第六章克隆基因的表達(dá)2

一、真核細(xì)胞基因克隆載體1．在酵母細(xì)胞中克隆基因常用的載體酵母是研究真核生物DNA的復(fù)制、重組、基因表達(dá)以及調(diào)控過(guò)程等的理想材料，為此，也構(gòu)建了許多人工質(zhì)粒載體。根據(jù)這些質(zhì)粒和復(fù)制方式不同，把它們分為整合型(YIp)、復(fù)制型(YRp)、附加體型(YEp)等。當(dāng)前1頁(yè)，總共46頁(yè)。以上3種類型載體的共同特點(diǎn)是：①能在大腸桿菌中克隆，并且具有較高的拷貝數(shù)。這樣可使外源基因轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞之前先在大腸桿菌中擴(kuò)增；②含有在酵母細(xì)胞中便于選擇的遺傳標(biāo)記。這些標(biāo)記一般能和大腸桿菌相應(yīng)的突變體互補(bǔ)。有些還攜帶有用于大腸桿菌的抗生素抗性標(biāo)記；③含有合適的限制酶切割位點(diǎn)，以便外源基因的插入。當(dāng)前2頁(yè)，總共46頁(yè)。(1)整合型載體(YIp)

YIp型載體是由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片段構(gòu)成的，如PYeleul0是由Co1E1質(zhì)粒和酵母DNA提供的亮氨酸(Leu2+)片段構(gòu)成。由于leu2+基因片段不含自主復(fù)制起始區(qū)，只作為選擇標(biāo)記，所以YIp型載體在酵母細(xì)胞中不能自主復(fù)制。YIp型載體可經(jīng)轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)入受體細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞后的YIp質(zhì)粒DNA通過(guò)與受體染色體DNA的同源重組，被整合到染色體上，并隨染色體一起復(fù)制。這樣質(zhì)粒DNA以單拷貝基因形式穩(wěn)定地遺傳。當(dāng)前3頁(yè)，總共46頁(yè)。(2)復(fù)制型載體(YRp)

YRp型載體是酵母的DNA片段插入到大腸桿菌質(zhì)粒中構(gòu)成的。其中酵母DNA片段不但提供了選擇標(biāo)記，還攜帶來(lái)自酵母染色體DNA的自主復(fù)制順序(ARS)。因?yàn)樗瑫r(shí)含有大腸桿菌和酵母的自主復(fù)制基因，所以能在兩種細(xì)胞中存在和復(fù)制?？梢栽趦煞N截然不同的生物細(xì)胞中復(fù)制的載體稱為穿梭載體(shuttlevector)。穿梭載體在基因工程中廣泛使用。當(dāng)前4頁(yè)，總共46頁(yè)。(3)附加體型載體(YEp)

YEp型載體一般由大腸桿菌質(zhì)粒、2um質(zhì)粒以及酵母染色體的選擇標(biāo)記構(gòu)成。2um質(zhì)粒是釀酒酵母含有一個(gè)長(zhǎng)度為2um的內(nèi)源質(zhì)粒，它的DNA分子通常與蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成復(fù)合物，存在于核區(qū)。2um質(zhì)粒含有自主復(fù)制起始區(qū)(ori)和STB區(qū)，STB序列能夠使質(zhì)粒在供體細(xì)胞中維持穩(wěn)定。利用2um質(zhì)粒，人們已經(jīng)構(gòu)建出許多YEp型載體。

