型和crp-突變株也不形成araBADmRNA，說明從PBAD起始的轉(zhuǎn)錄過程也需要cAMP-CRP。

AraC蛋白具有PBAD活性正、負調(diào)節(jié)因子的雙重功能，這是通過該蛋白的兩種異構(gòu)體實現(xiàn)的。Pr是起阻遏作用的形式，可與類操縱區(qū)位點相結(jié)合，而Pi是起誘導(dǎo)作用的形式，它通過與PBAD啟動子結(jié)合進行調(diào)節(jié)。沒有阿拉伯糖時，Pr形式占優(yōu)勢；一旦有阿拉伯糖存在，它就能夠與AraC蛋白結(jié)合，使平衡趨向于Pi形式。

a.沒有AraC蛋白時，由Pc啟動子起始araC基因轉(zhuǎn)錄；

b.葡萄糖水平較高時，AraC蛋白與操縱區(qū)O2以及araI上半?yún)^(qū)相結(jié)合，形成DNA回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)，araBAD基因不表達；

c.有阿拉伯糖但無葡萄糖存在時，AraC與阿拉伯糖相結(jié)合，變構(gòu)成為激活蛋白，與araO1和araI區(qū)相結(jié)合，在CRP-cAMP的共同作用下起始結(jié)構(gòu)基因表達。

a.培養(yǎng)基含有葡萄糖，cAMP-CRP沒有與操縱區(qū)位點相結(jié)合，AraC蛋白處于Pr形式并與操縱區(qū)A位點結(jié)合，RNA聚合酶不能與Pc結(jié)合，araC基因受到抑制，整個系統(tǒng)幾乎處于靜止?fàn)顟B(tài)。b.沒有葡萄糖糖，也沒有阿拉伯糖。因為沒有誘導(dǎo)物，盡管有cAMP-CRP與操縱區(qū)位點相結(jié)合，AraC蛋白仍以Pr形式為主，無法與操縱區(qū)B位點相結(jié)合，無araBADmRNA轉(zhuǎn)錄。c.無葡萄糖，有阿拉伯糖。大量araC基因產(chǎn)物以Pi形式存在，并分別與操縱區(qū)B、A位點相結(jié)合，在cAMP-CRP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表達，操縱子充分激活。7.4.3阻遏蛋白LexA的降解與細菌中的SOS應(yīng)答當(dāng)細菌DNA遭到破壞時，細胞內(nèi)會啟動一個被稱為SOS的誘導(dǎo)型DNA修復(fù)系統(tǒng)。參與SOSDNA修復(fù)系統(tǒng)的基因都受LexA阻遏蛋白的抑制，SOS體系的誘導(dǎo)表達過程中LexA阻遏蛋白被移開。

圖7-32大腸桿菌中受LexA蛋白阻遏的SOSDNA損傷修復(fù)系統(tǒng)操縱子的表達調(diào)控模式。一般情況下，約有1000個RecA蛋白單體分散在每個細胞中。當(dāng)DNA嚴重受損時，單鏈DNA缺口數(shù)量增加，RecA與這些缺口處單鏈DNA相結(jié)合，被激活成為蛋白酶，將LexA蛋白切割成沒有阻遏和操縱區(qū)DNA結(jié)合活性的兩個片段，導(dǎo)致SOS體系（包括recA基因）高效表達，DNA得到修復(fù)。7.4.4二組分調(diào)控系統(tǒng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最簡單的細胞信號系統(tǒng)稱為二組分系統(tǒng)（ponentsystems），由二種不同的蛋白質(zhì)組成：即位于細胞質(zhì)膜上的傳感蛋白（sensorprotein）及位于細胞質(zhì)中的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（responseregulatorprotein）。圖7-33細菌中參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的二組分調(diào)控系統(tǒng)

傳感激酶常在與膜外環(huán)境的信號反應(yīng)過程中被磷酸化，再將其磷?；鶊F轉(zhuǎn)移到應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白上，磷酸化的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白即成為阻遏或誘導(dǎo)蛋白，通過對操縱子的阻遏或激活作用調(diào)控下游基因表達。7.4.5多啟動子調(diào)控的操縱子1、rRNA操縱子

大腸桿菌rRNA操縱子（rrnE）上有兩個啟動子P1和P2。在對數(shù)生長期，P1起始的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物比P2起始的產(chǎn)物多3～5倍。當(dāng)細菌處于緊急狀態(tài)，細胞中ppGpp濃度增加，P1的作用被抑制。因為rRNA是細胞中蛋白質(zhì)合成機器核糖體的重要組成部分，不能完全停止供應(yīng)，由P2起始rrnE基因轉(zhuǎn)錄。

