實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤藥理學(xué)-抗腫瘤藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤藥理學(xué)—抗腫瘤藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)第1頁(yè)/共70頁(yè)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤藥理學(xué)

—抗腫瘤藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)

第2頁(yè)/共70頁(yè)31基本知識(shí)1.1實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)在新藥研究開發(fā)中的作用與內(nèi)容1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與腫瘤學(xué)的基本知識(shí)1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型1.2.2腫瘤學(xué)基本知識(shí)1.2.2.1腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征1.2.2.2腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的特征1.3抗腫瘤藥物研究的歷史概要1.3.1惡性腫瘤研究的歷史1.3.2抗腫瘤藥物的研究第3頁(yè)/共70頁(yè)42.樣品抗腫瘤活性的確證（一）

——體內(nèi)篩選實(shí)驗(yàn)2.1概述2.2動(dòng)物的選擇及腫瘤接種2.2.1動(dòng)物的選擇2.2.2移植瘤的接種2.3移植性動(dòng)物腫瘤的質(zhì)量鑒定2.4待篩樣品的制備2.5劑量的選擇、動(dòng)物分組及數(shù)量2.5.1劑量的選擇2.5.2動(dòng)物分組2.6療效評(píng)價(jià)2.7瘤株的選擇2.7.1常用瘤株的介紹2.7.2瘤株的選擇2.8舉例2.9人體腫瘤裸鼠異種移植動(dòng)物模型第4頁(yè)/共70頁(yè)53.樣品抗腫瘤活性的確證（二）

——體外篩選實(shí)驗(yàn)3.1原理與基本操作要點(diǎn)3.1.1實(shí)驗(yàn)原理3.1.2基本操作要點(diǎn)3.2常用的腫瘤細(xì)胞株介紹3.3抗腫瘤藥物體外篩選的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.4常用的評(píng)價(jià)方法3.4.1細(xì)胞拒染法3.4.2生長(zhǎng)曲線法3.4.3克隆計(jì)數(shù)法3.4.4MTT法3.4.5SRB法3.5其它評(píng)價(jià)方法

第5頁(yè)/共70頁(yè)61基本知識(shí)1.1實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)在新藥研究開發(fā)中的作用與內(nèi)容第6頁(yè)/共70頁(yè)71.1實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)在新藥研究開發(fā)中的作用與內(nèi)容第7頁(yè)/共70頁(yè)81.1實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)在新藥研究開發(fā)中的作用與內(nèi)容2005年全世界上市的新藥（新的活性物質(zhì)）一共28個(gè)，20個(gè)是新的化學(xué)物體，其中8個(gè)抗感染藥物，其余12個(gè)藥中，抗腫瘤藥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)用藥各占4個(gè)。抗腫瘤的藥品市場(chǎng)是僅次于心血管藥物及中樞神經(jīng)系統(tǒng)用藥的第三大藥品市場(chǎng)，預(yù)計(jì)，至2010年，全球抗腫瘤藥物的市場(chǎng)的市值將達(dá)到600億美元。第8頁(yè)/共70頁(yè)91.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與腫瘤學(xué)的基本知識(shí)1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究工作中，建立人類疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型至關(guān)重要，成功動(dòng)物模型的建立是藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的根本。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型應(yīng)該具備的條件：①動(dòng)物的致病因素、發(fā)病機(jī)理、病理變化、評(píng)價(jià)指標(biāo)、病程發(fā)展與轉(zhuǎn)歸應(yīng)該與人類疾病一致或相近；②實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，成功率高，重現(xiàn)性好，便于推廣。③所需實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能夠方便提供，比如能夠人工繁育，提供的動(dòng)物具有相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)成本適中。腫瘤學(xué)實(shí)驗(yàn)中小鼠的使用占有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，它具有如下的優(yōu)點(diǎn)：①敏感模型比較容易復(fù)制；②潛伏期短復(fù)制速度快；③其形態(tài)特征等與人類腫瘤相似；④裸小鼠的應(yīng)用使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加接近臨床實(shí)際；⑤易于大量繁殖并有可靠的質(zhì)量保證。

第9頁(yè)/共70頁(yè)101.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與腫瘤學(xué)的基本知識(shí)1.2.2腫瘤學(xué)基本知識(shí)1.2.2.1癌細(xì)胞的生物學(xué)特征：⑴癌細(xì)胞對(duì)于控制正常細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)因素不能正常地發(fā)生反應(yīng)，通常表現(xiàn)出持續(xù)性增殖和分化不良的傾向。絕大多數(shù)惡性腫瘤（癌）細(xì)胞則喪失了接觸性抑制這一生物學(xué)特性。⑵癌細(xì)胞表現(xiàn)出與鄰近細(xì)胞及組織間關(guān)系的異常，改變了正常的組織結(jié)構(gòu)形式，表現(xiàn)為浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和播散轉(zhuǎn)移。⑶癌細(xì)胞能夠把上述惡性特征遺傳給它的下一代（子細(xì)胞）。第10頁(yè)/共70頁(yè)111.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與腫瘤學(xué)的基本知識(shí)1.2.2.2腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的特征⑴腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度不是恒定不變的，通常為迅速生長(zhǎng)和相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)相互交錯(cuò)出現(xiàn)。