當(dāng)前5頁(yè)，總共46頁(yè)。2．植物基因克隆的載體——Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒存在于能夠引起植物形成冠癭瘤的土壤農(nóng)癌桿菌中。這種腫瘤的形成是由Ti質(zhì)粒決定的，故稱為誘導(dǎo)腫瘤的質(zhì)粒(tumorinducingplasmid)，簡(jiǎn)稱Ti質(zhì)粒。當(dāng)前6頁(yè)，總共46頁(yè)。(1)冠癭瘤在Ti質(zhì)粒誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞中，具有大量的不正常的氨基酸類物質(zhì)——冠癭堿(opine)，這是一類相對(duì)分子質(zhì)量較小的堿性氨基酸衍生物，由Ti質(zhì)粒DNA編碼。正常植物細(xì)胞不能合成和利用冠癭堿，而土壤農(nóng)癌桿菌能夠選擇性地利用這類化合物作為自己唯一的能源、碳源和氮源。最常見的冠癭堿有章魚堿(octopine)、胭脂堿(nopaline)和農(nóng)桿堿(agropine)。根據(jù)所產(chǎn)生的冠癭堿的類型和差別，可將冠癭瘤細(xì)胞分為章魚堿型、胭脂堿型和農(nóng)桿堿型腫瘤細(xì)胞。當(dāng)前7頁(yè)，總共46頁(yè)。(2)Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和特性每種土壤農(nóng)癌桿菌只含有一種Ti質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒是環(huán)狀dsDNA，大約185kb，如圖。土壤農(nóng)癌桿菌中的T-DNA為轉(zhuǎn)移DNA，是Ti質(zhì)粒最重要的組成部分。在土壤農(nóng)癌桿菌感染植物細(xì)胞后，Ti質(zhì)粒中的T-DNA區(qū)能夠隨機(jī)地共價(jià)整合到植物染色體DNA中。它所攜帶的基因主要有兩個(gè)功能，一是決定腫瘤的形成和形態(tài)，二是控制冠癭堿的合成。這也是Ti質(zhì)粒的主要功能，說(shuō)明T-DNA是Ti質(zhì)粒的核心區(qū)段。當(dāng)前8頁(yè)，總共46頁(yè)。當(dāng)前9頁(yè)，總共46頁(yè)。(3)Ti質(zhì)粒的作用和改造Ti質(zhì)粒的T-DNA能夠自發(fā)地整合到植物染色體DNA上，誘導(dǎo)植物形成腫瘤，是一種理想的天然植物基因工程載體。T-DNA上的opine合成酶基因具有一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，能啟動(dòng)外源基因在植物細(xì)胞中高效表達(dá)，這都是Ti質(zhì)粒作為載體的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前10頁(yè)，總共46頁(yè)。對(duì)Ti質(zhì)粒進(jìn)行了以下改造，使之符合載體的要求：①保留T-DNA的轉(zhuǎn)移功能；②取消T-DNA的致瘤性，使之進(jìn)入植物細(xì)胞后不至于干擾細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分化，轉(zhuǎn)化體可再生植株；③通過(guò)簡(jiǎn)便的手段可使外源DNA插人T-DNA之中，并隨著T-DNA整合到植物染色體上。當(dāng)前11頁(yè)，總共46頁(yè)。3．動(dòng)物細(xì)胞基因克隆的載體哺乳動(dòng)物細(xì)胞若不借助一些特殊的手段，很難捕獲和表達(dá)外源的DNA?，F(xiàn)已有多種技術(shù)來(lái)改變這種狀況，如磷酸鈣等的轉(zhuǎn)染技術(shù)、電穿孔技術(shù)、顯微注射技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)等。其中借助病毒載體將外源DNA導(dǎo)人動(dòng)物細(xì)胞，也是極為重要的一方面。在眾多的病毒載體中，猿猴空泡病毒40（SV40)載體是研究得最為詳細(xì)、發(fā)展最快的一種。下面對(duì)SV40載體作簡(jiǎn)要介紹。

