5、內毒素檢查法在藥品生產質控的應用修改

細菌內毒素檢查在藥品生產質控上的應用馮聚錦湛江安度斯生物有限公司2009年3月第二稿2一、鱟試驗對藥品生產質控的意義藥品生產企業(yè)實施GMP的意義在于使人們對藥品質量的控制從傳統(tǒng)的成品檢驗，上升到對藥品生產全過程進行有效監(jiān)控的現(xiàn)代質量管理模式。美國食品及藥物監(jiān)督管理局（FDA）自2004年起大力推行“過程分析技術”(ProcessAnalyticalTechnology,PAT)，更凸顯了醫(yī)藥發(fā)達國家對藥品生產過程質控的高度重視。2023/4/33在醫(yī)藥工業(yè)的GMP條件下，“熱原就是內毒素，控制內毒素就控制了熱原”已成為共識?；谶@種認識，許多國家的藥典已由細菌內毒素檢查項取代熱原檢查項并且成為了發(fā)展的趨勢，將會有越來越多的藥典品種使用鱟試劑檢查。不僅如此，鱟試驗法在醫(yī)藥工業(yè)上目前是注射藥品生產質控的最好方法，它為眾多的藥品生產企業(yè)帶來顯著的經濟效益。4

中國和美國是世界上應用鱟試劑最早的國家，也是鱟試劑產量及用量最多的國家。盡管如此，兩國在鱟試劑應用的水平、程度及范圍上仍有明顯的差異。中國藥典2005年版收載的BET品種有160多種，而USP收載的BET品種超過700種。2023/4/370%＜30%生產質控應用領域的比較30%3%30%25%42%美國＞70%—

——

—5%＞90%中國終產品檢驗終點顯色動態(tài)顯色動態(tài)濁度凝膠法方法學應用的比較在醫(yī)藥發(fā)達國家，一個注射藥品生產體系的建立或GMP認證，都要求在生產質控上應用鱟試驗方法。我國目前的GMP認證還沒有這方面的要求，應該說是個缺陷，但發(fā)展趨勢必然會補充相應的要求。5二、生產質控的基本特點及要求按控制的時機分類：事前控制：對正在生產的產品質量控制有效；事后控制：對正在生產的產品質量控制無效，只對以后生產的產品質量控制有效。按控制的方式分類：靜態(tài)控制：對已完成的生產工序的質控無效，只對以后的生產工序的質控有效；動態(tài)控制：對正在進行或將要進行的生產工序的質控有效。2023/4/362023/4/3生產質控對檢驗方法的要求采樣方便、微量操作簡單、快速檢查準確、靈敏結果可靠，數(shù)據(jù)處理自動化鱟試驗法目前是滿足藥品生產質控的最好方法鱟試驗的優(yōu)點：采樣方便、微量：0.1~1ml操作簡便、快速：7~60分鐘靈敏、準確：最低可測0.001EU/mL的內毒素含量，定量檢測的范圍可涵蓋0.001~1,000EU/mL。技術成熟，自動化程度高鱟試驗是目前能使藥品生產的熱原控制實現(xiàn)動態(tài)監(jiān)控和事前控制的唯一方法。7三、藥品生產過程內毒素的控制方法內毒素監(jiān)控體系（1）監(jiān)控對象重要的媒體及原料水是制藥工業(yè)最重要的媒體，是首要的監(jiān)控對象使用量大的原料生產過程添加的各種輔劑與中間體接觸的各種用具、器皿及終產品的包裝容器2023/4/38各工序前后中間體內毒素水平的變化

至少在生產過程的重要工序之間要設置檢測點，例

如在除熱原工序后設置檢測點，檢測該工序除熱原（干烤、過濾、吸附）的效果。又如在分裝工序前需抽檢，確保中間體內毒素水平不超出控制水平才進行分裝。烘箱等除熱原設備的驗證2023/4/39生產原料生產用具、容器入庫清洗、除熱原備用工序1原料分裝輔劑工序2工序3終成品入庫水輔劑Δ1Δ2Δ3Δ6Δ8Δ4Δ5Δ7Δ9Δ10鱟試驗檢查Δ1Δ2Δ3Δ內毒素檢測點