大多數(shù)情況下其惡性程度逐漸增加。⑵惡性腫瘤組織增長(zhǎng)的速度取決于三個(gè)因素，即細(xì)胞生長(zhǎng)周期、增殖比例和細(xì)胞的丟失。⑶絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)間短于腫瘤體積的倍增時(shí)間。一般而言，實(shí)體瘤的細(xì)胞周期時(shí)間比其母體組織為長(zhǎng)。第11頁(yè)/共70頁(yè)121.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與腫瘤學(xué)的基本知識(shí)⑷在腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞分為增殖細(xì)胞和不增殖細(xì)胞。增殖細(xì)胞包括增殖能力有限的腫瘤細(xì)胞和增殖能力無(wú)限的腫瘤干細(xì)胞。不增殖細(xì)胞包括G0期細(xì)胞和G1、G2期阻斷細(xì)胞。其中腫瘤干細(xì)胞和G0期細(xì)胞具有重要的生物學(xué)意義。⑸腫瘤的間質(zhì)成分包括纖維母細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。一般而言，間質(zhì)成分不斷改變以適應(yīng)腫瘤的生長(zhǎng)。⑹腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生腫瘤血管生成因子（TAF），TAF能夠誘導(dǎo)新生的毛細(xì)血管生成，為快速增長(zhǎng)的腫瘤組織提供營(yíng)養(yǎng)，若阻斷腫瘤毛細(xì)血管的生成，則腫瘤組織僅停留于直徑2~3mm大小而無(wú)法增長(zhǎng)。第12頁(yè)/共70頁(yè)131.3抗腫瘤藥物研究的歷史概要1.3.1惡性腫瘤研究的歷史1000多年前腫瘤的臨床觀察，分類與治療。1775年發(fā)現(xiàn)陰囊癌與接觸煤焦油密切相關(guān)。19世紀(jì)后半葉發(fā)現(xiàn)膀胱癌與苯胺染料接觸相關(guān)，引起人們對(duì)化學(xué)致癌的關(guān)注。1856年制定判斷腫瘤細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。1876年建立腫瘤的研究模型。1900年成功的培育純系動(dòng)物，使得腫瘤學(xué)研究得以大踏步的向前邁進(jìn)。1908年發(fā)現(xiàn)雞白血病。1911年發(fā)現(xiàn)Rous肉瘤病毒，確定了病毒致癌的病因，該發(fā)現(xiàn)獲得1966年諾貝爾獎(jiǎng)。1918年發(fā)現(xiàn)兔耳長(zhǎng)期涂抹煤焦油誘發(fā)皮膚腫瘤。1933年成功分離得到煤焦油中的致癌成分苯并芘，后又分離得到促癌成分佛波酯，化學(xué)致癌學(xué)說(shuō)得以確立。第13頁(yè)/共70頁(yè)141.3抗腫瘤藥物研究的歷史概要1969年癌基因假說(shuō)提出。1973年基因重組技術(shù)成功。1975年第一個(gè)病毒癌基因Sre分離成功，并因此獲得諾貝爾獎(jiǎng)。1981年從人的腫瘤中分離得到Ras癌基因，迄今為止已發(fā)現(xiàn)癌基因100多個(gè)）1986年第一個(gè)抗癌基因Rb被克隆。1989年明確p53基因?yàn)榭拱┗?。?983年發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直沒(méi)有定性；該基因?yàn)槟壳耙阎脑趷盒阅[瘤中突變率最高的抗癌基因）。1997年NCI開始執(zhí)行“腫瘤基因索引計(jì)劃（tumorgeneindexprogram,TGIP）”21世紀(jì)以來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)高速發(fā)展加速了人們對(duì)腫瘤本質(zhì)的認(rèn)識(shí)，人們正在一步一步的揭開腫瘤神秘的面紗。第14頁(yè)/共70頁(yè)151.3抗腫瘤藥物研究的歷史概要1.3.2抗腫瘤藥物的研究腫瘤的藥物治療是腫瘤三大經(jīng)典（即手術(shù)、化療和放療）治療手段之一。經(jīng)典的化療藥物（細(xì)胞毒類藥物及對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接殺傷作用的藥物）的研究大致起步于20世紀(jì)三、四十年代。第15頁(yè)/共70頁(yè)161.3抗腫瘤藥物研究的歷史概要具有重要意義腫瘤化療藥物的內(nèi)容：1946年研制成功烷化劑類抗腫瘤藥物噻替哌、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥。（耶魯大學(xué)Glman等人，后于1958年德國(guó)研制成功另一個(gè)烷化劑環(huán)磷酰胺）1947年研制成功抗代謝藥物甲氨喋呤、6-巰基嘌呤。（HitchingsandElion，并以此而獲得1998年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，后又陸續(xù)研制成功5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷等）第16頁(yè)/共70頁(yè)171.3抗腫瘤藥物研究的歷史概要1954年研制成功第一個(gè)抗生素類抗腫瘤藥物放線菌素-D（Farber，亦稱更生霉素，后又分別研制成功絲裂霉素、博來(lái)霉素、阿霉素等）1955年植物中分離得到第一個(gè)天然藥物有效成分并使之成為抗腫瘤藥物——長(zhǎng)春花堿和長(zhǎng)春新堿。（加拿大的Noble和美國(guó)Lilly公司的Johnson，后又研制成功三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿、喜樹堿、紫杉醇、VP-16等）1965年成功研制抗腫瘤藥物順鉑。（Rosenberg，后又研制成功卡鉑等）第17頁(yè)/共70頁(yè)182.樣品抗腫瘤活性的確證（一）

——體內(nèi)篩選實(shí)驗(yàn)經(jīng)典的體內(nèi)、體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)是其它腫瘤學(xué)基礎(chǔ)研究以及抗腫瘤藥物作用機(jī)制研究的基礎(chǔ)?？鼓[瘤藥物體內(nèi)篩選評(píng)價(jià)的基本原理是：首先建立腫瘤的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，在成功建立腫瘤動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，給以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行抗腫瘤治療，最后通過(guò)觀察治療效果對(duì)藥物的有效性、安全性以及作用特點(diǎn)做出正確的評(píng)價(jià)。第18頁(yè)/共70頁(yè)192.1概述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤模型根據(jù)獲取腫瘤組織的不同，可以分為自發(fā)性腫瘤、誘發(fā)性腫瘤以及移植性腫瘤。自發(fā)性腫瘤的特點(diǎn)是病程于人類腫瘤發(fā)生最為接近，發(fā)病年齡很大，發(fā)生率盡管很高，但是大多不能夠達(dá)到百分之百。