當(dāng)前12頁(yè)，總共46頁(yè)。(1)SV40病毒

SV40病毒是一種小型二十面體的蛋白質(zhì)顆粒，由VPl，VP2和VP3三種病毒外殼蛋白構(gòu)成，中間包裝著一條環(huán)狀的病毒基因組DNA。SV40DNA大小為5.2kb，很適于基因操作。對(duì)其DNA順序也進(jìn)行了全序列分析。目前所使用的SV40載體都是經(jīng)過(guò)改造的，通常只保留SV40的復(fù)制起始區(qū)和早期區(qū)域啟動(dòng)子以及多聚腺苷酸化位置和小t抗原的內(nèi)含子。

當(dāng)前13頁(yè)，總共46頁(yè)。一個(gè)典型而又通用的哺乳動(dòng)物基因載體pSV2：

當(dāng)前14頁(yè)，總共46頁(yè)。當(dāng)前15頁(yè)，總共46頁(yè)。第三節(jié)

外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法當(dāng)前16頁(yè)，總共46頁(yè)。1．酵母的轉(zhuǎn)化一般有以下兩種方法：(1)利用酵母的原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化

首先，酶解酵母細(xì)胞壁，產(chǎn)生原生質(zhì)球，再將原生質(zhì)球置于DNA、CaCl2和多聚醇(如聚乙二醇)中，多聚醇可使細(xì)胞壁具有穿透性，并允許DNA進(jìn)入。然后使原生質(zhì)球懸浮于瓊脂中，并使其再生新的細(xì)胞壁。當(dāng)前17頁(yè)，總共46頁(yè)。(2)利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化

這種方法不需要消化酵母的細(xì)胞壁，產(chǎn)生原生質(zhì)球，而是將整個(gè)細(xì)胞暴露在Li+鹽(如0.1mol/LLiCl)中一段時(shí)間，再與DNA混合，經(jīng)過(guò)一定處理后，加40％PEG4000，然后經(jīng)熱應(yīng)激等步驟，即可獲得轉(zhuǎn)化體。這種方法的主要缺點(diǎn)是，如果用自主復(fù)制的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化體的數(shù)目比用原生質(zhì)球低10～100倍。當(dāng)前18頁(yè)，總共46頁(yè)。2．植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及其他基因轉(zhuǎn)移方法(1)葉盤法

植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化常用的方法。先將實(shí)驗(yàn)材料(如煙草)的葉子表面進(jìn)行消毒，再用消毒過(guò)的不銹鋼打孔器從葉子上取下圓形小片，即葉盤。為了對(duì)葉盤進(jìn)行接種處理，需將它放在土壤農(nóng)癌桿菌培養(yǎng)液中浸泡4～5min，然后用濾紙吸干，放在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，需將葉子背面接觸培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)數(shù)周后，葉盤周圍會(huì)長(zhǎng)出愈傷組織并分化出幼苗。

當(dāng)前19頁(yè)，總共46頁(yè)。葉盤法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、適用性廣，對(duì)于那些能被土壤農(nóng)癌桿菌感染并能從離體葉盤形成的愈傷再生成株的各種植物都適用。這種方法具有很高的重復(fù)性，便于大量常規(guī)地培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植株。目前，這種方法已成為雙子葉植物基因?qū)说闹饕侄?。用這種主法所得到的轉(zhuǎn)化體，其外源基因能穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)，并按孟德爾方式分離。

當(dāng)前20頁(yè)，總共46頁(yè)。(2)電擊法

原理是，在很強(qiáng)的電壓下，細(xì)胞膜會(huì)出現(xiàn)電穿孔現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，細(xì)胞膜上的小孔會(huì)封閉，恢復(fù)細(xì)胞膜原有特性。據(jù)此原理設(shè)計(jì)的電擊法可用于基因轉(zhuǎn)移。電擊法具有簡(jiǎn)便、快速、效率高等優(yōu)點(diǎn)，但在植物中，由于細(xì)胞壁對(duì)外源基因的攝取有不利影響，所以一般以原生質(zhì)粒為受體細(xì)胞。目前，該法用于煙草、玉米、水稻、小麥、高梁和大豆等植物，已得到了穩(wěn)定的外源基因表達(dá)。

