常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

1常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第1頁(yè)/共89頁(yè)2第一節(jié)光譜分析技術(shù)第二節(jié)電化學(xué)分析第三節(jié)電泳技術(shù)

本章內(nèi)容概要第2頁(yè)/共89頁(yè)3教學(xué)目標(biāo)和要求1、掌握分光光度技術(shù)的基本原理及定性和定量方法。分光光度計(jì)的操作、離子選擇電極的分類和保養(yǎng)、電泳的基本原理、醋酸纖維素薄膜電泳技術(shù)

2、熟悉分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)、離子選擇電極基本原理，離子選擇電極的分析方法3、了解其他光譜分析技術(shù)的基本原理及在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用。第3頁(yè)/共89頁(yè)4第一節(jié)光譜分析技術(shù)分光光度技術(shù)的基本原理分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)分光光度計(jì)的操作方法分光光度技術(shù)的定性和定量方法第4頁(yè)/共89頁(yè)5微粒性(E=hv)

波粒二象性波動(dòng)性(=c/v)E=hv=hc/光的能量與光的波長(zhǎng)成反比，與光的頻率成正比2、光的基本性質(zhì)高速傳播的電磁波第5頁(yè)/共89頁(yè)6一、光譜分析技術(shù)的基本原理：

利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，以此來確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。1、光譜分析技術(shù)分類：發(fā)射光譜分析技術(shù)：火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法

吸收光譜分析技術(shù)：紫外、可見光分光光度法，原子吸收分光光度法和紅外光譜法

散射光譜分析技術(shù)：比濁法

第6頁(yè)/共89頁(yè)73、物質(zhì)對(duì)光吸收的基本原理：能量轉(zhuǎn)移

當(dāng)光輻射通過某種物質(zhì)時(shí)，組成該物質(zhì)的分子（原子）與光子發(fā)生“碰撞”，光子的能量因此轉(zhuǎn)移至分子（原子）上，使它們由基態(tài)(低能態(tài))躍遷到激發(fā)態(tài)(高能態(tài))，這種躍遷稱為激發(fā)。第7頁(yè)/共89頁(yè)8選擇吸收

組成物質(zhì)的分子僅吸收與其內(nèi)能變化(基態(tài)與激發(fā)態(tài)能量差)相對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)或頻率的光，所得到的光譜稱為吸收光譜。

第8頁(yè)/共89頁(yè)9能量釋放

處于較高能態(tài)的分子(激發(fā)態(tài)分子)不穩(wěn)定，當(dāng)其返回基態(tài)時(shí)，以熱或發(fā)射光譜的形式將能量釋放出來。所發(fā)射出的相應(yīng)光譜，稱分子發(fā)射光譜。第9頁(yè)/共89頁(yè)10E1E0吸收光譜發(fā)射光譜激發(fā)態(tài)基態(tài)E1＞E0第10頁(yè)/共89頁(yè)11

（1）根據(jù)產(chǎn)生光譜的物質(zhì)結(jié)構(gòu)原子光譜

(atomicspectrum)

分子光譜

(molecularspectrum)4.分類第11頁(yè)/共89頁(yè)12（2）根據(jù)光譜獲得的方式不同①吸收光譜（Absorptionspectrum）分析法：根據(jù)溶液能吸收由光源發(fā)出的某些波長(zhǎng)的光后所形成的特征光譜來鑒定該物質(zhì)的性質(zhì)和含量的方法。

紫外-可見分光光度法

(ultravioletandvisiblespectrophotometry)

原子吸收光譜法

(atomicabsorptionspectrophotometry)

紅外光譜法

(infraredspectrometry)第12頁(yè)/共89頁(yè)13②發(fā)射光譜(emissionspectrum)分析法：

根據(jù)物質(zhì)受到熱能或電能等的激發(fā)后所發(fā)射出的特征光譜來進(jìn)行定性及定量分析的一種方法。原子發(fā)射光譜法

(atomicemissionphotometry)

分子發(fā)光分析法第13頁(yè)/共89頁(yè)14

1、定義：

根據(jù)被測(cè)物質(zhì)對(duì)各種不同波長(zhǎng)光的吸收能力，繪制吸收曲線，并根據(jù)曲線的特性鑒定物質(zhì)的方法。

屬光譜分析法。二分光光度法第14頁(yè)/共89頁(yè)15可見光：

400~700nm,有色物質(zhì)溶液紫外光：

200~400nm,無(wú)色物質(zhì)第15頁(yè)/共89頁(yè)162、特點(diǎn)：

儀器設(shè)備和操作簡(jiǎn)單費(fèi)用少，分析速度快靈敏度高(10-4~10-7g/mL)