2、核糖體蛋白S1操縱子核糖體蛋白SI操縱子（rpsA）也受應(yīng)急反應(yīng)調(diào)節(jié)。rpsA有4個啟動子，P1、P2是強啟動子，平時主要依靠它們來啟動基因的表達，合成S1蛋白。P3、P4是弱啟動子，只有在緊急情況下，P1、P2啟動子受ppGpp的抑制，由P3、P4起始合成的S1蛋白維持了生命的最低需要。

3、DnaQ蛋白操縱子

DnaQ蛋白是DNA聚合酶全酶的亞基。在細胞中RNA聚合酶活性較低時，操縱子的轉(zhuǎn)錄由弱啟動子P2控制；而RNA聚合酶活性較高時，就開始利用強啟動子P1。也就是說，在細胞生命活動比較緩慢時，

DnaQ蛋白的合成靠弱啟動子P2來維持。當(dāng)細胞增殖速度加快，RNA聚合酶活性升高時，P1就被激活。

7.5固氮基因調(diào)控氮是所有生物的基本組成成分，蛋白質(zhì)、核酸及許多小分子代謝產(chǎn)物都是含氮化合物。地球上的動植物共含氮約1.5×1010噸，而每年通過硝化細菌以氣態(tài)氮的形式釋放到大氣中的氮就有2×108～5×108噸，全世界氮肥廠每年生產(chǎn)的化肥僅含氮約108噸。如果沒有生物固氮，生命很快就不復(fù)存在了。

7.5.1根瘤的產(chǎn)生根瘤菌在豆科植物根際的生長以及與寄主植物根毛幼嫩部位的接觸是感染發(fā)生的第一步。通常情況下，根瘤菌特定小種的寄主范圍都是很狹窄的，如Rhizobiumtrifolii主要感染三葉草，R.phaseoli主要感染菜豆，R.Leguminosarum主要感染豌豆。

表7-5感染各種植物的不同根瘤菌

主要類群根瘤菌名寄主植物苜蓿類R.meliloti苜蓿三葉草類R.trifolii三葉草豌豆類R.leguminosarum豌豆、某些菜豆及扁豆菜豆類R.phaseoli菜豆羽扇豆類B.lupini羽扇豆大豆類B.japonicum大豆豇豆類Cowpearhizobia花生、豇豆、金合歡屬7.5.2固氮酶固氮酶所催化的反應(yīng)：

8e-N2+8H++32ATP------>2NH3+H2+32ADP+32Pi

這個反應(yīng)包括兩個組分：組分I由兩個5.0×104的α亞基和兩個6.0×104的β亞基組成，由nifD和nifK基因編碼。含有4個[4Fe-4S]連接橋和兩個鐵-鉬輔助因子（FeMoCo），常被稱為鐵鉬蛋白（FeMo-protein）。組分II由兩個完全相同的相對分子質(zhì)量各為3.0×104的亞基所組成，由nifH基因編碼，常被稱為鐵蛋白（Fe-protein）。組分II只有一個[4Fe-4S]連接橋，位于兩個亞基之間，一次只可送出一個電子，是生物固氮反應(yīng)中的“瓶頸”。

FeMoCo含有1摩爾

Mo，6摩爾Fe，8摩爾S，可能位于酶-底結(jié)合活性中心附近。分離純化的FeMoCo能被用來活化鐵鉬蛋白。研究認為，鐵鉬蛋白α亞基第191位谷氨酰胺和第195位組氨酸附近，若分別用賴氨酸取代谷氨酰胺191，用天冬酰胺取代組氨酸195，鐵鉬蛋白的固氮活性明顯下降。

表7-6幾種不同突變體中的固氮酶活性比較株系突變核苷酸序列鐵鉬蛋白相對活性鐵蛋白相對活性野生型—CAGTCCCTGGCCACCACATC40.618.7DJ357ΔnifDK：：Kmr—048.5DJ178α-His195→AsnCAGTCCCTGGCAACCACATC3.726.3DJ255α-Gln191→LysCGCGGCGTTTCCAAGTCCCTG1.439.5

7.5.3與固氮有關(guān)的基因及其調(diào)控實驗證明，nifAL基因控制了整個固氮酶系統(tǒng)的表達和活性。若突變nifA基因，那么固氮酶和其他所有已知的nif基因產(chǎn)物都會消失。若再將野生型nifA基因用質(zhì)粒DNA的形式導(dǎo)入上述突變株中，nif操縱子的功能就得到恢復(fù)。

nifA和nifL基因產(chǎn)物分別是nif操縱子的正、負調(diào)控因子。當(dāng)細胞內(nèi)沒有nifL蛋白質(zhì)時，nifA基因產(chǎn)物足以激活其他nif基因的表達，甚至在有NH3和O2存在時也如此。