當(dāng)前21頁(yè)，總共46頁(yè)。(3)基因槍法又稱高速微型子彈射擊法，它是將DNA吸附在由鎢制作的微型子彈(直徑約為1.2um)表面，通過(guò)特制的手槍，將子彈高速射人完整的細(xì)胞和組織內(nèi)。用這種方法，已將DNA先后送人酵母的線粒體和核、衣藻的葉綠體和核、洋蔥的表皮細(xì)胞以及玉米懸浮細(xì)胞中。基因槍法避開原生質(zhì)體再生植株的難關(guān)，因此成為單子葉植物基因轉(zhuǎn)移的有效途徑。當(dāng)前22頁(yè)，總共46頁(yè)。3．哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因?qū)敕ǎ?）磷酸鈣沉淀法

具體做法大致是：先將需要被導(dǎo)入的DNA溶解在鈣鹽溶液中，然后在不停地?cái)嚢柘轮鸬渭拥搅姿猁}溶液中，形成磷酸鈣微結(jié)晶與DNA的共沉淀物。再將這種共沉淀物與受體細(xì)胞混合、保溫，DNA可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并整合到寄主染色體上。這種方法多數(shù)用于單層培養(yǎng)的細(xì)胞，也可用于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞。當(dāng)前23頁(yè)，總共46頁(yè)。(2)脂質(zhì)體載體法

這種方法即用脂質(zhì)體包埋核酸分子，然后將其導(dǎo)入細(xì)胞。脂質(zhì)體是一種人工膜，制備方法很多，用于轉(zhuǎn)移DNA的較理想的膜成分是帶負(fù)電荷的磷脂酰絲氨酸。做法大致是：將磷脂和DNA溶液溶解于大量的有機(jī)溶劑(如醚)中，再經(jīng)過(guò)超聲波處理，使其形成乳劑，然后蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑，最終形成0.4um的脂質(zhì)體。進(jìn)一步可通過(guò)聚乙二醇(PEG)的作用，使細(xì)胞吸收脂質(zhì)體。當(dāng)前24頁(yè)，總共46頁(yè)。(3)顯微注射法又簡(jiǎn)稱為微注射法，它是創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的有效途徑。其技術(shù)關(guān)鍵如下：①理想外源基因的制備。這種基因可處于質(zhì)粒上，但注射前質(zhì)粒已經(jīng)酶切而線性化。有的載體DNA會(huì)干擾外源基因的表達(dá)，因此注射前，需要先從載體上將它們切下。②收集受精卵。在受孕后的幾小時(shí)內(nèi)，父母雙方的遺傳物質(zhì)還未結(jié)合前，從供體動(dòng)物中取出單細(xì)胞的受精卵。③顯微注射。利用極細(xì)的毛細(xì)玻璃管(外徑為0.5—1um)，將理想的遺傳物質(zhì)注入受精卵的雄原核。這必須在父母雙方遺傳物質(zhì)融合前的4h間歇期內(nèi)完成。當(dāng)雙親染色體相遇后，注入的理想基因有可能整合到染色體上。④在幾次細(xì)胞分裂后，將帶有理想基因的受精卵移入母體，使受精卵孕育。