動(dòng)物品系腫瘤組織類型發(fā)生率月齡C3HDBA/1AAKRPBAC57BL…乳腺癌乳腺癌肺瘤（癌）淋巴細(xì)胞性白血病淋巴瘤網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤…99%75%90%91%100%74.5%…7.2>12>18108.714…小鼠常見高自發(fā)性腫瘤舉例第19頁(yè)/共70頁(yè)202.1概述誘發(fā)性腫瘤的因素主要包括化學(xué)因素（例如各種化學(xué)物質(zhì)、毒素等）、物理因素（如放射線）和生物因素（如病毒）。誘發(fā)腫瘤的方法包括口服法、注射法、涂抹法、植入法、輻照法等。誘癌物方法動(dòng)物腫瘤類型甲基膽蒽甲基芐基亞硝胺4-二甲基氨基偶氮苯黃曲霉毒素B1二乙基亞硝胺苯并芘+三氧化鐵二亞硝基哌嗪植入（棉線穿入）灌胃飼喂飼喂皮下注射氣管灌注皮下注射小鼠小鼠大鼠大鼠小鼠倉(cāng)鼠大鼠食管癌胃癌肝癌肝癌肺癌肺癌鼻咽癌常見的動(dòng)物誘發(fā)腫瘤模型舉例第20頁(yè)/共70頁(yè)212.1概述誘發(fā)腫瘤的特點(diǎn)是基本符合人類腫瘤發(fā)病的過(guò)程，造模時(shí)間較長(zhǎng)，發(fā)病率接近100%，但是，腫瘤組織類型較為復(fù)雜（不單純，各種組織類型或各部器官的腫瘤同時(shí)存在于一只動(dòng)物體內(nèi)或一群動(dòng)物不同個(gè)體內(nèi)）。動(dòng)物移植性腫瘤來(lái)自于自發(fā)或誘法的腫瘤，經(jīng)過(guò)體內(nèi)傳代培育而成的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤模型。它的特點(diǎn)是腫瘤接種的成功率為100%，可在同一時(shí)間內(nèi)獲得大量生長(zhǎng)均勻的腫瘤，腫瘤組織學(xué)類型單純，接種腫瘤的動(dòng)物成模時(shí)間短，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)藥物的生物活性做出評(píng)價(jià)。一般而言，藥物抗腫瘤活性的篩選主要選擇使用移植性腫瘤模型第21頁(yè)/共70頁(yè)222.2動(dòng)物的選擇及腫瘤接種2.2.1動(dòng)物的選擇動(dòng)物的選擇中主要包括動(dòng)物的種類、品系、體重、性別等。（1）種類使用較多的是小鼠和大鼠，而小鼠的使用占有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。（2）品系根據(jù)腫瘤（瘤株）的不同選擇不同品系的動(dòng)物。第22頁(yè)/共70頁(yè)23不同瘤株對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系的要求腫瘤名稱與類型代號(hào)所需動(dòng)物（宿主）艾氏腹水癌肝癌腹水型肉瘤180肉瘤180腹水型宮頸癌肺癌肺癌乳腺癌黑色素瘤白血病白血病白血病癌肉瘤EACHepAS180S180AU14LewisLA795MA737B16L615P388L1210W256昆明種小白鼠或其它種系小白鼠同上同上同上同上C57BL/6小鼠AT739小鼠津白Ⅱ小鼠C57BL/6小鼠615小白鼠DBA/2小白鼠同上Wister大白鼠或其它種系大白鼠第23頁(yè)/共70頁(yè)242.2動(dòng)物的選擇及腫瘤接種（3）體重小鼠的體重18至22克，具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，體重最好控制在1克以內(nèi)（實(shí)際工作中一般為±1克）。大鼠的體重應(yīng)該在50至100克。具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，體重最好控制在5克之內(nèi)（實(shí)際工作中一般為±5克）。（4）性別動(dòng)物的性別一般沒(méi)有特別的要求，某些特殊的腫瘤，例如乳腺癌、卵巢癌等則考慮使用雌性動(dòng)物。第24頁(yè)/共70頁(yè)252.2動(dòng)物的選擇及腫瘤接種2.2.2移植瘤的接種（腫瘤的移植）（1）接種的一般要求。在無(wú)菌條件下完成接種的實(shí)驗(yàn)操作。腫瘤組織的污染往往是腫瘤接種失敗的主要原因，所以應(yīng)該特別引起注意。（2）實(shí)體瘤瘤塊的制備（瘤塊接種法）。7至10天的荷瘤動(dòng)物，腫瘤生長(zhǎng)及動(dòng)物生長(zhǎng)狀況良好。切取腫瘤組織，剪成2至3立方毫米的小塊，塞入套管針中，接種于動(dòng)物的右側(cè)腋窩皮下，從腫瘤組織取出至接種完畢應(yīng)該在30分鐘內(nèi)完成。（3）瘤細(xì)胞懸液的制備（細(xì)胞懸液接種法）取出的腫瘤組織剪成小塊，放入玻璃的組織勻漿器中，按照腫瘤組織（g）﹕生理鹽水（mL）=1﹕3~1﹕4。制備細(xì)胞懸液，按照0.2mL/只進(jìn)行接種。全部操作的時(shí)間控制在30分鐘之內(nèi)。第25頁(yè)/共70頁(yè)262.2動(dòng)物的選擇及腫瘤接種（4）腹水型腫瘤細(xì)胞懸液的制備（腹水型瘤源接種法）主要操作包括①抽取腹水。②細(xì)胞計(jì)數(shù)，載玻片推片，瑞氏或基姆薩染色，分類計(jì)數(shù)，要求腫瘤細(xì)胞數(shù)的比例不小于95%。將腹水用生理鹽水稀釋10~100倍，以拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞的比例，要求活細(xì)胞數(shù)不少于95%。③接種，將稀釋好的腹水細(xì)胞懸液接種于動(dòng)物的腹腔（0.1~0.2mL/只）或接種于皮下（0.2mL/只），全部操作（取出腹水至腫瘤接種完畢）要求在60分鐘內(nèi)完成。（5）白血病株的接種腹水型的白血病例如L1210和P388的接種方法與腹水型腫瘤的接種方法相同。L615小鼠白血病的接種方法是：①摘取脾臟，制備組織勻漿；②細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為4×107個(gè)/mL；③接種，每只動(dòng)物皮下接種細(xì)胞懸液0.1~0.2mL。第26頁(yè)/共70頁(yè)272.3移植性動(dòng)物腫瘤的質(zhì)量鑒定（1）每年進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤株的組織學(xué)檢查。（2）定期進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)，以鑒別污染情況。（3）腫瘤生長(zhǎng)潛力的檢查。第27頁(yè)/共70頁(yè)28下述情況判斷為腫瘤生長(zhǎng)不良：①實(shí)體瘤小鼠20%的腫瘤重量小于0.4克，或平均瘤重小于1克；大鼠腫瘤平均重量小于2克。②腹水型腫瘤荷瘤動(dòng)物生存期超出范圍（不同腫瘤生存期不同）仍然存活；經(jīng)過(guò)一定的稀釋接種之后無(wú)腫瘤生長(zhǎng)。（4）瘤株相容性的鑒別（5）死亡分析（5）陽(yáng)性對(duì)照藥品對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用考察動(dòng)物移植腫瘤對(duì)臨床常用化療藥物的敏感性，觀察腫瘤細(xì)胞是否出現(xiàn)耐藥。第28頁(yè)/共70頁(yè)29附表：臨床常用化療藥物對(duì)動(dòng)物移植腫瘤的敏感性

