七=外源基因在真核細胞中的表達與調控

外源基因在真核細胞中的表達與調控山東大學醫(yī)學院免疫學研究所王曉燕現(xiàn)在是1頁\一共有180頁\編輯于星期三基因工程的基本程序

載體外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主細胞選出含有重組DNA的細胞abbAAb重組DNA的擴增或表達現(xiàn)在是2頁\一共有180頁\編輯于星期三基因重組的主要目的是要使目的基因在某一細胞中能得到高效表達，即產(chǎn)生人們所需要的高產(chǎn)目的基因產(chǎn)物，如蛋白質、多肽類生物藥物。基因工程技術的核心是基因表達技術?；虮磉_是指結構基因在調控序列的作用下轉錄成mRNA，經(jīng)加工后在核糖體的協(xié)助下又轉譯出相應的基因產(chǎn)物——蛋白質，再在受體細胞環(huán)境中經(jīng)修飾而顯示出相應的功能。從基因到有功能的產(chǎn)物這整個轉錄、轉譯及所有的加工過程就是基因表達的過程，它是在一系列酶和調控序列的共同作用下完成的?，F(xiàn)在是3頁\一共有180頁\編輯于星期三一、概述（一）幾個重要的概念1、表達系統(tǒng)（geneexpressionsystem)：

基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白質的體系，包括表達載體的構建、受體細胞的建立及表達產(chǎn)物的分離、純化?，F(xiàn)在是4頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是5頁\一共有180頁\編輯于星期三2、據(jù)受體細胞的不同可分為：1）原核表達系統(tǒng)：

將外源基因引入原核細胞，并使其在原核細胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達、合成基因產(chǎn)物的體系。2）真核表達系統(tǒng)：

使外源基因在真核細胞中表達的體系?，F(xiàn)在是6頁\一共有180頁\編輯于星期三（二）原核表達系統(tǒng)的局限性

1.缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)，不能進行糖基化、甲基化的修飾，影響某些蛋白的活性。2.在原核細胞中表達的真核蛋白不穩(wěn)定，易被細菌蛋白酶降解。3.很難實現(xiàn)真正的分泌出胞，其產(chǎn)量很低，而且容易出現(xiàn)信號肽不被切割，或不在特異位置上切割。4.表達產(chǎn)物常以包涵體（防止蛋白酶的水解）的形式存在，后期需要經(jīng)過變性（鹽酸胍或尿素）復性（二硫蘇糖醇、巰基乙醇等還原劑），并且復性效率低。5.內毒素的污染現(xiàn)在是7頁\一共有180頁\編輯于星期三真核基因組結構復雜龐大:形成復雜的染色質或者染色體基因不連續(xù)性:內含子、外顯子3.含有大量的重復序列：低度、中度或高度4.存在許多基因家族（有一定同源性而又不完全相同的基因簇）：如珠蛋白基因家族、ras基因家族等。5.沒有原核細胞的操縱子，不產(chǎn)生多順反子mRNA:即一個編碼基因轉錄生成一個mRNA分子，經(jīng)翻譯生成一條多肽鏈(單順反子mRNA）。6.基因表達調控復雜（三）真核基因組結構特點現(xiàn)在是8頁\一共有180頁\編輯于星期三(a)原核生物mRNA為多順反子(b)真核生物mRNA為單順反子現(xiàn)在是9頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是10頁\一共有180頁\編輯于星期三（四）真核基因表達調控特點——多方面、多層次1.轉錄前（基因組水平）調控：基因結構改變，持久且不可逆2.轉錄水平調控：3.轉錄后修飾：4.翻譯水平的調控：5.翻譯后修飾：現(xiàn)在是11頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是12頁\一共有180頁\編輯于星期三轉錄前調控1.基因丟失：目前認為這種調節(jié)方式主要是在較低等的真核生物中。2.基因擴增：是指某些基因的拷貝數(shù)專一性大量增加的現(xiàn)象。3.基因重排：是指某些基因片段改變原來存在的順序而重新排列組合。4.甲基化修飾：DNA甲基化是一種重要的基因組表觀遺傳修飾，參與調控許多細胞過程，包括胚胎發(fā)育、轉錄、染色質結構、X染色體失活、基因組印跡以及染色體穩(wěn)定性。5.染色質結構對基因表達的調控：細胞分裂時松開分散在核內的染色質稱為常染色質，常染色質的基因可以轉錄。染色體中的某些區(qū)段到分裂期后，仍保持緊湊折疊的結構，在間期核中可以看到其濃集的斑塊，稱為異染色質，基因不能轉錄表達?，F(xiàn)在是13頁\一共有180頁\編輯于星期三轉錄水平調控1.RNA聚合酶:I,II,III2.順式調控因子（cis-actingfactor)3.反式作用因子（trans-actingfactor)現(xiàn)在是14頁\一共有180頁\編輯于星期三酶主要轉錄產(chǎn)物RNA聚合酶ⅠrRNA，大多數(shù)snRNARNA聚合酶ⅡmRNA前體，部分snRNARNA聚合酶ⅢtRNA、部分snRNA