當(dāng)前25頁(yè)，總共46頁(yè)。(4)DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)二乙胺乙基葡聚糖（DEAE-dextran）是一種相對(duì)分子質(zhì)量較大的多聚陰離子試劑，能促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞捕獲外源DNA，因此被用于基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。其促進(jìn)細(xì)胞捕獲DNA的機(jī)理還不清楚，可能是因?yàn)槠暇厶桥cDNA形成復(fù)合物而抑制了核酸酶對(duì)DNA的作用，也可能是葡聚糖與細(xì)胞結(jié)合而引發(fā)了細(xì)胞的內(nèi)吞作用。當(dāng)前26頁(yè)，總共46頁(yè)。DEAE-dextran轉(zhuǎn)染主要有兩種不同的方法。一種是先使DNA直接同DEAE-dextran混合，形成DNA/DEAE-dextran復(fù)合物后，再用來(lái)處理細(xì)胞；另一種是受體細(xì)胞先用DEAE-dextran溶液預(yù)處理，然后再用來(lái)與轉(zhuǎn)染的DNA接觸。當(dāng)前27頁(yè)，總共46頁(yè)。第七章重組體的篩選與鑒定當(dāng)前28頁(yè)，總共46頁(yè)。由體外重組產(chǎn)生的DNA分子，通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等適當(dāng)途徑引入宿主會(huì)得到大量的重組體細(xì)胞或噬菌體。面對(duì)這些大量的克隆群體，需要采用特殊的方法才能篩選出可能含有目的基因的重組體克隆。同時(shí)也需要用某種方法檢測(cè)從這些克隆中提取的質(zhì)?；蚴删wDNA，看其是否確實(shí)具有一個(gè)插人的外源DNA片段。

目前已經(jīng)發(fā)展和應(yīng)用了一系列構(gòu)思巧妙、可靠性較高的重組體克隆檢測(cè)法，包括使用特異性探針的核酸雜交法、免疫化學(xué)法、遺傳檢測(cè)法和物理檢測(cè)法等。當(dāng)前29頁(yè)，總共46頁(yè)。一、遺傳檢測(cè)法

遺傳檢測(cè)法可分為根據(jù)載體表型特征和根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組子兩種方法。1．根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子的直接選擇法在基因工程中使用的所有的載體分子，都帶有一個(gè)可選擇的遺傳標(biāo)記或表型特征。質(zhì)粒以及柯斯載體具有抗藥性標(biāo)記或營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記，而對(duì)于噬菌體來(lái)說(shuō)，噬菌斑的形成則是它們的自我選擇特征。當(dāng)前30頁(yè)，總共46頁(yè)。(1)抗藥性標(biāo)記插入失活選擇法pBR322質(zhì)粒是DNA分子克隆中最常用的一種載體分子。編碼有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。只要將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)在含有四環(huán)素或氨芐青霉素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，便可以容易地檢測(cè)出獲得了此種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。當(dāng)前31頁(yè)，總共46頁(yè)。重組菌非重組菌非重組菌不含有抗菌素的培養(yǎng)基含有抗菌素的培養(yǎng)基含有抗菌素的培養(yǎng)基當(dāng)前32頁(yè)，總共46頁(yè)。(2)β—半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法外源DNA插入到它的lacZ基因上所造成的β-半乳糖苷酶失活效應(yīng)，可以通過(guò)大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在X-gal-IPTG培養(yǎng)基中的顏色變化直接觀察出來(lái)。在pUC質(zhì)粒載體lacZ序列中，含有一系列不同限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，其中任何一個(gè)位點(diǎn)插入了外源克隆DNA片段，都會(huì)阻斷讀碼結(jié)構(gòu)，使其編碼的肽失去活性，結(jié)果產(chǎn)生出白色的菌落。當(dāng)前33頁(yè)，總共46頁(yè)。2．根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體分子的直接選擇法這種選擇法依據(jù)的基本原理是，轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的外源DNA編碼的基因，能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主菌株所具有的突變發(fā)生體內(nèi)抑制或互補(bǔ)效應(yīng)，從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。例如，編碼大腸桿菌生物合成基因的克隆所具有的外源DNA片段，對(duì)于大腸桿菌寄主菌株的不可逆的營(yíng)養(yǎng)缺陷突變具有互補(bǔ)的功能。根據(jù)這種特性，便可以分離到獲得了這種基因的重組體克隆。