選擇性好精確度和準(zhǔn)確度高第16頁(yè)/共89頁(yè)173、應(yīng)用：（1）定性分析定性鑒定純度鑒定

結(jié)構(gòu)分析（2）定量分析第17頁(yè)/共89頁(yè)18（一）光吸收的基本定律

1、定律：?jiǎn)紊馔ㄟ^吸光溶液后，吸光度與溶液的濃度和厚度之間呈正比關(guān)系。

第18頁(yè)/共89頁(yè)19

（1）Lambert定律：說明吸收與溶液液層厚度間的關(guān)系L1L2入射光透過光入射光透過光L2

＞L1，I1＞I2I0I1I0I2第19頁(yè)/共89頁(yè)20

（2）Beer定律：說明吸收與溶液濃度間的關(guān)系第20頁(yè)/共89頁(yè)21

2、表達(dá)式：

-lgI/Io=-lgT=KLC

A=-lgT=KLC

I/Io為透光率(Transmittance,T)A為吸光度(Absorbance)K為吸光系數(shù)(absorptivity)L為液層厚度

C為溶液濃度(concentration)摩爾吸光系數(shù)ε：當(dāng)溶液層厚度單位為cm，濃度單位為mol/L時(shí)，K即成為摩爾吸光系數(shù)第21頁(yè)/共89頁(yè)22光源單色器樣品室檢測(cè)器顯示1.光源

在整個(gè)紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長(zhǎng)范圍在320～2500nm。紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。（二）分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)第22頁(yè)/共89頁(yè)232.單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長(zhǎng)單色光的光學(xué)系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。第23頁(yè)/共89頁(yè)243.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。4.檢測(cè)器利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號(hào)變成可測(cè)的電信號(hào)，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)檢流計(jì)、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行儀器自動(dòng)控制和結(jié)果處理第24頁(yè)/共89頁(yè)25（三）分光光度計(jì)的類型1.單光束

簡(jiǎn)單，價(jià)廉，適于在給定波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測(cè)器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束自動(dòng)記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測(cè)器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)格較高。第25頁(yè)/共89頁(yè)263.雙波長(zhǎng)

將不同波長(zhǎng)的兩束單色光(λ1、λ2)快速交替通過同一吸收池而后到達(dá)檢測(cè)器。產(chǎn)生交流信號(hào)。無(wú)需參比池?！?1～2nm。兩波長(zhǎng)同時(shí)掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。第26頁(yè)/共89頁(yè)27儀器

可見分光光度計(jì)第27頁(yè)/共89頁(yè)28儀器

紫外-可見分光光度計(jì)第28頁(yè)/共89頁(yè)29Beckman紫外-可見分光光度計(jì)eppendorf紫外-可見分光光度計(jì)第29頁(yè)/共89頁(yè)30（四）分光光度計(jì)的操作方法A.分光光度計(jì)的基本操作以721-A型分光光度計(jì)為例，其基本的操作步驟為：1.開721-A分光光度計(jì)的開關(guān)，將比色池的蓋子打開，通電20分鐘使儀器預(yù)熱。2.將波長(zhǎng)旋至測(cè)定的波長(zhǎng)。3.將空白液、校準(zhǔn)液或待測(cè)液放入比色池，將空白液置于光路中。4.將開關(guān)置于T位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細(xì)調(diào)調(diào)節(jié)T為0.0,關(guān)上比色池蓋子，調(diào)節(jié)T為100.0。5.將開關(guān)置于A，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)A為0.06.重復(fù)步驟4和57.將校準(zhǔn)液或待測(cè)液推入光路，測(cè)量溶液的吸光度（A）第30頁(yè)/共89頁(yè)31B.吸光度的校正

鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計(jì)的吸光度。在25℃，將4mg鉻酸鉀溶于100ml的0.05mol/LKOH中，放入比色池中，在不同波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，與己知的標(biāo)準(zhǔn)吸光度校正表進(jìn)行比較，可檢測(cè)儀器吸光度的準(zhǔn)確度。第31頁(yè)/共89頁(yè)32使用圖示 1.開啟電源，指示燈亮，儀器預(yù)熱10分鐘，選擇開關(guān)置于“T”