工序運行路線

取樣

檢測結果反饋2023/4/3（2）藥品生產過程細菌內毒素監(jiān)控體系10建立內毒素監(jiān)控體系的步驟確定藥品的內毒素限值L；分析藥品生產過程，合理設置內毒素監(jiān)測點；制定各監(jiān)測點合理的內毒素控制水平Lx；進行干擾性驗證試驗確定各監(jiān)測點樣品的有效濃度或有效稀釋范圍，選擇所用鱟試劑的靈敏度。進行日常的內毒素監(jiān)測檢查。2023/4/311內毒素控制限值的確定如果終產品的內毒素限值為L，各監(jiān)測點的內毒素控制水平為LX，則LX＜L。某些原料或中間體在其后的生產工序中將要被稀釋，計算其稀釋后的內毒素含量ED，如果ED＜1/4L，可以允許該原料或中間體的內毒素控制水平LX＞L。例如，某種主要原料在生產時將要被稀釋10倍使用，如果L為0.5EU/ml，可以允許該原料的內毒素控制水平LX1.25EU/ml。2023/4/312

如果能確實保證在除熱原工序后的中間體的內毒素含量少于1/4L，可允許該工序前的LX適當大于L。在制定各監(jiān)控點LX時，應注意熱原具有積累性。制藥企業(yè)需要根據(jù)自身的生產條件及工藝水平來制定合理的LX值。在歐美通常以1/10L~1/4L作為LX。2023/4/313

千萬不要以藥典的內毒素限值作為控制值

據(jù)了解，不少企業(yè)的質檢人員以藥典給出的該品種的內毒素限值作為產品質量的控制值或者作為產品出廠放行的合格值。這種做法其實不好，原因如下：

（1）藥典給出的藥品的內毒素限值是對藥品質量的最低要求。任何有一定質量能力的企業(yè)都不應以這最低的要求作為自己產品的標準。

（2）細菌內毒素檢查是一項生物檢查，有較寬的精確范圍。特別是凝膠法鱟試驗，精確度只有值的50~200%，當產品的內毒素含量值接近限值時，很容易出現(xiàn)結果的不確定性。

（3）理想的產品放行值應≤1/4藥典限值。2023/4/314各監(jiān)控點樣品的干擾驗證目的：找出每個監(jiān)測點的供試品的無干擾濃度抽取監(jiān)測點的適量樣品選擇凝膠法鱟試劑的靈敏度或定量鱟試劑的標準曲線范圍；計算檢測樣品的最大有效稀釋倍數(shù)MVD樣品與鱟試劑相容性的初篩試驗；樣品與鱟試劑的干擾試驗2023/4/315干擾驗證舉例（凝膠法）：

某生物制品在冷凍干燥前的分裝液（S）為120mg/ml,Lx<0.05EU/mg(L<0.2Eu/mg)。1）Ls<0.05Eu/mg×120mg/ml＝6.0Eu/ml；2）若選用λ=0.125Eu/ml的TAL，最大有效稀釋；

163）取分裝液(S)用BET水作1:48倍稀釋，得供試液（S48）；4）取λ=0.125Eu/ml的TAL對S48作干擾試驗；5）如果干擾試驗結果表明S48對BET無干擾，就把這個濃度定為S的日常監(jiān)測濃度，即每批產品分裝前，取S稀釋成S48，用λ=0.125EU/mL的TAL作檢查。如果檢查結果為陽性，表明S的內毒素含量超標（≥0.05Eu/mg），不能進入分裝凍干工序；如果檢查結果為陰性，S可進行分裝凍干。17生產過程細菌內毒素監(jiān)控的常規(guī)檢查采樣把樣品制備成供試液（如前S48）鱟試驗檢查結果分析將信息反饋至生產控制系統(tǒng)18四、細菌內毒素的快速檢測方法鱟試驗在生產質控上應用的方法較靈活，不受藥典法規(guī)的限制，既可采用藥典法規(guī)接受的鱟試驗方法，也可采用更新更先進的技術和方法。以下介紹幾種有代表性的最新的快速鱟試驗方法。細菌內毒素快速檢測試劑盒湛江安度斯公司的發(fā)明專利屬于凝膠法原理：使用高靈敏度的試劑作低靈敏度使用反應時間只需20-25分鐘操作方便、簡單用途：生產過程細菌內毒素的限量快速檢測2023/4/319特點：使用方便

