核酸的序列分析課件

第五節(jié)核苷酸序列分析即核酸DNA分子一級結(jié)構(gòu)的測定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項重要的技術(shù)。

1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰島素51個氨基酸的序列測定，這在當時來說是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和MaxamGilbert等人又建立了核酸序列測定的方法，Sanger雙脫氧末端終止法和MaxamGilbert化學(xué)裂解法將核酸序列測定技術(shù)推進到“直讀”階段，使核酸序列測定變得遠比蛋白質(zhì)氨基酸序列測定容易，這樣人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。測序的常用方法1、末端終止法2、化學(xué)裂解法3、DNA測序自動化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相差1個核苷酸的ssDNA，從而完成測序的方法。用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標記，計算機自動讀出。優(yōu)點簡便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對寡核苷酸測序。1、高負荷，1塊膠可測16個樣品；2、機讀不需放射自顯影；3、安全不用同位素；4、簡單迅速。測序過程:1.模板與引物雜交2.引物的延長和合成阻斷四個試管分別加入DNA聚合酶dNTP標記底物終止劑不同ddAddGddCddT四個試管中所有產(chǎn)物是一系列長度只差一個核苷酸的聚合鏈3.電泳4.放射自顯影得到直讀圖象AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG5’3’添加DNApolymerase所有4dNTPs其中一種標記的ddNTPddTTPddCTPddGTPddATP在四個不同的反應(yīng)管中各只包含一種ddNTP.AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG5’3’TTCGATTCGATTTCGATTTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGATreactionCreactionGreactionAreaction每一管中的復(fù)制的序列都停留在ddNTPs處5’反應(yīng)終止后，四個反應(yīng)管中的反應(yīng)混合液分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離.這四個反應(yīng)管中延伸的寡核苷酸僅相差一個堿基.電泳結(jié)構(gòu)通過顯色指示.

TCG

A3’CCTTTAGCT5’5.2Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法

化學(xué)裂解法是Maxam和Gilbert等人1977年創(chuàng)建的，用來測定DNA序列?；瘜W(xué)法是用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定地裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈（等差數(shù)列n=1），經(jīng)過PAGE和放射自顯影后，可以直接讀出DNA的順序。

一、化學(xué)裂解法測序的原理1、用放射性核素標記待測DNA一側(cè)末端2、將標記DNA分為G、A+G、C+T、C4個反應(yīng)體系3、用不同的化學(xué)試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機斷裂DNA片段某種堿基中的任何一個，產(chǎn)生一組一端為放射線標記的末端，另一端為不同大小的DNA片段的混合物4、電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即可讀出DNA序列化學(xué)法讀序

每組測序圖譜為4條垂直的階梯帶，該片從膠底部一個個向頂部讀，G+A和C+T兩列中含有所有相差一個堿基的DNA片段。如果G+A中出現(xiàn)1條帶就看G列中是否有同樣大小的帶，若有即為G堿基，無則為A堿基；同理，C+T中則檢查C列中有無同樣大小條帶，有即為C，無則為T。從單塊凝膠上能得到可靠序列數(shù)量約為200-300bp以內(nèi)化學(xué)裂解法的特點優(yōu)點：1、所測序列直接來源于所測DNA，避免了DNA復(fù)制中錯誤dNTP的摻入。2、可直接對合成的寡核苷酸測序，可分析甲基化修飾等，以及研究DNA的二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用等。缺點：操作復(fù)雜，讀序困難。

DNA自動測序與手工測序的不同點1、標記物不同：手工測序采用放射性核素標記，而自動測序采用4種熒光染料分別標記ddNTP或標記引物2、加樣方式不同：手工測序，一個樣品的4個測序反應(yīng)物分別在不同泳道進行，而自動測序可在一個泳道內(nèi)電泳，提高電泳分析的效率3、檢測手段不同：手工測序采用放射自顯影，從4種寡聚核苷酸的梯子形圖譜中讀出DNA序列，而自動測序則采用激光掃描器同步掃描，計算機進行閱讀和編輯DNA序列測定的自動化

1.DNA測序步驟與自動化1）模板制備可自動化2）定序反應(yīng)可自動化3）凝膠電泳自動化有一定困難：制膠，點樣，電泳，凝膠干燥，放射自顯影。4）核苷酸序列閱讀與計算機輸入可自動化2.自動測序儀Conney等人于1987年設(shè)計了不同熒光染料標記引物，然后做鏈終止測序，用激光掃描閱讀序列。紅色引物+T反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddTTP）黃色引物+G反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddGTP）

綠色引物+A反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddATP）蘭色引物+C反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddCTP）“分子生物學(xué)研究方法”思考題：1、常用的核酸的凝膠電泳是哪兩種？它們分辨DNA片段的范圍有何不同？2、電泳