。2.打開試樣室蓋（光門自動(dòng)關(guān)閉），調(diào)節(jié)“0%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”。第32頁(yè)/共89頁(yè)333.將裝有溶液的比色皿放置比色架中。4.旋動(dòng)波長(zhǎng)手輪，把測(cè)試所需的波長(zhǎng)調(diào)節(jié)至刻度線處。第33頁(yè)/共89頁(yè)345.蓋上樣品室蓋，將參比溶液比色皿置于光路，調(diào)節(jié)透過率“100%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“100.0T”（如果顯示不到100%T，則可適當(dāng)增加靈敏度的檔數(shù)，同時(shí)應(yīng)重復(fù)“2”，調(diào)整儀器的“00.0”）。 第34頁(yè)/共89頁(yè)356.將參比溶液比色皿置于光路中，將選擇開關(guān)置于A，旋動(dòng)吸光度調(diào)零旋鈕，使得數(shù)字顯示為.000，然后移入被測(cè)溶液，顯示值即為試樣的吸光度A值。第35頁(yè)/共89頁(yè)368．全部測(cè)定結(jié)束后，取出比色皿(洗凈)，關(guān)閉開關(guān).第36頁(yè)/共89頁(yè)37三、分光光度技術(shù)的定性和定量方法（一）分光光度技術(shù)的定性方法定性依據(jù)：最大吸收波長(zhǎng)λmax和摩爾吸光系數(shù)ε2.摩爾吸光系數(shù)ε方法1.最大吸收波長(zhǎng)λmax方法第37頁(yè)/共89頁(yè)38（二）分光光度技術(shù)的定量方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法

將一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照一定操作過程顯色后，分別測(cè)吸光度(A)，以A為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線(至少要5點(diǎn))。在相同條件下處理待測(cè)物質(zhì)并測(cè)定其吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線找出相對(duì)應(yīng)的濃度方法：第38頁(yè)/共89頁(yè)39AXCXA（吸光度）C（濃度）第39頁(yè)/共89頁(yè)40制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：（1）測(cè)定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)重新繪制。（2）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。（3）當(dāng)待測(cè)液吸光度超過線性范圍時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測(cè)定。（4）標(biāo)本測(cè)定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的條件完全一致。第40頁(yè)/共89頁(yè)412．比較法

CX=(AX×Cs)/As

己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為：

其中Cx和Ax為標(biāo)本管濃度和吸光度，Cs和As分別為標(biāo)準(zhǔn)管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量和標(biāo)本管濃度相近。第41頁(yè)/共89頁(yè)423．其它分析方法

包括差示法、多組份混合物分析和利用摩爾吸光系數(shù)分析等方法。第42頁(yè)/共89頁(yè)43四、其它光譜分析技術(shù)（一）火焰光度法（二）原子吸收分光光度法（三）熒光光度分析法1．基本原理2．組成1．基本原理2．組成3．原子吸收分光光度法的特點(diǎn)

3．熒光光度定量分析法4．熒光光度分析技術(shù)的應(yīng)用1．基本原理2．影響熒光強(qiáng)度的因素第43頁(yè)/共89頁(yè)44火焰光度法——等離子體發(fā)射光譜法第44頁(yè)/共89頁(yè)45原子吸收分光光度法第45頁(yè)/共89頁(yè)46熒光光度法NanoDrop?ND-3300Fluorospectrometer