真核細胞中RNA聚合酶的種類現(xiàn)在是15頁\一共有180頁\編輯于星期三順式調控因子順式調控因子（cis-actingfactor)：是與結構基因串連的、對基因轉錄的精確起始和轉錄活性具重要調控作用的特定DNA序列。包括正性調控元件（啟動子、增強子）和負性調控元件（沉寂子、加尾和轉錄終止信號）現(xiàn)在是16頁\一共有180頁\編輯于星期三啟動子啟動子（Promoter）:位于基因的5'端與基因轉錄起始有關的核苷酸序列。一般包括轉錄起始點及其上游100-200bp序列作用特點：近距離作用、具有方向性、空間位置較恒定分類：核心啟動子元件（轉錄起始點上游-30bp區(qū)的TATA-box）：決定基因轉錄精確起始。上游啟動子元件(包括：-70至-80bp區(qū)域的CAAT盒及其兩側的GC盒):協(xié)同決定轉錄基礎效率。組織特異性元件:如肝細胞特異性啟動子元件HP1，與白蛋白、AFP等基因在肝細胞中的特異性表達有關。誘導性啟動子元件：如cAMP反應元件（CRE），介導對cAMP、生長因子等信號的反應。現(xiàn)在是17頁\一共有180頁\編輯于星期三

啟動子結構模式圖

SP1NF1

SP1TBP現(xiàn)在是18頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是19頁\一共有180頁\編輯于星期三表－1哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中

常見的元件元件名稱共同序列結合的蛋白因子名稱分子量DNA長度TATATATAAATFIID30,000～10bpGCGGGCGGSP-1105,000～20bpCAATGGCCAATCTCTF/NF160,000～22bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000～10bpATFGTGACGTATF?~20bpOctaneATTTGCATOct-176,000～10bp現(xiàn)在是20頁\一共有180頁\編輯于星期三增強子增強子(Enhancer):是一類本身不具備啟動子活性但能夠促進轉錄活性的順式調控元件。構成：由單拷貝或多拷貝組件串連構成，長100-200bp，核心組件8-12bp。作用特點：遠距離作用無方向性有啟動子依賴性，但對啟動子無嚴格專一性，因而無基因特異性。組織特異性相位性現(xiàn)在是21頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是22頁\一共有180頁\編輯于星期三負性調控元件沉寂子（silencer)或衰減子(dehancer)：是一類抑制基因轉錄的順式調控元件，作用方式同增強子。轉錄終止信號：加尾信號：AATAA,polyA上游10-20bpG/T簇：能形成發(fā)夾結構的反向重復序列現(xiàn)在是23頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是24頁\一共有180頁\編輯于星期三反式作用因子反式作用因子（Trans-actingfactor）:由位于不同或相同染色體上相距較遠的基因所編碼的蛋白質因子，通過與順式調控元件和RNA聚合酶的相互作用而調節(jié)基因轉錄活性?，F(xiàn)在是25頁\一共有180頁\編輯于星期三轉錄信號1PTrans-actingfactorTrans-actingfactor(DNA結合蛋白）Cis-actingfactorAgenemRNAofAProteinABgenemRNAofBProteinB現(xiàn)在是26頁\一共有180頁\編輯于星期三反式作用因子可以分為3類：（1）普通轉錄因子（通用轉錄因子）：主要識別啟動子的核心啟動成分，如TATA盒結合因子TFIID；（2）組織特異性轉錄因子：是特殊組織與細胞中的反式作用因子，如淋巴細胞中的Oct-2；（3）誘導性反式作用因子：與反應性元件（responseelements）相結合的反式作用因子。如HSRE（熱休克反應元件，heatshockresponseelement）