當(dāng)前34頁(yè)，總共46頁(yè)。二、物理檢測(cè)法這類重組體質(zhì)粒，只要根據(jù)其相對(duì)分子質(zhì)量比野生型大這一特點(diǎn)，就可以檢測(cè)出來(lái)。常用的重組體分子的物理檢測(cè)法有凝膠電泳檢測(cè)法和R—環(huán)檢測(cè)法兩種。當(dāng)前35頁(yè)，總共46頁(yè)。1．凝膠電泳檢測(cè)法帶有插入片段的重組體在相對(duì)分子質(zhì)量上會(huì)有所增加。分離質(zhì)粒DNA并測(cè)定其分子長(zhǎng)度是一種直截了當(dāng)?shù)姆椒?。通常用比較簡(jiǎn)單的凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

當(dāng)前36頁(yè)，總共46頁(yè)。2.小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切分析當(dāng)前37頁(yè)，總共46頁(yè)。3．R-環(huán)檢測(cè)法

是指在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度(70％)的甲酰胺溶液中，雙鏈的DNA-RNA分子要比雙鏈的DNA-DNA分子更為穩(wěn)定。因此，將RNA及DNA的混合物置于這種退火條件下，RNA便會(huì)同它的雙鏈DNA分子中的互補(bǔ)序列退火形成穩(wěn)定的DNA-RNA雜交分子，而被取代的另一條鏈處于單鏈狀態(tài)。這種由單鏈DNA分支和雙鏈DNA-RNA分支形成的“泡狀”體，即所謂的R-環(huán)結(jié)構(gòu)。

當(dāng)前38頁(yè)，總共46頁(yè)。所以，應(yīng)用R-環(huán)檢測(cè)法可以鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源的區(qū)域。根據(jù)這樣的原理，在有利于R-環(huán)形成的條件下，使得檢測(cè)的純化的質(zhì)粒DNA，在含有mRNA分子的緩沖液中局部地變性。如果質(zhì)粒DNA分子上存在著與mRNA探針互補(bǔ)的序列，那么這種mRNA就將取代DNA分子中的相應(yīng)的互補(bǔ)鏈，形成R—環(huán)結(jié)構(gòu)。然后放置在電子顯微鏡下觀察，這樣便可以檢測(cè)出重組體質(zhì)粒的DNA分子。

當(dāng)前39頁(yè)，總共46頁(yè)。三、核酸雜交篩選法從基因文庫(kù)中篩選帶有目的基因插入序列的克隆，最廣泛使用的一種方法是核酸分子雜交技術(shù)。它所依據(jù)的原理是利用放射性同位素(32P或1251)標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行DNA-DNA或RNA-DNA雜交，即利用同源DNA堿基配對(duì)的原理檢測(cè)特定的重組克隆。前面我們講過(guò)southern印跡雜交，northern雜交等，現(xiàn)在我們談一下另一種雜交方式—原位雜交。當(dāng)前40頁(yè)，總共46頁(yè)。1．原位雜交

原位雜交(insituhybridization)亦稱菌落雜交或噬菌體雜交。這種方法的基本程序是，將大腸桿菌菌落，從瓊脂平板中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，而后進(jìn)行適當(dāng)?shù)臏赜〕鲆呀?jīng)長(zhǎng)有菌落的硝酸纖維素濾膜，使用堿處理，細(xì)菌菌落被溶解，它們的DNA也就隨之變性。用放射性同位素標(biāo)記的RNA或DNA作為探針雜交，放射自顯影技術(shù)檢測(cè)。凡是含有與探針互補(bǔ)序列的菌落DNA，就會(huì)在X光膠片上出現(xiàn)曝光點(diǎn)。根據(jù)曝光點(diǎn)的位置，便可以從保留的母板上相應(yīng)位置挑出所需要的陽(yáng)性菌落。當(dāng)前41頁(yè)，總共46頁(yè)。2.Southern印跡雜交3.Northern雜交當(dāng)前42頁(yè)，總共46頁(yè)。四、免疫化學(xué)檢測(cè)法