藥物名稱P388L1210S180AEACL615ESCS180HepB16U14W256米妥蒽醌5-氟尿嘧啶阿糖胞苷環(huán)磷酰胺秋水仙堿長(zhǎng)春新堿喜樹堿鈉絲裂霉素阿霉素紫杉醇順鉑＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋±＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—＋＋＋＋＋＋＋±＋＋＋＋＋＋＋＋±＋－＋＋＋±—＋±＋＋＋＋＋＋＋±——＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋±＋＋————＋＋＋—＋＋＋＋＋第29頁(yè)/共70頁(yè)302.4待篩樣品的制備樣品制備過(guò)程中應(yīng)該注意的問(wèn)題：①對(duì)于化學(xué)性能不穩(wěn)定的樣品一定要新鮮配置，對(duì)于化學(xué)性能是否穩(wěn)定不清的樣品應(yīng)該按照不穩(wěn)定來(lái)處理。②對(duì)于水溶性較差的樣品應(yīng)該采用某些助溶劑盡可能使其溶解成為真溶液，特別是給藥途徑為注射給藥時(shí)。灌胃給藥者可以配制成混懸液。選擇溶解方法時(shí)應(yīng)該考慮對(duì)機(jī)體不應(yīng)產(chǎn)生不良反應(yīng)。③在實(shí)驗(yàn)室中配置好的樣品一般均為4℃（冰箱）保存。④生物制劑樣品一般均需要低溫保存，同時(shí)還要避免反復(fù)凍融，因此，樣品配制過(guò)程中應(yīng)該考慮進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆盅b。⑤需要避光保存的樣品因該使用棕色器皿。第30頁(yè)/共70頁(yè)312.5劑量的選擇、動(dòng)物分組及數(shù)量2.5.1劑量的選擇為了對(duì)樣品的生物活性做出十分客觀的評(píng)價(jià)，就必須保證在篩選實(shí)驗(yàn)中劑量要給足，對(duì)于細(xì)胞毒類藥物一般是最大耐受劑量（動(dòng)物可以耐受的，不至產(chǎn)生明顯毒性反應(yīng)的劑量）。給藥劑量的設(shè)計(jì)一般有以下幾種方法：（1）依據(jù)樣品的毒性資料設(shè)計(jì)給藥劑量如果已知樣品的LD50可以考慮使用1/3~1/5的LD50作為給藥劑量（1次/日），或者以LD5或LD10作為給藥劑量。如果不知道樣品的LD50，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)摸索，找到可至動(dòng)物全部死亡的最小劑量和可使動(dòng)物全部存活的最大劑量。以可至部分動(dòng)物死亡的劑量的1/5~1/3或1/10~1/5作為治療劑量。應(yīng)該注意的是，細(xì)胞毒類藥物的致死作用往往表現(xiàn)的很遲緩，因此，給藥后觀察的時(shí)間要夠長(zhǎng)，至少要觀察1周。樣品本身毒性很小，無(wú)法測(cè)定其致死劑量時(shí)。采取最大濃度藥液的最大允許給藥容積給藥。第31頁(yè)/共70頁(yè)32大、小鼠各種途徑最大允許給藥容積供參考，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中可有差異。若注射劑為油劑時(shí)，容積均為0.2mL。動(dòng)物各種途徑最大允許給藥容積（單位：mL）igipsc小鼠（20g）大鼠（100g）0.83.01.03.01.03.0第32頁(yè)/共70頁(yè)332.5劑量的選擇、動(dòng)物分組及數(shù)量（2）結(jié)合篩選（預(yù)）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給藥劑量合成藥物或天然藥物提取成分可以考慮先試用500mg/kg的劑量，療程結(jié)束時(shí)，若動(dòng)物死亡率超過(guò)34%，并且沒(méi)有見到明確的抗腫瘤活性，則認(rèn)為該藥沒(méi)有繼續(xù)實(shí)驗(yàn)的價(jià)值，停止實(shí)驗(yàn)。若見到抗腫瘤效果但動(dòng)物死亡超過(guò)34%，則可按照下表減低劑量，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。第33頁(yè)/共70頁(yè)34確定動(dòng)物治療劑量簡(jiǎn)表動(dòng)物死亡率（%）下一步實(shí)驗(yàn)劑量0~3435~7576~100100（24小時(shí)之內(nèi)）不變乘以0.5乘以0.25乘以0.2第34頁(yè)/共70頁(yè)35常用化療藥物的LD50、LD10及實(shí)驗(yàn)參考給藥劑量藥物名稱LD50（mg/kg）LD10（mg/kg）單次劑量（mg/kg·d）米妥蒽醌5-氟尿嘧啶環(huán)磷酰胺秋水仙堿長(zhǎng)春新堿喜樹堿鈉絲裂霉素C阿霉素紫杉醇順鉑卡鉑15（iv）1854722.36.56.88.4（iv×5）14.2131.592.62.021.959104.051、1.5、2、315、20、258、20、30、50、100、1500.3、0.4、1、20.1、0.2、1、2.20.6、1、4、81、1.5、21.25、1.5、2、2.52.6、4.3、7.2、120.5、1、210、20、30第35頁(yè)/共70頁(yè)362.5劑量的選擇、動(dòng)物分組及數(shù)量（3）給藥次數(shù)的確定一般給藥次數(shù)多為每日一次，連續(xù)7~10天，但是根據(jù)具體情況也可以調(diào)整為間隔給藥或每日多次給藥。第36頁(yè)/共70頁(yè)372.5劑量的選擇、動(dòng)物分組及數(shù)量2.5.2動(dòng)物分組一般篩選實(shí)驗(yàn)主要設(shè)立對(duì)照組（給予生理鹽水），不同劑量的各給藥組，陽(yáng)性藥品對(duì)照組。必要的時(shí)候還要設(shè)置賦形劑（溶媒）對(duì)照組。除對(duì)照組之外，一般每組動(dòng)物數(shù)為8~10只，如果選擇近交系小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，由于近交系動(dòng)物的遺傳特點(diǎn)，可以適當(dāng)減少動(dòng)物每組數(shù)量，例如每組6~8只。對(duì)照組的動(dòng)物數(shù)量應(yīng)該多于實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組的動(dòng)物數(shù)可以根據(jù)下述公式進(jìn)行計(jì)算：對(duì)照組動(dòng)物數(shù)=試驗(yàn)組動(dòng)物數(shù)×(組數(shù))1/2

動(dòng)物分組應(yīng)該按照隨機(jī)的原則，另外需要注意的是，如無(wú)特殊要求或?qū)嶒?yàn)處理，荷瘤動(dòng)物的分組應(yīng)該在動(dòng)物全部接種完畢后進(jìn)行。第37頁(yè)/共70頁(yè)382.6療效評(píng)價(jià)（1）實(shí)體瘤療效的評(píng)價(jià)依據(jù)給藥方案的不同，可于停藥后次日（給藥7~10次）或停藥后數(shù)日（例如單次給藥），估計(jì)對(duì)照組動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)良好（依腫瘤類型不同，一般在腫瘤接種后1~2周）時(shí)，處死動(dòng)物。先稱取體重，后解剖皮下瘤塊，稱取腫瘤重量。出現(xiàn)下述情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)判斷為無(wú)效，需要重新試驗(yàn)：①對(duì)照組小鼠平均瘤重小于1克，或20%小鼠瘤重小于0.4克；大鼠腫瘤平均瘤重小于2克。均表示腫瘤生長(zhǎng)不良。②治療期間，給藥組動(dòng)物死亡超過(guò)20%，或平均體重（去除腫瘤后）下降（自身對(duì)照）超過(guò)15%者，提示藥物毒性反應(yīng)。第38頁(yè)/共70頁(yè)392.6療效評(píng)價(jià)實(shí)體瘤的療效以瘤重抑制百分率（腫瘤生長(zhǎng)抑制率）表示，其計(jì)算公式如下：腫瘤生長(zhǎng)抑制率=（1－T/C）×100%T：治療組平均腫瘤重量。