GRE（糖皮質激素反應元件，glucocorticoidresponseelement）

CRE（cAMP反應元件，cAMPresponseelement）

現(xiàn)在是27頁\一共有180頁\編輯于星期三反式作用因子的結構DNA結合域轉錄激活域TF富含谷氨酰胺結構域酸性α-螺旋結構域富含脯氨酸結構域同源結構域鋅指結構域亮氨酸拉鏈螺旋-環(huán)-螺旋螺旋-轉角-螺旋現(xiàn)在是28頁\一共有180頁\編輯于星期三螺旋轉角螺旋鋅指結構亮氨基拉鏈螺旋環(huán)螺旋同源結構域SP1OCT-2AP-1myc現(xiàn)在是29頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是30頁\一共有180頁\編輯于星期三1、RNA加工成熟：無論是rRNA、tRNA、mRNA，轉錄后都必須經(jīng)過加工，才能成為有功能的分子。rRNA：前體是45S，成熟的rRNA是18S、28S、5.8S，還要經(jīng)過化學修飾--核糖甲基化。tRNA：首先經(jīng)過核苷的修飾，生成4.5S前體tRNA，再剪接成為成熟的tRNA。mRNA：5’加帽子，3’加poly(A)，還要經(jīng)過剪接以及核苷酸的甲基化修飾。轉錄后水平的調控現(xiàn)在是31頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是32頁\一共有180頁\編輯于星期三

真核生物的基因可以分為兩大類：一類是簡單的轉錄單位；另一類是復雜轉錄單位。轉錄后加工方式是不同的。（1）簡單轉錄單位：編碼產(chǎn)生一個多肽，轉錄后加工有3種形式。a、基因沒有內含子，轉錄后無需加工，也沒有poly(A),如組蛋白基因。b、沒有內含子，無需剪切，但需要加poly(A)尾，如α-干擾素基因。c、有內含子，需要加工，及加poly(A)尾，但它們只產(chǎn)生一個有功能的mRNA，如ɑ,β-珠蛋白基因。2、轉錄后加工的多樣性現(xiàn)在是33頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是34頁\一共有180頁\編輯于星期三初級轉錄產(chǎn)物可通過不同的方式加工成兩個或兩個以上的mRNA。a、利用多個轉錄起始點或剪接位點產(chǎn)生不同的蛋白質。b、利用多個加多聚（A）位點和不同的剪切方式產(chǎn)生不同的蛋白質。c、雖無剪接，但有多個轉錄起始位點或加poly(A)位點。