第46頁(yè)/共89頁(yè)47第二節(jié)電化學(xué)分析電化學(xué)分析方法基本原理離子選擇電極分類和保養(yǎng)離子選擇電極的分析方法第47頁(yè)/共89頁(yè)48電化學(xué)分析是利用物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)，測(cè)定化學(xué)電池電位、電流或電量的變化進(jìn)行分析的方法。電化學(xué)分析方法電位分析法：測(cè)定原電池電動(dòng)勢(shì)以求物質(zhì)含量的分析方法電導(dǎo)法：通過電阻測(cè)定以求物質(zhì)含量的分析方法電容量分析法：借助某些物理量的突變作為分析重點(diǎn)的指示第48頁(yè)/共89頁(yè)49電位分析法是利用電極電位和濃度之間的關(guān)系來確定物質(zhì)含量的分析方法。一、電化學(xué)分析方法基本原理原電池是利用兩個(gè)電極之間金屬性的不同,產(chǎn)生電勢(shì)差,從而使電子的流動(dòng),產(chǎn)生電流.又稱非蓄電池，是電化電池的一種。第49頁(yè)/共89頁(yè)50電池電動(dòng)勢(shì)和電極電勢(shì)電池電動(dòng)勢(shì)：將電位差計(jì)接在電池的兩個(gè)電極之間而直接測(cè)得的電勢(shì)值習(xí)慣上稱之為電池的電動(dòng)勢(shì)電極電勢(shì)：當(dāng)采用相對(duì)電勢(shì)法時(shí)，系用一定的參比電極與研究電極組成電池，這一電池的電動(dòng)勢(shì)稱為相對(duì)于給定參比電極而確定的研究電極電勢(shì)。(金屬和溶液相接觸的內(nèi)電位差即為金屬電極和溶液間的電極電勢(shì))所謂“電極/溶液”之間的絕對(duì)電勢(shì)不但無(wú)法直接測(cè)量，在處理電極過程動(dòng)力學(xué)問題時(shí)也不需要用到它。在計(jì)算電池電動(dòng)勢(shì)時(shí)，也完全可以采用相對(duì)電極電勢(shì)來代替絕對(duì)電極電勢(shì)。第50頁(yè)/共89頁(yè)51Theabsolutepotentialdifferenceacrossasingleelectrifiedinterfacecannotbemeasured!Itisnotnecessarytoknowexactvalueofitbutthedifferenceofabsolutepotentialdifferenceisimportantforelectrochemists!單個(gè)界面上的絕對(duì)電位是不可測(cè)的，對(duì)于電化學(xué)研究重要的是其差值第51頁(yè)/共89頁(yè)52參比電極顧名思義，參比電極是給出一個(gè)固定的值，其它的電極電勢(shì)的測(cè)量以此為基礎(chǔ)。一個(gè)好的參比電極應(yīng)該不受溫度、時(shí)間和通過小電流而變化,應(yīng)遵守Nernst方程。指示電極指示電極的電位隨離子濃度而變化，能指示待測(cè)離子濃度。第52頁(yè)/共89頁(yè)53二離子選擇性電極1、定義：離子選擇性電極是一種以電位法測(cè)定某些特定離子活度的指示電極。2、特點(diǎn)：電極的關(guān)鍵部件敏感膜對(duì)溶液中特定離子有選擇性響應(yīng)。敏感膜并不給出或得到電子，而是選擇性地讓某些離子滲透，同時(shí)包含離子交換過程3、測(cè)定原理：基于內(nèi)部溶液與外部溶液之間產(chǎn)生的電位差，即膜內(nèi)外被測(cè)離子活度的不同而產(chǎn)生電位差，稱之為膜電位。第53頁(yè)/共89頁(yè)54第54頁(yè)/共89頁(yè)554、離子選擇性電極分類離子選擇電極基本電極敏化電極晶體膜電極非晶體膜電極氣敏電極敏電極均相膜電極非均相膜電極剛性基質(zhì)電極（pH電極，Na電極）流動(dòng)載體電極（K,cl,ca電極）第55頁(yè)/共89頁(yè)56敏化電極氣敏電極：由指示電極，參比電極，透氣膜和內(nèi)電解質(zhì)溶液組成。如co2電極酶電極：含酶凝膠涂在離子選擇電極敏感膜上。如尿素、Glu電極第56頁(yè)/共89頁(yè)575、離子選擇性電極的基本構(gòu)造膜電極的構(gòu)成1、電極桿（玻璃或塑料管）2、內(nèi)參比電極（銀－氯化銀）3、內(nèi)參比溶液4、敏感膜（關(guān)鍵部件）第57頁(yè)/共89頁(yè)58（一）非晶膜電極—玻璃電極

內(nèi)參比電極：Ag—AgCl電極。玻璃泡：敏感膜內(nèi)參比溶液：

pH一定的緩沖溶液。1玻璃電極的結(jié)構(gòu)三常用的離子選擇性電極第58頁(yè)/共89頁(yè)59（2）玻璃電極及膜電位：玻璃電極是最早使用的離子選擇性電極。玻璃薄膜是決定電極性能的最重要組成部份。內(nèi)參比電極的電位是恒定的，與被測(cè)溶液的PH無(wú)關(guān)。玻璃電極用作測(cè)PH的指示電極，是因?yàn)榭缭讲Ａぎa(chǎn)生了膜電位。膜電位與待測(cè)溶液PH值有關(guān)。第59頁(yè)/共89頁(yè)60在任意溫度T下：

根據(jù)此公式，通過測(cè)定玻璃電極的電極電位，可求出膜外試液的H+活度。這是使用玻璃電極測(cè)量pH的理論根據(jù)和基本計(jì)算關(guān)系。