C：對(duì)照組平均腫瘤重量根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般認(rèn)為天然產(chǎn)物（中草藥）提取物（粗提物）的腫瘤生長(zhǎng)抑制率超過(guò)30%，合成藥物的腫瘤生長(zhǎng)抑制率超過(guò)40%，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為該樣品具有一定的價(jià)值，可以繼續(xù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)（兩次），若結(jié)果穩(wěn)定，則判斷該樣品具有抗腫瘤活性。第39頁(yè)/共70頁(yè)402.6療效評(píng)價(jià)（2）腹水型腫瘤的療效評(píng)價(jià)一般在給藥治療結(jié)束后次日開始逐日稱取每只動(dòng)物的體重并紀(jì)錄，對(duì)照組動(dòng)物通常在2~3周內(nèi)全部死亡，個(gè)別存活時(shí)間過(guò)長(zhǎng)者需要將其剔除，這時(shí)，其它所有實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)物均需相應(yīng)的剔除。出現(xiàn)下述情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)判斷為無(wú)效，需要重新試驗(yàn)：①治療期間對(duì)照組動(dòng)物在7天之內(nèi)死亡率大于或等于20%，表示試驗(yàn)失敗。②對(duì)照組動(dòng)物存活4周以上者超過(guò)或等于20%，亦表示試驗(yàn)失敗。第40頁(yè)/共70頁(yè)412.6療效評(píng)價(jià)腹水型腫瘤的療效評(píng)價(jià)以動(dòng)物生命延長(zhǎng)率表示，生命延長(zhǎng)率的計(jì)算公式如下：生命延長(zhǎng)率=（T/C－1）×100%T：治療組平均生存時(shí)間C：對(duì)照組平均生存時(shí)間（注：治療組動(dòng)物觀察時(shí)間為60天，存活時(shí)間超過(guò)60天者，按照60天計(jì)算。）一般認(rèn)為，非腹腔給藥時(shí)，生命延長(zhǎng)率超過(guò)50%，或者腹腔給藥時(shí)，生命延長(zhǎng)率超過(guò)75%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)具有顯著型差異，則該樣品可能具有進(jìn)一步試驗(yàn)的價(jià)值，需要繼續(xù)重復(fù)試驗(yàn)。連續(xù)3次，療效穩(wěn)定者，則判斷該樣品具有抗腫瘤的活性。第41頁(yè)/共70頁(yè)422.6療效評(píng)價(jià)（3）白血病的療效評(píng)價(jià)基本上與腹水型腫瘤的療效評(píng)價(jià)相同，以生命延長(zhǎng)率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。（4）抗腫瘤藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)的三段式序貫設(shè)計(jì)為了降低試驗(yàn)成本，可根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，采用三段式序貫設(shè)計(jì)。如果某一樣品能夠順利通過(guò)三階段試驗(yàn)所規(guī)定的療效標(biāo)準(zhǔn)，則可判斷為該樣品具有抗腫瘤活性，否則將被淘汰。三段式序貫設(shè)計(jì)對(duì)于實(shí)體瘤而言，以腫瘤的重量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算T/C的比值，即治療組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重。對(duì)于腹水型腫瘤或白血病而言，以動(dòng)物的存活時(shí)間（天數(shù)）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，那么T/C的含義就是治療組動(dòng)物平均生存天數(shù)/對(duì)照動(dòng)物平均生存天數(shù)，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇繼續(xù)試驗(yàn)還是淘汰的要求見下表：第42頁(yè)/共70頁(yè)43序貫試驗(yàn)之實(shí)體瘤治療/對(duì)照比值表合成化合物天然產(chǎn)物放棄繼續(xù)放棄繼續(xù)第一次試驗(yàn)（T/C）＞0.54＜0.54＞0.45＜0.45最初二次試驗(yàn)（T/C）1×（T/C）2乘積＞0.2乘積＜0.2乘積＞0.2乘積＜0.2最初三次試驗(yàn)（T/C）1×（T/C）2（T/C）3乘積＞0.08乘積＜0.08如果以生存時(shí)間來(lái)表示：第一次試驗(yàn)（T/C）大于或等于1.25；最初二次試驗(yàn)（T/C）1×（T/C）2大于或等于1.56；合成化合物與天然產(chǎn)品均等同。第43頁(yè)/共70頁(yè)442.7瘤株的選擇2.7.1常用瘤株的介紹常見動(dòng)物移植性腫瘤瘤株名稱代號(hào)來(lái)源與類型艾氏腹水癌肉瘤180白血病P388Lewis肺癌結(jié)腸癌26瓦克256吉田肉瘤M5076肉瘤EACS180P388W256M5076小鼠自發(fā)性乳腺癌。雄性小鼠腋窩部多形型細(xì)胞肉瘤。甲基膽蒽涂抹小鼠誘發(fā)的淋巴細(xì)胞白血病。小鼠自發(fā)的肺部未分化上皮樣癌。N-甲基-N-亞硝基烏拉坦誘發(fā)的小鼠腺癌。懷孕大白鼠乳腺部位的自發(fā)腫瘤。氨基偶氮苯與砷化鉀誘導(dǎo)大鼠陰囊部腫瘤。雌性小鼠卵巢自發(fā)的纖維肉瘤。第44頁(yè)/共70頁(yè)452.7瘤株的選擇2.7.2瘤株的選擇用一種模型去篩選各種不同類型的新藥，顯然是不恰當(dāng)?shù)?，因?yàn)楦鞣N動(dòng)物的移植瘤對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性是不同的。篩選烷化劑可選用吉田肉瘤、W256；篩選抗代謝藥物時(shí)，可以用S180、L615及L1210；篩選天然產(chǎn)物抗腫瘤藥物可選用P388、L615、EAC、U14等。一般認(rèn)為，初篩時(shí)應(yīng)該選擇三種組織類型不同的腫瘤，即肉瘤（實(shí)體瘤）、腹水性腫瘤和白血病。第45頁(yè)/共70頁(yè)462.8舉例一份完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告中要包括樣品名稱、批號(hào)、來(lái)源、給藥方案、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)人、試驗(yàn)操作人、報(bào)告審核人、所用的瘤株及試驗(yàn)日期。報(bào)告實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括：實(shí)驗(yàn)開始與結(jié)束時(shí)的動(dòng)物數(shù)量，動(dòng)物體重，重瘤重量（生存時(shí)間）等。