實驗微生物細胞的大小測量和顯微計數(shù)目

實驗微生物細胞的大小測量和顯微計數(shù)目第1頁/共20頁實驗六

微生物細胞的大小測量和顯微計數(shù)第2頁/共20頁一、目的與要求學習測微尺測定微生物細胞大小，以及血球計數(shù)板計算微生物細胞數(shù)目的原理。掌握使用測微尺和血球計數(shù)板對微生物細胞進行大小測量和細胞計數(shù)的方法。增強微生物細胞大小的感性認識。第3頁/共20頁二、基本原理1、微生物細胞大小的測量微生物細胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。微生物大小的測定，需要在顯微鏡下，借助特殊測量工具――測微尺（包括鏡臺測微尺和目鏡測微尺）。測微尺原理：鏡臺測微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般是將1mm等分為100格，每格長0.01mm(即10μm)。鏡臺測微尺并不直接用來測量細胞的大小，而是用于校正目鏡測微尺每格的相對長度，然后再用目鏡測微尺測量微生物細胞的大小。第4頁/共20頁二、基本原理2、顯微直接計數(shù)顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計菌器），于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。血細胞計數(shù)板原理：計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構成三個平臺，中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各該有一個方格網(wǎng)，每個方格多共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。第5頁/共20頁二、基本原理每個計數(shù)室（大方格）邊長為1mm，則每個大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.1mm，所以計數(shù)室的容積為0.1mm3（即萬分之一毫升）。每個計數(shù)室有25或16個中方格。計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘以25或16，就得出一個大方格的總菌數(shù)，然后換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。第6頁/共20頁三、實驗器材1、菌種：釀酒酵母菌液、細菌三形片2、試劑：無水乙醇、香柏油、二甲苯3、儀器或其他用具：目鏡測尺、鏡臺測微尺、血球計數(shù)板、蓋玻片、無菌吸管、酒精燈、顯微鏡、擦鏡紙、濾紙等第7頁/共20頁四、操作步驟1、微生物細胞大小測量1）目鏡測微尺的校正：將目鏡測微尺裝入目鏡→載物臺上放鏡臺測微尺→調(diào)節(jié)粗調(diào)和細節(jié)調(diào)至直看到鏡臺測微尺的刻度→轉動目鏡，推動鏡臺測微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合→數(shù)出兩重合線之間鏡臺測微尺和目鏡測微尺所占的格數(shù)→根據(jù)兩測微尺重合格數(shù)，計算出目鏡測微尺每格實際長度。

按上述步驟分別校正低倍鏡、高倍鏡和油鏡的下目鏡測尺每小格的實際長度。第8頁/共20頁四、操作步驟2）菌體大小的測量：取下鏡臺測微尺→將待測標本片放在載物臺上→觀察標本片中細胞所占目鏡測微尺的格數(shù)→根據(jù)目鏡測尺的實際長度算出細菌的大小操作要點：觀察時光線不宜過強，否則難以找到鏡臺測微尺的刻度。換高倍鏡和油鏡校正時，防止接物鏡壓壞鏡臺測微尺和損壞鏡頭。第9頁/共20頁四、操作步驟2、顯微直接計數(shù)1）血球計數(shù)室的觀察和清洗取血球計數(shù)板置于載物臺上→觀察熟悉計數(shù)室的中方格和小方格→取下血球計數(shù)板→用自來水沖洗計數(shù)室后，再用無水乙醇將血球計數(shù)室沖洗干凈→置干燥箱干燥。第10頁/共20頁2）樣品中酵母菌細胞的直接計數(shù)：取干凈血球計數(shù)板→在計數(shù)室上方蓋上蓋玻片→用無菌吸管，吸取搖勻的酵母菌稀釋液→在蓋玻片邊緣沾一下，讓菌液沿縫隙靠毛細管滲透作用進入計數(shù)室→靜置5min→低倍鏡或高倍鏡計算每個中方格內(nèi)的細胞數(shù)→完畢后清洗血細胞計數(shù)板→沖洗、干燥

第11頁/共20頁計數(shù)規(guī)則：1）要求每小格內(nèi)約有5－10個菌體為宜；2）選計數(shù)室四個角的中方格和中央的一個中方格進行計數(shù)；3）當細胞位于方格的線上時，一般只數(shù)上方和右邊線上的細胞；4）酵母出芽，又未脫離母體的，只有當芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計算；操作要點：血球計數(shù)室要清潔。觀察時光線不宜過強，否則難以找到計數(shù)室。吸取菌液前菌液要充分搖勻。血球計數(shù)室充滿菌液后，要靜置5min。第12頁/共20頁五、實驗數(shù)據(jù)及處理結果

1、大小測量1）將目鏡測微尺校正結果填入下表：

接目鏡放大倍數(shù)：2）將各菌測定結果填入下表接物鏡接物鏡倍數(shù)目鏡測微尺格數(shù)鏡臺測微尺格數(shù)目鏡測微尺每格代表的長度（μm

）低倍鏡高倍鏡油鏡微生物類型目鏡測微尺每格代表的長度（μm

）寬長菌體大小范圍（μm

）寬×長目鏡測微尺格數(shù)寬度（μm

）目鏡測微尺格數(shù)長度（μm

）桿菌球菌螺旋菌第13頁/共20頁五、實驗數(shù)據(jù)及處理結果

2、顯微計數(shù)

將結果記錄于下表中，A表示五個中方格的總菌數(shù)，B表示菌液稀釋倍數(shù)。各中方格菌數(shù)AB二室平均值菌數(shù)/ml12345第一室第二室第14頁/共20頁六、思考與討論1、根據(jù)你的體會，說明用血細胞計數(shù)板的誤差主要來自哪些方面？應如何盡量減少誤差、力求準確？2、某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請設計1-2種可行的檢測方法。下次實驗項目：培養(yǎng)基的配制與高壓蒸汽滅菌第15頁/共20頁

采用目鏡測微尺測量經(jīng)顯微鏡放大后的細胞物象，由于不同顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數(shù)不同，目鏡測微尺每小格所代表的實際長度也不一樣。因此在測量前要先對目鏡測微尺進行校正。第16頁/共20頁校正公式：目鏡測微尺每格長度(μm)＝兩重合線間鏡臺測微尺小格數(shù)×10/兩重合線間目鏡測微尺小格數(shù)