第60頁(yè)/共89頁(yè)613.玻璃電極的優(yōu)點(diǎn)

選擇性高：膜電位的產(chǎn)生不是電子的得失。其它離子不能進(jìn)入敏感膜產(chǎn)生交換。當(dāng)溶液中Na+濃度比H+濃度高1015倍時(shí)，兩者才產(chǎn)生相同的電位；不受溶液中氧化劑、還原劑、顏色、沉淀及膠體、雜質(zhì)的影響，不易中毒；改變玻璃膜的組成，可制成對(duì)其它陽(yáng)離子響應(yīng)的玻璃膜電極。第61頁(yè)/共89頁(yè)62（二）氣敏電極

氣敏電極端部裝有透氣膜，氣體可通過它進(jìn)人管內(nèi)。管內(nèi)插入pH玻璃復(fù)合電極，復(fù)合電極是將外多比電極（Ag／AgCI）繞在電極周圍。管中充有電解液，也稱中介液。試樣中的氣體通過透氣膜進(jìn)入中介液，引起電解液中離子活度的變化，這種變化由復(fù)合電極進(jìn)行檢測(cè)。如CO2氣敏電極，用PH玻璃電極作為指示電極，中介液為0.01mol/L的碳酸氫鈉。二氧化碳與水作用生成碳酸，從而影響碳酸氫鈉的電離平衡來指示CO2

。第62頁(yè)/共89頁(yè)63該類電極其實(shí)是一種復(fù)合電極：將pH玻璃電極和指示電極插入中介液中，待測(cè)氣體通過氣體滲透膜與中介液反應(yīng)，并改變其pH值，從而可測(cè)得諸如CO2(中介液為NaHCO3)或NH4+(中介液為NH4Cl)的濃度。氣敏電極第63頁(yè)/共89頁(yè)64（三）生物電極

有酶電極或生物組織電極等。將生物化學(xué)與電化學(xué)結(jié)合而研制的電極。酶電極：覆蓋于電極表面酶活性物質(zhì)(起催化作用)與待測(cè)物反應(yīng)生成可被電極響應(yīng)的物質(zhì)，如脲的測(cè)定氨基酸測(cè)定

第64頁(yè)/共89頁(yè)65上述反應(yīng)產(chǎn)生的NH4+可由銨離子電極測(cè)定。生物組織電極：由于生物組織中存在某種酶，因此可將一些生物組織緊貼于電極上，構(gòu)成同酶電極類似的電極。第65頁(yè)/共89頁(yè)66四、分析方法

（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線法

配制一系列已知活（濃）度的欲測(cè)離子的標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐一插入離子選擇性電極和參比電極，測(cè)出它們相應(yīng)的E值，以E對(duì)C作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。在同樣條件下測(cè)出未知溶液的E值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的欲測(cè)溶液的離子活（濃）度。第66頁(yè)/共89頁(yè)67（二）標(biāo)準(zhǔn)比較法

當(dāng)待測(cè)溶液的成份比較復(fù)雜，離子強(qiáng)度比較大時(shí)，難以配制與待測(cè)溶液組成相近的標(biāo)液，此時(shí)，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法較適宜。第67頁(yè)/共89頁(yè)68第三節(jié)電泳技術(shù)

一、電泳的基本原理二、影響電泳速度與分辨率的因素三、電泳技術(shù)的分類四、醋酸纖維薄膜電泳技術(shù)五、聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)六、其他電泳技術(shù)第68頁(yè)/共89頁(yè)69何為電泳？在直流電廠中帶電粒子向著與其電性相反移動(dòng)的現(xiàn)象叫電泳，利用電泳原理進(jìn)行物質(zhì)分離的技術(shù)第69頁(yè)/共89頁(yè)70一、電泳的基本原理V:泳動(dòng)速度cm/秒or分d:泳動(dòng)距離cmt:電泳時(shí)間(秒/分)E:電場(chǎng)強(qiáng)度伏特/cmu:泳動(dòng)率or泳動(dòng)度(cm/伏·秒or分)U:電壓常壓(100—500v)

高壓(500—10000v)僅需幾分鐘l:支持場(chǎng)的長(zhǎng)度(有效長(zhǎng)度)第70頁(yè)/共89頁(yè)71二、影響電泳速度與分辨率的因素影響泳動(dòng)率u的因素

內(nèi)因：1.凈電荷

2.質(zhì)點(diǎn)大小

3.質(zhì)點(diǎn)形狀

外因：1.V

(U/L)