第46頁(yè)/共70頁(yè)47舉例——某些樣品對(duì)小鼠肝癌HepS生長(zhǎng)抑制作用篩選試驗(yàn)的結(jié)果樣品名稱(組別)動(dòng)物數(shù)（只）動(dòng)物體重（g，X±S）腫瘤重量（g，X±S）抑瘤率（%）P值試驗(yàn)開始試驗(yàn)結(jié)束試驗(yàn)開始試驗(yàn)結(jié)束生理鹽水樣品A樣品B樣品C樣品D141010101012101081021.08±1.0021.20±1.1421.09±1.0021.09±0.9421.16±0.9527.95±3.6825.15±2.3127.52±2.2217.94±1.6826.24±3.262.76±0.690.55±0.382.03±0.370.23±0.172.45±0.46—80.0726.4591.6711.23—＜0.001＜0.01＜0.001＞0.05樣品名稱：批號(hào)：來(lái)源：給藥方案（劑量、途徑、次數(shù)）：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：試驗(yàn)操作：報(bào)告審核試驗(yàn)日期：年月日至年月日第47頁(yè)/共70頁(yè)482.9人體腫瘤裸鼠異種移植動(dòng)物模型（1）原理裸鼠又稱無(wú)胸腺小鼠，具有以下4個(gè)特點(diǎn)：①先天性胸腺缺如；②胸腺依賴性免疫功能缺乏，其T細(xì)胞功能接近于零，但B細(xì)胞功能大致接近正常；③人體腫瘤異種移植時(shí)無(wú)排斥反應(yīng)，故可供人體腫瘤移植。且腫瘤移植后保持其原有的功能，組織形態(tài)，免疫學(xué)特點(diǎn)以及染色體組型和對(duì)抗腫瘤藥物原有的敏感性。④裸鼠因皮膚裸露，操作方便，易于動(dòng)態(tài)觀察腫瘤的生長(zhǎng)。（2）方法可以選擇已經(jīng)建株的人的腫瘤細(xì)胞，也可以選擇新鮮的腫瘤組織，為了方便起見，以選用前者為最多見，移植材料可以來(lái)自生長(zhǎng)于裸鼠的腫瘤瘤塊，也可以來(lái)自經(jīng)過(guò)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞懸液，前者按照瘤塊接種法接種，后者用細(xì)胞懸液接種法接種。待腫瘤明顯生長(zhǎng)（大約超過(guò)100mg）后分組給藥。第48頁(yè)/共70頁(yè)492.9人體腫瘤裸鼠異種移植動(dòng)物模型（3）評(píng)價(jià)與小鼠實(shí)體腫瘤評(píng)價(jià)方法相同，以腫瘤生長(zhǎng)抑制率表示。（4）注意事項(xiàng)使用人體腫瘤異種移植模型應(yīng)該注意以下事項(xiàng)：①目前認(rèn)為人體裸鼠異種移植模型對(duì)抗腫瘤藥物的反應(yīng)與臨床上的治療反應(yīng)基本平行，對(duì)臨床療效有較好的預(yù)告價(jià)值；②裸鼠飼養(yǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格，繁殖比較困難，試驗(yàn)成本昂貴；③裸鼠對(duì)藥物毒性的敏感性與普通小鼠相似。第49頁(yè)/共70頁(yè)503樣品抗腫瘤活性的確證（二）

——體外篩選實(shí)驗(yàn)抗腫瘤藥物的體外篩選試驗(yàn)（細(xì)胞試驗(yàn)）是一種重要的藥物篩選手段。它具有快速、靈敏、所需樣品節(jié)省、實(shí)驗(yàn)成本低等特點(diǎn)。如果樣品可以和腫瘤細(xì)胞直接接觸而發(fā)揮作用其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床的治療效果會(huì)有較好的符合性?？鼓[瘤藥物的篩選研究中細(xì)胞試驗(yàn)的內(nèi)容非常豐富的，已經(jīng)培育了大量的的腫瘤細(xì)胞株，。這一特點(diǎn)也取決于腫瘤細(xì)胞本身所固有的生物學(xué)特性——腫瘤細(xì)胞的“不死性”。第50頁(yè)/共70頁(yè)513.1原理與基本操作要點(diǎn)3.1.1實(shí)驗(yàn)原理采用組織培養(yǎng)技術(shù)，可以在體外條件下建立具有不死性的、可以無(wú)限傳代的腫瘤細(xì)胞系。應(yīng)用這些腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行抗腫瘤藥物的篩選實(shí)驗(yàn)及作用機(jī)制的探討，發(fā)現(xiàn)新的活性物質(zhì)，是藥物研究的重要手段。腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)技術(shù)操作的主要內(nèi)容就是細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，它們包括細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代和保存。第51頁(yè)/共70頁(yè)523.1原理與基本操作要點(diǎn)3.1.2基本操作要點(diǎn)（1）腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)①嚴(yán)格無(wú)菌操作，污染是細(xì)胞培養(yǎng)失敗的首要原因。必要時(shí)可以使用抗菌素，常用的抗菌素是青霉素與鏈霉素。②適宜的溫度。一般均為37℃。③適宜的酸堿度。應(yīng)將pH控制在7.0～7.4的中性范圍內(nèi)。④提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)條件。以合成培養(yǎng)基和小牛血清（或胎牛血清）按照一定比例混合后使用。不同的腫瘤細(xì)胞所需的培養(yǎng)基可能是不同的。第52頁(yè)/共70頁(yè)53不同腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求舉例代號(hào)組織類型所需培養(yǎng)基MELHL-60K562MCF-7A549小鼠紅白血病人早幼粒性白血病人慢粒性白血病人乳腺癌人非小細(xì)胞肺癌HamsF12，也可用MEM、164016401640MEM或1640DulbeccoMEM第53頁(yè)/共70頁(yè)543.1原理與基本操作要點(diǎn)（2）腫瘤細(xì)胞的傳代腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)一定的時(shí)間后，將逐漸占據(jù)整個(gè)培養(yǎng)空間，這時(shí)候就需要傳代，以免因生存空間不足或細(xì)胞密度過(guò)大引起營(yíng)養(yǎng)枯竭而影響細(xì)胞生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞因其組織類型或組織來(lái)源不同，具有貼附性生長(zhǎng)（貼壁生長(zhǎng)）和懸浮性生長(zhǎng)兩種狀態(tài)，前者主要見于上皮及間質(zhì)性來(lái)源的細(xì)胞，后者主要見于白血病來(lái)源的細(xì)胞。貼壁性生長(zhǎng)的細(xì)胞與懸浮性生長(zhǎng)的細(xì)胞傳代與培養(yǎng)的操作有所不同，其最大的差別在于，前者在操作中需要使用消化液（胰蛋白酶或EDTA）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，使其脫壁。后者則無(wú)需此步操作。第54頁(yè)/共70頁(yè)553.1原理與基本操作要點(diǎn)（3）腫瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇細(xì)胞冷凍保存是將細(xì)胞凍存在液態(tài)氮中，溫度達(dá)-196℃，其貯存時(shí)間幾乎是無(wú)限的。細(xì)胞凍存與復(fù)蘇操作的技術(shù)要點(diǎn)有：①細(xì)胞凍存復(fù)蘇的基本原則是“慢凍快融”。②凍存應(yīng)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增殖旺盛的細(xì)胞。③凍存時(shí)應(yīng)加入細(xì)胞保護(hù)劑DMSO（二甲基亞砜）或甘油。細(xì)胞中加入這些保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低，使得凍結(jié)前細(xì)胞內(nèi)水分透出細(xì)胞外，減少冰晶形成，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。④凍存的細(xì)胞最好每年復(fù)蘇一次，以保證細(xì)胞活力。第55頁(yè)/共70頁(yè)563.2常用的腫瘤細(xì)胞株介紹常用腫瘤細(xì)胞株概要