快速檢測盒內配置與國際使用接軌的單次試驗鱟試劑（TAL）。使用這種單次試驗TAL時，直接加0.2ml樣品復溶試劑兼檢測，不必象使用0.1ml/支TAL那樣要先加0.1ml的水復溶試劑，然后再加0.1ml樣品檢測。20同一試劑盒有多個靈敏度供選擇

在每一批號的快速檢測試劑盒上都標示有至少兩個可供選擇的靈敏度。使用時選擇不同的靈敏度(λ0)對應有不同的反應時間(T0)。如批號為0809082的快速檢測試劑盒，靈敏度標示如下：λ0T00.25EU/mL20±1分鐘0.125EU/mL25±1分鐘21CSE無需稀釋

我們知道，作鱟試驗最繁瑣耗時的操作就是稀釋標準內毒素（CSE）?？焖贆z測試劑盒配備了無需稀釋一步到位的CSE，使實驗真正快速方便。配套器具，得心應手

作快速鱟試驗時，如果配合使用安度斯公司提供的可調移液器、采樣瓶、可定時的干式恒溫儀等實驗器具，可真正體會到BET實驗的快速、準確及方便。

22名稱規(guī)格數(shù)量鱟試劑（TAL）0.2ml/支λ：0.125EU/ml/0.25EU/ml8支工作標準內毒素（CSE）5EU/支1支BET水2ml/支1支試劑盒組成23使用方法：（λ=0.125EU/mL）檢查項目反應管數(shù)每管加樣陰性對照（溶液D）20.2mLBET水陽性對照（溶液C）20.2mLBET水+0.01mLE5供試品陽性對照（溶液B）20.2mLS+0.01mLE5

供試品（溶液A）20.2mLS24光度法定性快速檢測法屬動態(tài)濁度或動態(tài)顯色法需要使用動態(tài)光度儀及相應軟件方法及步驟1）確定供試品原液（S0）的內毒素限值（L或Lx）2）確定供試品無干擾濃度，如S8

3）制備不含可測內毒素的供試品S84）制備含L8濃度標準內毒素的陽性供試品S8L8

2023/4/3

255）在日常監(jiān)測時，以S8L8與TAL反應的時間T0作為判斷其它供試品內毒素含量的標準：凡是反應時間T<T0的供試品，其內毒素含量>L8，即原液S0的內毒素含量>L凡是反應時間T>T0的供試品，其內毒素含量<L8，即原液S0的內毒素含量<L；只需供試品的動態(tài)曲線一達到預設光度值，即可知道該供試品是否合格。甚至分析供試品動態(tài)曲線的走勢就可知道供試品是否合格。2023/4/3預設透光度值S8L8產品不合格產品合格T1T0

T2S8NC100%92%RtT(秒)26光度法定量快速檢測法屬動態(tài)濁度法或動態(tài)顯色法需要使用安度斯軟件“生物探針-2002”方法及步驟

1）預先用標準內毒素與TAL反應制備一條標準曲線，存檔。最理想的標準曲線是用同體系模型法建立（參閱本公司講義2005年3月版）；

2）檢測開始前調出存檔標準曲線

3）反應開始后，只要各供試品的動態(tài)曲線一達到預設光度值，界面上的表格中立即顯示出該供試品的內毒素含量2023/4/327供試品內毒素含量調用的標準曲線2023/4/328注意事項制備存檔標準曲線的TAL必須與檢測試劑相同；供試品應在無干擾濃度且不超過MVD濃度內檢測。2023/4/3294、便攜式檢測系統(tǒng)——PTSPTS是美國查爾斯河實驗室公司(CharlesRiverLaboratories,Inc.)最新推出的生物分析系統(tǒng)PTS是一種便攜式、可現(xiàn)場使用、快速、定量的檢測系統(tǒng)。細菌內毒素的定量快速檢測僅是PTS的功能之一，其它生物測定的功能正在陸續(xù)推出。30PTS是由便攜式光度儀和檢測試劑卡兩部分組成。31技術原理——動態(tài)顯色法鱟試驗每塊試劑卡中有四條反應通道如下：系統(tǒng)內置存檔標準曲線，儀器自動測定吸光度及進行數(shù)據(jù)處理。供試品