Nif野生型克氏肺炎桿菌UNF928中固氮酶的活性完全被10mmol/LNH4+所抑制，而UNF714由于帶有突變型nifAL基因，所以固氮酶活性為零。若將帶有nifA質(zhì)粒DNA正向表達載體pMC73A導(dǎo)入UNF714中，不但能完全恢復(fù)野生型固氮酶活性，而且在10毫摩爾/升

NH4+中仍有15%～30%的活性。

表7-7克氏肺炎桿菌固氮酶活性與nifA質(zhì)粒的關(guān)系株系固氮酶活性/相對單位—NH4++NH4+

UNF9281000.005

UNF71400

UNF714+pMC73A23027

UNF714+pMC73B0.10.1

UNF1780(glnA100→nif)0.050.075

UNF1780+pMC73A17480

UNF1780+pMC73B0.0050.005有兩組nif-突變體位于質(zhì)粒上90min處，被稱為ntrB和ntrC（ntr，nitrogenregulation，氮調(diào)控），另有一組位于質(zhì)粒上70min處，稱為ntrA。

nifA基因只有在ntrA、ntrC基因產(chǎn)物的共同作用下才能正常工作，激活nif操縱子群，而ntrC基因的活性是直接受NH3影響的。NH3濃度較高時，ntrC基因產(chǎn)物沒有轉(zhuǎn)錄活性。

分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，細胞質(zhì)內(nèi)谷氨酰胺：α-酮戊二酸的比值較低時，UMP就在glnD基因產(chǎn)物的作用下被轉(zhuǎn)移到GlnB蛋白上，反之則從GlnB蛋白上脫去UMP。不帶有UMP的GlnB蛋白能與NtrB產(chǎn)物相結(jié)合并導(dǎo)致NtrC基因產(chǎn)物去磷酸化，喪失啟動nifAL基因轉(zhuǎn)錄的功能。當(dāng)細胞內(nèi)游離氨含量較低時，GlnB蛋白被尿苷化并與NtrB蛋白分離，使后者蛋白激酶的功能得到發(fā)揮，將NtrC蛋白磷酸化而激活nif操縱子系統(tǒng)（圖6-38）。

因為細胞內(nèi)氧濃度一般都在數(shù)百微摩爾左右，而固氮酶只能在幾十納摩爾O2濃度下才能正常工作，固氮菌依靠豆血紅蛋白(leghemoglobin,Lb)解決了這對矛盾，因為Lb對O2有極高的親和力，它與大量自由O2相結(jié)合，既大大降低了自由O2濃度，又能將分子氧直接輸送到呼吸鏈。

7.6轉(zhuǎn)錄水平上的其它調(diào)控方式（1）因子的調(diào)節(jié)作用：受蛋白水解酶作用；抗因子與因子結(jié)合，阻止其與RNA聚合酶結(jié)合組裝。（2）組蛋白類似蛋白調(diào)節(jié)作用：如細菌中H-NS蛋白非特異性結(jié)合在DNA上，抑制基因轉(zhuǎn)錄。（3）轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子作用：轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與啟動子區(qū)結(jié)合，對基因的轉(zhuǎn)錄起激活或抑制作用。（4）抗終止因子的調(diào)節(jié)作用：在抗終止因子的作用下，RNA聚合酶越過終止子，繼續(xù)轉(zhuǎn)錄DNA。7.7轉(zhuǎn)錄后調(diào)控7.7.1mRNA自身結(jié)構(gòu)對翻譯起始的調(diào)節(jié)（1）起始密碼子的選擇影響了翻譯的效率：AUG，GUG，UUG。如果將AUG換成GUG或UUG，mRNA的翻譯效率降低8倍。（2）遺傳信息的翻譯起始于mRNA上的核糖體結(jié)合位點（RBS）----起始密子AUG上游的一段非翻譯區(qū)。在RBS中有SD序列，與核糖體16SrRNA的3’端互補配對，促使核糖體與mRNA相結(jié)合。

RBS的結(jié)合強度取決于SD序列的結(jié)構(gòu)及與AUG之間的距離。SD與AUG之間相距一般以4～10核苷酸為佳，9核苷酸最佳。（3）mRNA二級結(jié)構(gòu)：mRNA5’端二級結(jié)構(gòu)會影響核糖體30S亞基與mRNA的結(jié)合，造成蛋白質(zhì)合成效率上的差異。7.7.2mRNA穩(wěn)定性對轉(zhuǎn)錄水平的影響

mRNA在細菌內(nèi)都有一定的半衰期，平均為2—3min；所有細胞