細(xì)胞株名稱來(lái)源生物學(xué)特點(diǎn)研究應(yīng)用MEL紅白血病細(xì)胞HL-60白血病細(xì)胞K562白血病細(xì)胞WEHI-3B白血病細(xì)胞B-16黑色素瘤細(xì)胞A2780卵巢癌細(xì)胞MCF-7乳腺癌細(xì)胞KB口腔癌細(xì)胞A549肺癌細(xì)胞HT1080纖維肉瘤細(xì)胞3T3-L1成纖維細(xì)胞NB4白血病細(xì)胞DBA/2小鼠白血病人白血病人BALB/C小鼠C57BL/6小鼠卵巢癌病人乳腺癌病人口腔癌病人肺癌病人纖維肉瘤病人3T3-小鼠白血病人懸浮培養(yǎng)，小細(xì)胞，球狀基本為二倍體，有染色體異常細(xì)胞較大，酸性磷酸酶陽(yáng)性，基本為三倍體，Ph’染色體陽(yáng)性培養(yǎng)條件不適可影響分化誘導(dǎo)的敏感性，密度高過(guò)會(huì)自分化高、低密度時(shí)細(xì)胞形態(tài)有變化，可移植到動(dòng)物體內(nèi)對(duì)阿霉素及苯丙氨酸氮芥敏感上皮樣生長(zhǎng)單層上皮樣生長(zhǎng)上皮樣生長(zhǎng)上皮樣生長(zhǎng)，倍增時(shí)間較長(zhǎng)，26小時(shí)非典型的腫瘤細(xì)胞，達(dá)到飽和濃度時(shí)有接觸性抑制具有人早幼粒細(xì)胞白血病所特有的、典型的染色體異常分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，耐藥分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)分化誘導(dǎo)或細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)細(xì)胞殺傷及耐藥實(shí)驗(yàn)細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)細(xì)胞殺傷及抗侵襲實(shí)驗(yàn)分化誘導(dǎo)或細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)第56頁(yè)/共70頁(yè)573.3抗腫瘤藥物體外篩選的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（1）細(xì)胞種類的選擇 樣品初篩時(shí)應(yīng)該注意三點(diǎn)：①兼顧選擇使用動(dòng)物（小鼠）腫瘤與人的腫瘤細(xì)胞；②篩選實(shí)驗(yàn)以快速生長(zhǎng)的細(xì)胞為主；③兼顧選擇使用貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞與懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞。MTT法由于具有微量、快速、靈敏的特點(diǎn)，已經(jīng)成為樣品初篩使用最多的方法，而這種方法比較適宜生長(zhǎng)快速的細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)過(guò)2~4天的培養(yǎng)，即可分析結(jié)果，因此目前主張生長(zhǎng)速度較慢的細(xì)胞放到體內(nèi)復(fù)篩實(shí)驗(yàn)中。第57頁(yè)/共70頁(yè)583.3抗腫瘤藥物體外篩選的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（2）待篩樣品的濃度根據(jù)工作經(jīng)驗(yàn)，一般認(rèn)為，對(duì)于化學(xué)合成物或天然產(chǎn)物的提取物初篩時(shí)可以選擇100、10、1μg/mL三個(gè)濃度；對(duì)于粗制發(fā)酵液則可采用1﹕10、1﹕100、1﹕1000三個(gè)稀釋度。測(cè)定ED50或IC50時(shí)，至少應(yīng)該設(shè)置5個(gè)濃度，濃度間隔可采用等比間隔，例如：1、2、4、8、16或0.01、0.1、1、10、100。如果知道化合物的分子量，可以使用克分子濃度表示，美國(guó)NCI現(xiàn)用的濃度為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。（3）樣品與細(xì)胞相互作用的時(shí)間目前常見的樣品與細(xì)胞相互孵育的時(shí)間有1小時(shí)和24小時(shí)以及持續(xù)作用3~7天等。在實(shí)際工作中，為了保證有活性的樣品不被落篩，所以可以考慮初篩時(shí)采用持續(xù)藥物作用，初篩通過(guò)的樣品可以進(jìn)一步觀察其時(shí)-效關(guān)系。第58頁(yè)/共70頁(yè)59（4）實(shí)驗(yàn)體系中的細(xì)胞密度（數(shù)量）NCI抗腫瘤藥物篩選部分人腫瘤細(xì)胞株接種密度（MTT法）細(xì)胞株細(xì)胞/孔（×103）細(xì)胞株細(xì)胞/孔（×103）肺癌NCI-H23NCI-H460NCI-H522A549/ATCC腎癌UO-31SN12C結(jié)腸癌HT-29HCC2998SOLO205KM20L2HCT-1162051510201551015105黑色素瘤LOXMV1SK-MEL-2CNS腫瘤SNB-19SNB-75U251卵巢癌OVCAR-3SK-OV-3白血病CCRF-CEMK562HL-6052015207.5102040520第59頁(yè)/共70頁(yè)603.4常用的評(píng)價(jià)方法3.4.1細(xì)胞拒染法原理亦稱為染料排斥實(shí)驗(yàn)法。活細(xì)胞具有排斥某些染料的能力，而當(dāng)細(xì)胞死亡后，細(xì)胞膜的完整性破壞，細(xì)胞即被著色。實(shí)驗(yàn)室中常用的生物染料有胎盤蘭、伊紅等。通過(guò)計(jì)數(shù)的方法計(jì)算存活與死亡細(xì)胞的數(shù)量，評(píng)價(jià)藥物的活性。評(píng)價(jià)指標(biāo)以活細(xì)胞率與藥物濃度的對(duì)數(shù)作圖，可以畫出S型劑量反應(yīng)曲線，通過(guò)計(jì)算求出LD50（半數(shù)致死濃度）。注意事項(xiàng)①致死性損傷所造成的細(xì)胞膜改變一般多在藥物作用后3～4天才表現(xiàn)出來(lái)，過(guò)早以生物染料處理，可能會(huì)使所得的活細(xì)胞率偏高；②藥物若導(dǎo)致死亡細(xì)胞崩解，會(huì)使細(xì)胞總數(shù)減少，活細(xì)胞數(shù)量相對(duì)增多，從而使得活細(xì)胞率升高。第60頁(yè)/共70頁(yè)613.4常用的評(píng)價(jià)方法3.4.2生長(zhǎng)曲線法原理在最適條件下，腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈指數(shù)性生長(zhǎng)、增殖。取細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間作圖，即縱坐標(biāo)為log細(xì)胞數(shù)，橫坐標(biāo)為時(shí)間（一般用天來(lái)表示），可以得到一條斜率向上的直線。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞密度不斷增加，由于營(yíng)養(yǎng)物的耗竭和代謝產(chǎn)物的積聚，細(xì)胞增長(zhǎng)速度逐漸減慢以致停滯，生長(zhǎng)曲線的斜率逐漸變成水平，此時(shí)達(dá)到高坪期，藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響能夠通過(guò)生長(zhǎng)曲線反映出來(lái)。