陽性對照

通道(2條)加樣孔LAL顯色底物CSE反應池抽吸孔供試品

檢查通道

（2條）32

實驗方法開啟儀器預熱至37℃插入試劑卡在試劑卡的四個加樣孔中各加入25l(0.025ml)供試品溶液按“檢測”鍵（Enter）約7~15分鐘后屏幕上顯示如下檢測結果：回收率：？供試品含量：？EU/mL變異系數(shù)：CV=?%33PTS的特點使用極靈敏可靠的鱟試驗技術獲得美國FDA認證體積小巧，僅1公斤重，內置電源，可在任何現(xiàn)場使用7-15分鐘可獲得定量的檢測結果只需極簡單的操作：插入檢測卡片→加入樣品→自動檢測并顯示檢測結果34無需用戶建立標準曲線無外部恒溫孵育要求檢測范圍：10-0.1EUmL

5-0.05EU/mL

1-0.01EU/mL可顯示樣品內毒素含量、回收率、變異系數(shù)檢測結果可貯存、打印或下載到電腦35

PTS的應用水制備系統(tǒng)的監(jiān)控研發(fā)產品的檢測生產現(xiàn)場半成品的快速檢測醫(yī)療器械的質量監(jiān)控——如血液透析36

目前PTS可分析的項目細菌內毒素檢測（7~15分鐘）β-葡聚糖檢測（10~30分鐘）微量蛋白檢測（20分鐘）革蘭氏陰性、陽性細菌及酵母菌/霉菌鑒別（3-7分鐘）375、生產質控應用舉例下面的實例是國外某藥廠對生產工藝用水連續(xù)25天的凝膠法（限量）和動態(tài)法（定量）的檢測情況。該工藝用水的細菌內毒素控制限值為0.125EU/ml，在第十一日時凝膠法呈陽性，立即對水系統(tǒng)進行處理，此后的第十二至二十五日均為陰性。動態(tài)法的檢測結果則揭示了內毒素的具體變化，在第八、九、十日內毒素含量明顯上升，第十日已經接近控制限值，按這一趨勢，第十一日很可能超過限值，事實也確實如此。了解這一信息就可以在出現(xiàn)不合格產品前采取預防措施。2023/4/3382023/4/3(EU/mL)(天)0.125EU/mL::附錄資料：不需要的可以自行刪除兒科常見急癥處理過敏性休克癥狀與搶救發(fā)病機理是典型的第I型變態(tài)反應，是由于抗原物質(如血制品、藥物、異性蛋白、動植物)進入人體后與相應的抗體相互作用，由IgE所介導，激發(fā)引起廣泛的I型變態(tài)反應。發(fā)生在已致敏的患者再次暴露于同一異種抗原或半抗原時，通過免疫機制，使組織釋放組織胺、緩激肽、5-羥色胺和血小板激活因子等，導致全身性毛細血管擴張和通透性增加，血漿迅速內滲到組織間隙，循環(huán)血量急劇下降引起休克，累及多種器官，?？晌＜吧?。臨床表現(xiàn)

1．起病突然，約半數(shù)患者在接受抗原(某些藥品或食物、蜂類叮咬等)5分鐘內即出現(xiàn)癥狀，半小時后發(fā)生者占10％。最常見受累組織是皮膚、呼吸、心血管系統(tǒng)，其次是胃腸道和泌尿系統(tǒng)。

2．癥狀：胸悶、喉頭堵塞及呼吸困難且不斷加重，并出現(xiàn)暈厥感，面色蒼白或發(fā)紺，煩躁不安，出冷汗，脈搏細弱，血壓下降，后期可出現(xiàn)意識不清、昏迷、抽搐等中樞神經系統(tǒng)癥狀。

3．此外尚可出現(xiàn)皮疹、瘙癢、腹痛、嘔吐、腹瀉等。搶救程序

1．立即皮下或肌肉注射0．1％腎上腺素0．2—0．5ml，此劑量可每15—20分鐘重復注射，腎上腺素亦可靜注，劑量是1—2ml。

2．脫離過敏原，結扎注射部位近端肢體或對發(fā)生過敏的注射部位采用封閉治療(0．00596腎上腺素2～5ml封閉注射)。

3．苯海拉明或異丙嗪50mg肌注。

4．地塞米松5～10mg靜注，繼之以氫化可的松200—400mg靜滴。

搶救程序

5．氨茶堿靜滴，劑量5mg/kg。

6．抗休克治療：吸氧、快速輸液、使用血管活性藥物，強心等。

7．注意頭高腳底位，維持呼吸道通暢。

以上幾點是搶救過敏性休克患者的基本步驟，在搶救中應強調兩點：一是迅速識別過敏性休克的發(fā)生；二是要積極治療，特別是抗休克治療和維護呼吸道通暢。輸液反應的癥狀及搶救