2.緩沖液的pH(pH恒定)

3.離子強(qiáng)度[I]

最適:0.02-0.2

4.電滲：液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)第71頁(yè)/共89頁(yè)72

樣品（內(nèi)因）

1.凈電荷：被分離物帶電荷量與電泳速度成正比

2.質(zhì)點(diǎn)大?。侯w粒直徑愈小愈快，分子大小與電泳速度成反比

3.質(zhì)點(diǎn)形狀：球形分子比纖維狀分子泳動(dòng)快。第72頁(yè)/共89頁(yè)732，電場(chǎng)（外因）包括電場(chǎng)強(qiáng)度、電壓、電流等一般情況下，電泳速度與電流強(qiáng)度成正比關(guān)系，但是，電泳時(shí)電流通過支持媒介可以產(chǎn)熱，促使支持介質(zhì)上溶劑的蒸發(fā)，導(dǎo)致電泳失敗。所以不能單純追求快速度而過分加大電場(chǎng)強(qiáng)度第73頁(yè)/共89頁(yè)743，電極緩沖液

1）PH（外因）

第74頁(yè)/共89頁(yè)752）溶液的離子強(qiáng)度（外因）

維持一定的緩沖容量，需要一定濃度的離子，它主要與其濃度和價(jià)數(shù)相關(guān)。I=1/2CZ2

緩沖液I越大，樣品電流減小，泳動(dòng)速度變慢，區(qū)分條帶清晰；過高會(huì)壓縮質(zhì)點(diǎn)的雙電層，最后破壞膠體，不能泳動(dòng)。

I越小，則泳動(dòng)速度快，條帶分離差，過低，緩沖容量小，PH不穩(wěn)定，樣品易擴(kuò)散。一般在0.02-0.2。第75頁(yè)/共89頁(yè)764，電泳載體化學(xué)惰性，堅(jiān)韌度并適于保存不同載體對(duì)泳動(dòng)速度的影響有

1）吸附，造成拖尾，分辨率降低

2）電滲，電場(chǎng)中，液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲第76頁(yè)/共89頁(yè)77三、電泳技術(shù)的分類1，按電泳載體的物理性狀

1）濾紙及其他纖維膜電泳濾紙電泳醋酸纖維素薄膜電泳：最常用

2）粉末電泳

3）凝膠電泳瓊脂凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳第77頁(yè)/共89頁(yè)782，按電泳載體的裝置形式分類

1）水平式電泳，最常見

2）垂直管狀電泳，

3）垂直板狀電泳

4）連續(xù)流動(dòng)電泳3，按電泳緩沖液pH的連續(xù)性分類

1）連續(xù)pH電泳，電泳全程保持pH值的恒定

2）不連續(xù)pH電泳第78頁(yè)/共89頁(yè)79四、醋酸纖維素薄膜電泳技術(shù)第79頁(yè)/共89頁(yè)80電泳儀器架膜加蓋接導(dǎo)線，開機(jī)第80頁(yè)/共89頁(yè)81第81頁(yè)/共89頁(yè)82實(shí)驗(yàn)操作

浸泡

將醋酸纖維素薄膜在緩沖溶液中浸泡20min，取出識(shí)別光面和麻面。

點(diǎn)樣

用鑷子將薄膜置于濾紙上，吸收多余的液體，用鉛筆在薄膜麻面一端2cm處畫一細(xì)線，利用載玻片一側(cè)蘸取樣品，于細(xì)線處點(diǎn)樣。

電泳

將薄膜麻面朝下，平懸于電泳槽支架的濾紙橋上，點(diǎn)樣一端靠近負(fù)極；通電后先使U=80V，待10min后，使U=120V電泳40min。

染色

將薄膜取出后，置于氨基黑10B染色劑重，染色10min。

漂洗

將薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至無(wú)蛋白區(qū)無(wú)藍(lán)黑色。第82頁(yè)/共89頁(yè)83五、聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,簡(jiǎn)稱Bis)在加速劑

N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethylethylenediamine，簡(jiǎn)稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O3，簡(jiǎn)稱AP)或核黃素(ribofavin即vitaminB2,C17H2O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE)。第83頁(yè)/共89頁(yè)84光聚合：核黃素為催化劑(陽(yáng)光,日光)，制大孔膠。化學(xué)聚合：制小孔膠。

過硫酸銨(NH4)2S2O3

APS

(引發(fā)劑)

N,