（2）復雜轉錄單位現(xiàn)在是35頁\一共有180頁\編輯于星期三利用多個轉錄起始點或剪接位點產(chǎn)生不同的蛋白質現(xiàn)在是36頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是37頁\一共有180頁\編輯于星期三利用多個加多聚（A）位點和不同的剪切方式產(chǎn)生不同的蛋白質現(xiàn)在是38頁\一共有180頁\編輯于星期三雖無剪接，但有多個轉錄起始位點或加poly(A)位點現(xiàn)在是39頁\一共有180頁\編輯于星期三翻譯水平的調控對可溶性蛋白質因子的修飾：如eIF-2磷酸化后可抑制蛋白質的合成。對mRNA穩(wěn)定性的調節(jié)反義RNA對翻譯的調控作用反義RNA(anti-sense)：一段含有與被調控基因所產(chǎn)生mRNA互補的堿基序列的小分子RNA。①與mRNA結合，形成雙鏈RNA。影響mRNA的模板效率；②可能參與mRNA的拼接?，F(xiàn)在是40頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是41頁\一共有180頁\編輯于星期三1.多肽的切割：切去前端的信號肽2.多肽的有限水解：蛋白質（酶原）必須經(jīng)過有限的酶和化學水解才能變成有活性的物質。3.多肽的化學修飾：蛋白質磷酸化、糖基化（糖蛋白）、乙?；?.多肽的剪接：多肽被剪接成數(shù)個片段，再以一定的順序結合起來，形成有活性的蛋白質。翻譯后的調控現(xiàn)在是42頁\一共有180頁\編輯于星期三二、真核表達系統(tǒng)真核表達系統(tǒng)（Eukaryoticexpressionsystem)：指在真核細胞中表達外源基因的體系。

組成：真核表達載體受體細胞基因轉移方式現(xiàn)在是43頁\一共有180頁\編輯于星期三（一）真核表達系統(tǒng)的必要性和優(yōu)勢1.具有轉錄后加工系統(tǒng)：剪除內含子2.具有完善的翻譯后加工系統(tǒng)：對表達蛋白進行修飾，具有天然構型。3.可實現(xiàn)分泌表達:將表達產(chǎn)物分泌至細胞外培養(yǎng)液，簡化了純化工藝。4.有助于深入了解真核基因表達調控機制,實現(xiàn)基因治療?，F(xiàn)在是44頁\一共有180頁\編輯于星期三（二）真核表達載體真核表達載體：適用于在真核細胞中表達外源基因的載體。真核載體根據(jù)受體不同，可分為：酵母表達載體、哺乳動物表達載體、昆蟲桿狀病毒表達載體。現(xiàn)在是45頁\一共有180頁\編輯于星期三

真核表達載體包括在大腸桿菌中起作用的復制起始位點、抗生素抗性基因、多克隆位點等。真核表達載體中還具有：①真核表達調控元件：包括啟動子、增強子、轉錄終止序列、polyA加尾信號等②真核細胞復制起始序列③真核細胞藥物抗性基因現(xiàn)在是46頁\一共有180頁\編輯于星期三真核表達載體帶有的polyA加尾信號可保證新轉錄的mRNA能有效地加上polyA。真核表達載體的基本組成

OriPro：原核復制起始序列；P：啟動子；MCS：多克隆位點；TT：轉錄終止序列；orieuk：真核復制起始序列。注：不是所有真核表達載體都有整合序列PolyA現(xiàn)在是47頁\一共有180頁\編輯于星期三（三）真核表達系統(tǒng)1.酵母表達系統(tǒng)：利用酵母表達載體，在酵母細胞中表達外源基因2.哺乳動物細胞表達系統(tǒng)：利用重組質?；虿《据d體，在哺乳動物細胞內表達外源基因3.昆蟲細胞表達系統(tǒng)：利用昆蟲桿狀病毒表達載體，在昆蟲細胞內表達外源基因現(xiàn)在是48頁\一共有180頁\編輯于星期三

酵母表達系統(tǒng)

現(xiàn)在是49頁\一共有180頁\編輯于星期三特點及優(yōu)勢

酵母菌是單細胞真核生物，其遺傳背景清楚培養(yǎng)簡單，生長周期短，經(jīng)濟生物安全性高可分泌表達，簡化純化工藝現(xiàn)在是50頁\一共有180頁\編輯于星期三（一）酵母載體在酵母細胞中復制、擴增和表達的載體，包括克隆載體和表達載體。主要組成元件：篩選標記：如抗生素抗性基因Zeocin(博來霉素,屬于爭光霉素家族的成員）營養(yǎng)缺陷標記基因Leu(β異丙基蘋果酸脫氫酶,參與丙酮酸向亮氨酸的轉化)