輸液反應的主要常見癥狀：

1、發(fā)熱反應（最多見，占90%以上）；

2、心力衰竭、肺水腫；

3、靜脈炎；

4、空氣栓塞。

一、發(fā)熱反應

1、原因輸入致熱物質（致熱原、死菌、游離的菌體蛋白或藥物成分不純）、輸液瓶清潔消毒不完善或再次被污染；輸入液體消毒、保管不善變質；輸液管表層附著硫化物等所致。

2、臨床癥狀主要表現(xiàn)發(fā)冷、寒戰(zhàn)、發(fā)熱（輕者發(fā)熱常在38℃左右，嚴重者高熱達40－41℃），并伴有惡心、嘔吐、頭痛、脈快、周身不適等癥狀。

3、防治（1）反應輕者可減慢輸液速度，注意保暖（適當增加蓋被或給熱水袋）。重者須立即停止輸液；高熱者給以物理降溫，必要時按醫(yī)囑給予抗過敏藥物或激素治療，針刺合谷、內關穴。（2）輸液器必須做好除去熱原的處理。

二、心力衰竭、肺水腫

1、原因由于滴速過快，在短期內輸入過多液體，使循環(huán)血容量急劇增加，心臟負擔過重所致。

2、癥狀病人突然感到胸悶、氣短、咳泡沫樣血性痰；嚴重時稀痰液可由口鼻涌出，肺部出現(xiàn)濕羅音，心率快。

3、防治（1）輸液滴速不宜過快，輸入液量不可過多。對心臟病人、老年和兒童尤須注意。（2）當出現(xiàn)肺水腫癥狀時，應立即停止輸液，并通知醫(yī)生，讓病人取端坐位，兩腿下垂，以減少靜脈回流，減輕心臟負擔。（3）按醫(yī)囑給以舒張血管、平喘、強心劑。（4）高流量氧氣吸入，并將濕化瓶內水換成20%－30%酒精濕化后吸入，以減低肺泡內泡沫表面的張力，使泡沫破裂消散，從而改善肺部氣體交換，減輕缺氧癥狀。（5）必要時進行四肢輪扎止血帶（須每隔5－10分鐘輪流放松肢體，可有效地減少回心血量），待癥狀緩解后，止血帶應逐漸解除。

三、靜脈炎

1、原因由于長期輸注濃度較高、刺激性較強的藥物，或靜脈內放置刺激性強的塑料管時間過長而引起局部靜脈壁的化學炎性反應；也可因輸液過程中無菌操作不嚴引起局部靜脈感染。

2、癥狀沿靜脈走向出現(xiàn)條索狀紅線，局部組織紅、腫、灼熱、疼痛，有時伴有畏寒、發(fā)熱等全身癥狀。

3、防治以避免感染，減少對血管壁的刺激為原則。（1）嚴格執(zhí)行無菌技術操作，對血管有刺激性的藥物，如紅霉素、氫化考的松等，應充分稀釋后應用，并防止藥物溢出血管外。同時要經常更換注射部位，以保護靜脈。（2）抬高患肢并制動，局部用95%酒精或50%硫酸鎂進行熱濕敷。（3）用中藥外敷靈或如意金黃散外敷，每日2次，每次30分鐘。（4）超短波理療，用TDP治療器照射，每日2次，每次30分鐘。

四、空氣栓塞

1、原因由于輸液管內空氣未排盡，導管連接不緊，有漏縫；加壓輸液、輸血無人在旁看守，均有發(fā)生氣栓的危險。進入靜脈的空氣，首先被帶到右心房，再進入右心室。如空氣量少，則被右心室壓入肺動脈，并分散到肺小動脈內，最后到毛細血管，因而損害較少，如空氣量大，則空氣在右心室內將阻塞動脈入口，使血液不能進入肺內進行氣體交換，引起嚴重缺氧，而致病人死亡。