評(píng)價(jià)指標(biāo)①藥物對(duì)增殖細(xì)胞的殺傷率。②藥物對(duì)細(xì)胞倍增時(shí)間的影響。③藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)飽和密度的影響。注意事項(xiàng)本評(píng)價(jià)方法更加適合用于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，因?yàn)閼腋∨囵B(yǎng)的細(xì)胞可以連續(xù)取樣作細(xì)胞計(jì)數(shù)，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞則需要消化后才能計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，需要作出多份培養(yǎng)。第61頁(yè)/共70頁(yè)623.4常用的評(píng)價(jià)方法3.4.3克隆計(jì)數(shù)法原理亦稱為集落形成法?？寺≡?xì)胞（clonogeniccell）也叫做干細(xì)胞（stemcell），指具有持續(xù)分裂增殖能力的細(xì)胞。腫瘤組織的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)均以克隆原細(xì)胞的增殖為基礎(chǔ)。當(dāng)單個(gè)細(xì)胞連續(xù)分裂6代或以上時(shí)，其后代所組成的群體（集落）便含50個(gè)以上細(xì)胞，當(dāng)在培養(yǎng)物或培養(yǎng)基中接種的細(xì)胞比較稀疏時(shí)，每個(gè)增殖形成的集落彼此不接觸，這樣就可以通過(guò)計(jì)數(shù)對(duì)克隆原細(xì)胞作定量分析。而克隆原細(xì)胞數(shù)能夠反映單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力，因此能夠較為靈敏的檢測(cè)樣品的抗腫瘤活性，克隆計(jì)數(shù)法在抗腫瘤藥物篩選中被認(rèn)為是一種較為敏感的方法。依據(jù)使用中選擇細(xì)胞的不同，克隆計(jì)數(shù)法分為貼壁法和半固體培養(yǎng)基法。第62頁(yè)/共70頁(yè)633.4常用的評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)指標(biāo)①樣品對(duì)癌細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度IC50。②集落細(xì)胞存活曲線法。計(jì)算出反映細(xì)胞對(duì)樣品敏感性的D0值，計(jì)算出反映細(xì)胞損傷修復(fù)能力的n值。注意事項(xiàng)①對(duì)照組集落形成率應(yīng)該在40%～60%左右；②本實(shí)驗(yàn)方法采用的是藥物持續(xù)作用法，所以如果需要觀察測(cè)定樣品作用時(shí)間與活性之間的關(guān)系，可以通過(guò)先用樣品以不同作用時(shí)間處理細(xì)胞，清洗后再作本實(shí)驗(yàn)；③對(duì)于能夠貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞采用普通液體培養(yǎng)就可以，對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，則需要采用半固體瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，所以就本方法而言，更適于篩選貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞。第63頁(yè)/共70頁(yè)643.4常用的評(píng)價(jià)方法3.4.4MTT法這是一個(gè)重要的方法，是目前抗腫瘤藥物篩選甚至其它藥物篩選使用最多的主流方法，這種方法上個(gè)世紀(jì)80年代建立于美國(guó)NCI。原理該方法以代謝還原3-（4，5-dimethythiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazoliumbromide（MTT，四甲基偶氮唑鹽，噻唑蘭）為基礎(chǔ)。活細(xì)胞的線粒體中存在著琥珀酸脫氫酶，該酶可以將黃色的MTT還原成為不溶性的藍(lán)紫色的甲臢(Formazan)顆粒，死細(xì)胞該酶活性喪失，無(wú)法還原MTT，以DMSO溶解甲臢(Formazan)顆粒，而后用酶標(biāo)儀在550nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD）值。第64頁(yè)/共70頁(yè)653.4常用的評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)指標(biāo)①細(xì)胞存活率。先將各測(cè)試孔的OD減去本底OD值（完全培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或減去空白藥物對(duì)照孔OD值（完全培養(yǎng)基加MTT加不同稀釋度的藥物，無(wú)細(xì)胞），而后以加藥組OD值/對(duì)照組OD值（%）表達(dá)細(xì)胞存活率。②半數(shù)有效濃度IC50。依據(jù)不同濃度（梯度）下不同的細(xì)胞存活率計(jì)算出IC50。注意事項(xiàng)①此方法更適于測(cè)定樣品對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞的影響，因?yàn)?，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞使用此法在操作中需要經(jīng)過(guò)離心后吸出上清才能加入DMSO，所以不如貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞方便。②該方法最大的技術(shù)問(wèn)題在于Formazan顆粒的形成不僅與存活的細(xì)胞數(shù)量成比例，同時(shí)還受時(shí)間的影響（一般表現(xiàn)為隨著時(shí)間的推移，藍(lán)紫色加深，OD值增高），所以嚴(yán)格掌握MTT的孵育時(shí)間（加入MTT至測(cè)定的時(shí)間）非常重要。第65頁(yè)/共70頁(yè)663.4常用的評(píng)價(jià)方法3.4.5SRB法該方法系MTT法的改進(jìn)型。原理

SulforhodamineB（硫酰羅丹明，SRB）是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料，粉紅色，可溶于水。SRB能夠與生物大分子中的堿性氨基酸結(jié)合，其在515nm處的讀數(shù)（OD值）與細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，所以可以用作細(xì)胞定量分析。它的基本操作與MTT法相似，先在被測(cè)定的細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入三氯醋酸（TCA），將細(xì)胞固定，固定后的細(xì)胞可以隨時(shí)用于SRB測(cè)定，不受時(shí)間限制。在實(shí)驗(yàn)中除了設(shè)置對(duì)照組（孔）和藥物組（孔）之外，還應(yīng)設(shè)置一個(gè)測(cè)定對(duì)照組（孔），該孔是加入藥物的時(shí)候（在進(jìn)行48至96小時(shí)培