現(xiàn)在是51頁\一共有180頁\編輯于星期三

Leu-作為酵母載體的選擇標記基因現(xiàn)在是52頁\一共有180頁\編輯于星期三用于酵母載體中的調控序列ARS（AutoReplicationSequence)：自主復制序列，為酵母復制起始區(qū)(點)。2μM質粒：酵母核質中的小的環(huán)狀DNA，可以獨立復制并轉錄。酵母啟動子：常用的有GAP（3-磷酸甘油醛脫氫酶）、AOX1（醇氧化酶-1）、ADH(乙醇脫氫酶)、SUC(蔗糖酶)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、Apase(堿性磷酸酶)啟動子。酵母著絲粒區(qū)段(CEN)：增加轉化子穩(wěn)定性?，F(xiàn)在是53頁\一共有180頁\編輯于星期三酵母載體的種類酵母克隆載體：不含酵母啟動子，不能在酵母中表達外源基因，如YIP、YRP、YEP酵母表達載體：酵母克隆載體+酵母啟動子,若引入信號肽序列，則成為分泌型載體YAC：酵母人工染色體（yeastartificialchromosome)可插入200～800kb的外源基因片段，因而特別適合高等真核生物基因組的克隆與表達研究?，F(xiàn)在是54頁\一共有180頁\編輯于星期三1.YIp(酵母整合型質粒)：細菌質粒DNA+酵母遺傳標記，通過同源重組整合入酵母染色體，轉化子穩(wěn)定，但轉化率極低。2.YRp(酵母復制型質粒)：細菌質粒DNA+酵母遺傳標記(YIp)+酵母復制序列(ARS),可自主復制，但穩(wěn)定性差。3.YEp(酵母附加子型質粒)：細菌質粒DNA+酵母標記基因(YIp)+酵母2μM質粒，游離于核外存在并自主復制。I.酵母克隆載體現(xiàn)在是55頁\一共有180頁\編輯于星期三

酵母克隆載體的構建現(xiàn)在是56頁\一共有180頁\編輯于星期三II.酵母表達載體含酵母啟動子穿梭載體(shuttlevector)：既可以攜帶外源基因在原核細胞中復制增殖，又可以在真核細胞中表達外源基因的載體。種類：釀酒酵母表達載體畢赤酵母表達載體分泌型表達載體：引入酵母的信號肽基因，如因子信號肽現(xiàn)在是57頁\一共有180頁\編輯于星期三釀酒酵母表達載體Leu2編碼β異丙基蘋果酸脫氫酶，作為篩選標記。帶有此質粒的酵母菌在不含有亮氨酸的培養(yǎng)基中能生長?，F(xiàn)在是58頁\一共有180頁\編輯于星期三畢赤酵母表達載體整合型HIS4編碼組氨醇脫氫酶基因，作為篩選標記。HIS4區(qū)的整合方式為位點特異性單交換引起的基因插入，整合后使營養(yǎng)缺陷型宿主恢復野生型，在不含組氨酸的培養(yǎng)基上能生長?，F(xiàn)在是59頁\一共有180頁\編輯于星期三5‘AOX1啟動子片段含有AOX1啟動子，在甲醇的誘導下可啟動外源蛋白的表達；α-因子信號肽序列為約89個氨基酸的信號肽序列，能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白的純化；多克隆位點含多個酶切位點，為外源基因的插入提供位點；TT序列提供有效的轉錄終止和polyA修飾信號；HIS4為營養(yǎng)缺陷型篩選標志；3‘AOX1基因片段能夠與基因組AOX1基因屬同源重組；抗Amp基因和pBR322能使空載體和構建的表達載體在E.coli中篩選和復制。以應用于畢赤酵母表達系統(tǒng)的pPIC9載體為例解釋載體的構件現(xiàn)在是60頁\一共有180頁\編輯于星期三畢赤酵母分泌型表達載體啟動外源基因的啟動子：PGAPPTEF1PEMT，MCS：多克隆位點鑒定的標記：6╳His，myc.終止子：AOX1TT，CYC1TT抗生素篩選標記：zeocin.復制起始位點：pUCori現(xiàn)在是61頁\一共有180頁\編輯于星期三III.酵母人工染色體（YAC）YAC:利用酵母的著絲粒序列（CEN）、酵母復制起始區(qū)（ARS）及端粒重復序列（TEL）構建的人工染色體結構：左臂：TEL、選擇標記、ARS、CEN右臂：TEL、選擇標記特點：容量大（200-800kb），穩(wěn)定性差作用：構建基因組文庫現(xiàn)在是62頁\一共有180頁\編輯于星期三