2、癥狀病人感覺胸部異常不適，瀕死感，隨即出現(xiàn)呼吸困難，嚴重紫紺，心電圖可表現(xiàn)心肌缺血和急性肺心病的改變。

3、防治（1）輸液時必須排盡空氣，如需加壓輸液時，護士應嚴密觀察，不得離開病人，以防液體走空。（2）立即使病人左側臥位和頭低足高位，此位置在吸氣時可增加胸內壓力，以減少空氣進入靜脈，左側臥位可使肺動脈的位置在右心室的下部，氣泡則向上飄移右心室尖部，避開肺動脈入口由于心臟跳動，空氣被混成泡沫，分次小量進肺動脈內。（3）氧氣吸入。（4）在行鎖骨下靜脈穿刺更換針管時，應在病人呼氣時或囑病人屏氣時進行，以防空氣吸入，保留硅管或換液體時的任何操作環(huán)節(jié)，均不能讓硅管腔與大氣相通。

輸液反應的搶救方案：

1、吸氧。2、靜注地塞米松10-15mg（小兒0.5-1mg/kg/次）或氫化可的松100mg（小兒5-15mg/kg/次）。3、肌注苯海拉明20-40mg（小兒0.5-1mg/kg/次）或非那根25mg（小兒0.5-1mg/kg/次）。4、肌注復方氨基比林2ml（小兒0.5ml/kg/次）。5、如果出現(xiàn)肢端發(fā)涼或皮膚蒼白，可肌注或靜注654-2針5mg（小兒0.5-1mg/kg/次），SBP<90mmHg時快速補液同時靜注654-2針10mg。由于輸液反應不是速發(fā)型變態(tài)反應，慎用腎上腺素，但如果輸液反應并血壓急速下降時用腎上腺素0.5-1mg皮下注射。小兒高熱驚厥的急救高熱驚厥是兒科常見急癥，其起病急，發(fā)病率高，根據(jù)統(tǒng)計，3％～4％的兒童至少生過一次高熱驚厥。小兒驚厥的發(fā)生率高，是因較成人的大腦發(fā)育不完善，刺激的分析鑒別能力差，弱的刺激就可使大腦運動社經元異常放，引起驚厥。如驚厥時間過長或多次反復發(fā)作可使腦細胞受損，影響智力發(fā)育甚至危及生命。因此驚厥發(fā)作時及時恰當?shù)木戎魏妥o理顯得尤為重要。高熱驚厥臨床表現(xiàn)可分為簡單型和復雜型兩種。簡單型

特點：1、年齡：半歲至5歲之間，6歲上學后以后少見。2、發(fā)熱：一般是由于感冒初的急性發(fā)熱，驚厥大都發(fā)生在體溫驟升達到38.5℃至39.5℃時。3、發(fā)作形勢：意識喪失，全身性對稱性強直性陣發(fā)痙攣，還可表現(xiàn)為雙眼凝視、斜視、上翻。4、持續(xù)時間：持續(xù)時間：持續(xù)數(shù)秒鐘或數(shù)分鐘，一般不超過15分鐘，24小時內無復發(fā)，發(fā)作后意識恢復正?？?。5、腦電圖：體溫恢復正常后２周，腦電圖檢查正常。6、家族史：有很明顯的家族史。簡單型的高熱驚厥長期預后良好，對智力、學習、行為均無影響。隨著年齡的增長和大腦發(fā)育逐步建全，一般不會再發(fā)生高熱驚厥。急救及護理

1、保持呼吸道通暢立即解開患兒衣領，平放床上使之去枕平臥，頭偏向一側（切忌家長摟抱、按壓或顛搖患者），清除其口鼻分泌物，用裹有紗布的壓舌板填于其上下齒之間，以防咬破唇舌。必要時用舌鉗把舌拉出，以防舌后墜引起窒息。切忌在驚厥發(fā)作時給患兒喂藥，防止窒息。2、改善組織缺氧驚厥患兒因呼吸不暢，加之耗氧增加，導致組織缺氧。腦組織缺氧時，腦血管通透性增加，可引起腦組織水腫，致使驚厥加重，缺氧程度及持續(xù)時間