YAC載體中最常用的是pYAC4篩選標記:His3:組氨酸合成缺陷性標記URA3:尿嘧啶合成缺陷性標記SUP4:赭石突變(ade2-1)抑制基因sup4現(xiàn)在是63頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是64頁\一共有180頁\編輯于星期三（二）受體細胞1、釀酒酵母：它具有作為宿主菌必須具備的許多條件，是最早應用于外源基因克隆和表達的酵母菌。目前已表達了諸如乙型肝炎疫苗、人胰島素、人粒細胞集落刺激因子等多種外源基因產(chǎn)物。其缺點是在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乙醇，影響酵母的生長代謝和基因產(chǎn)物的表達。此外，釀酒酵母在蛋白質的加工過程中會發(fā)生過度糖基化作用，其分泌表達能力也有待提高?，F(xiàn)在是65頁\一共有180頁\編輯于星期三表1-3在釀酒酵母中表達的重組蛋白種類名稱疫苗乙肝病毒表面抗原，瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白，HIV－1外殼蛋白診斷試劑丙肝病毒蛋白，HIV－1抗原人類治療用蛋白藥物上皮生長因子，胰島素，類胰島素生長因子，血小板源生長因子，胰島素前體，成纖細胞生長因子，集落刺激因子，α1抗胰蛋白酶，凝血因子XⅢa現(xiàn)在是66頁\一共有180頁\編輯于星期三2、畢赤酵母：新發(fā)展的酵母受體細胞高表達（12mg/L）：AOX1啟動子或GAP啟動子高穩(wěn)定性：載體為整合型高分泌（10mg/L）：因子信號肽基因

在畢赤酵母中得到表達的重組異源蛋白有乙型肝炎表面抗原、人腫瘤壞死因子、人表皮生長因子、鏈激酶等幾十種。畢赤酵母的分泌表達能力比釀酒酵母強，但對其遺傳背景了解還比較少，且發(fā)酵周期也比較長?，F(xiàn)在是67頁\一共有180頁\編輯于星期三（三）轉化①鋰鹽法；②PEG法；③原生質球法；④電穿孔法。

電穿孔法：效率較高,應用最廣整合型載體轉化前要酶切線性化現(xiàn)在是68頁\一共有180頁\編輯于星期三（四）外源基因在酵母菌中的表達1、胞內表達：直接表達外源基因

2、分泌表達：在MCS前加入信號肽序列pGAPZ,利用因子分泌表達現(xiàn)在是69頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是70頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是71頁\一共有180頁\編輯于星期三人Endostatin基因的克隆、表達中國人胎肝總RNAEndostatincDNApGEM-T載體T-A克隆RT-PCR重組endostatin克隆載體pGAPZaA載體重組endostatin表達載體電轉化GS115畢赤酵母菌ZeocinSDS陽性重組子現(xiàn)在是72頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是73頁\一共有180頁\編輯于星期三重組Endostatin的初步純化與抑制作用研究陽性重組子大量擴增、表達endostatin蛋白培養(yǎng)上清超濾濃縮SepharoseG25去鹽Heparin親和層析初步純化的重組endostatin蛋白濃縮液透析抑制作用研究體外作用ECV304細胞HepG2.2.15細胞體內作用裸鼠人肝癌模型兔角膜新生血管現(xiàn)在是74頁\一共有180頁\編輯于星期三（五）高表達的策略1.利用誘導型強啟動子2.提高整合拷貝數(shù)3.控制蛋白酶降解活性4.分泌表達現(xiàn)在是75頁\一共有180頁\編輯于星期三（六）缺點不能實現(xiàn)全部的翻譯后修飾功能現(xiàn)在是76頁\一共有180頁\編輯于星期三哺乳動物細胞表達系統(tǒng)現(xiàn)在是77頁\一共有180頁\編輯于星期三優(yōu)點進行完全的翻譯后修飾可表達產(chǎn)生有功能的膜蛋白用途：表達大量的外源蛋白研究基因的功能基因治療

有效選擇轉化細胞，要求載體具備明顯的標記基因現(xiàn)在是78頁\一共有180頁\編輯于星期三（一）幾種常用的哺乳動物表達系統(tǒng)的選擇標記基因1、胸苷激酶(tk)基因2、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因3、新霉素抗性基因(neo)、4、氯霉素乙酰轉移酶基因檢測系統(tǒng)5、黃嘌呤-鳥嘌呤轉移酶（XGPRT）基因現(xiàn)在是79頁\一共有180頁\編輯于星期三1、胸苷激酶（tk）基因胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶（thymidineKinase,TK）在所有真核細胞中都有表達,是嘧啶生物合成補救代謝途徑中的一個關鍵酶,它可催化胸苷磷酸化轉變成為dTMP,繼續(xù)磷酸化生成dTTP,參與DNA的生物合成?，F(xiàn)在是80頁\一共有180頁\編輯于星期三tk+細胞中：胸苷(T)→胸苷-磷酸→TTP二氫葉酸二氫葉酸還原酶

四氫葉酸

TTPdCTPdATP

氨基喋呤(Aminopterin)

tk阻斷補加次黃嘌呤（H）死亡存活補救合成現(xiàn)在是81頁\一共有180頁\編輯于星期三胸苷激酶(tk)基因HAT選擇法原理攜帶外源基因的載體連接有tk基因，可以表達胸苷激酶以tk－細胞為受體細胞在HAT（次黃嘌呤－氨基喋呤－胸苷）選擇培養(yǎng)基中，只有外源基因轉化成功的tk+細胞存活，tk-細胞死亡則陽性重組子在HAT中篩選出來現(xiàn)在是82頁\一共有180頁\編輯于星期三2、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因二氫葉酸二氫葉酸還原酶

四氫葉酸

TTPdCTPdATP

氨基蝶呤氨甲喋呤阻斷現(xiàn)在是83頁\一共有180頁\編輯于星期三二氫葉酸還原酶基因篩選法原理

攜帶外源基因的載體連接有dhfr基因，可以表達二氫葉酸還原酶以dhfr-細胞為受體：CHO細胞dhfr-細胞無法在普通培養(yǎng)基中存活，而轉化入dhfr基因后可以存活，并表達外源基因。若在培養(yǎng)基內加入氨甲蝶呤，進行加壓篩選，可以提高外源基因表達量?，F(xiàn)在是84頁\一共有180頁\編輯于星期三3、新霉素抗性基因(neo)新霉素的類似物G418（gentamycin）對原核、真核細胞均有毒性。攜帶外源基因的載體連接有neo基因，neo編碼的磷酸轉移酶可滅活G418，因而，只有轉化入neo基因的細胞才能夠在含有G418的培養(yǎng)基中存活。此種篩選方法要求載體攜帶neo基因，而對受體細胞無要求，應用更為簡便?，F(xiàn)在是85頁\一共有180頁\編輯于星期三4、氯霉素乙酰轉移酶基因檢測系統(tǒng)

氯霉素乙酰轉移酶（Cat）是由大腸桿菌轉座子Tn9編碼的。Cat可催化氯霉素發(fā)生乙酰化作用，使其實去活性。雖然真核細胞不含有內源性的Cat酶活性，但真核細胞的啟動子可引發(fā)外源性Cat基因的表達。現(xiàn)在是86頁\一共有180頁\編輯于星期三以Cat基因作為選擇標記的原理將帶有Cat基因的質粒載體轉化到哺乳動物細胞后，就會合成Cat。哺乳動物細胞本身不能合成Cat，所以只要在轉化的細胞中檢測到Cat的活性，即可肯定它是來自外源的Cat質粒。特別適用于瞬時表達的研究?，F(xiàn)在是87頁\一共有180頁\編輯于星期三5、黃嘌呤-鳥嘌呤轉移酶（XGPRT）基因XGPRT是由大腸桿菌Ecogpt基因編碼的一種核苷酸代謝酶，哺乳動物細胞無XGPRT酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤核苷酸（XMP），但有鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT），可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤核苷酸（IMP）。哺乳動物細胞可通過IMP生成GMP。當用IMP脫氫酶抑制劑霉酚酸，抑制了GMP的合成，使細胞失去合成DNA能力而死亡。現(xiàn)在是88頁\一共有180頁\編輯于星期三黃嘌呤-鳥嘌呤轉移酶（XGPRT）

基因篩選法原理將含XGPRT基因的重組體導入真核細胞后，在轉化細胞中就能表達XGPRT酶，可在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中通過XMP中間體補救合成GMP，使DNA合成正常進行。加入霉酚酸后，陽性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而未轉化的陰性細胞則受霉酚酸的抑制而死亡，以此可用來篩選陽性細胞?，F(xiàn)在是89頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是90頁\一共有180頁\編輯于星期三（二）外源基因導入哺乳動物

細胞的載體質粒型(非病毒型)載體病毒型載體現(xiàn)在是91頁\一共有180頁\編輯于星期三啟動子：病毒來源的：SV40、CMV、RSV細胞來源的：HSP、MCK（肌酸激酶）增強子:來源于SV40、RSV、CMV（在不同種屬細胞中都有極強的促進轉錄能力）篩選標記原核序列：復制子及篩選標記真核復制起始點：提高外源基因表達水平轉錄終止信號和多聚腺苷酸化信號

哺乳動物細胞表達載體的主要元件現(xiàn)在是92頁\一共有180頁\編輯于星期三1.質粒型載體由真核復制信號、啟動子、轉錄單位及質粒片段組成,不需要包裝細胞。如：pcDNA3、pVAX1、pEGFP-N1等?，F(xiàn)在是93頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是94頁\一共有180頁\編輯于星期三BGH：BovineGrowthHormone現(xiàn)在是95頁\一共有180頁\編輯于星期三pVAX1的特點不僅具有在大腸桿菌中高拷貝復制和在多數(shù)哺乳類動物細胞中高效表達蛋白的特點,而且pVAX1具有卡那霉素抗性,在人體內產(chǎn)生變應反應者較少。pVAX1是由美國食品和藥品管理委員會（FDA）推薦的唯一可以應用于人體實驗的載體質粒。迄今為止，關于pVAX1的研究已涉及動物和臨床試驗。現(xiàn)在是96頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是97頁\一共有180頁\編輯于星期三pEGFP-N1載體具有以下幾方面特點：

①從結構上看，該質粒具有很強的復制能力，可以滿足隨宿主細胞分裂時跟隨胞質遺傳給新生的子細胞，這是保證目的基因穩(wěn)定表達的因素之一；

②含有高效的功能強大的啟動子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的細胞中穩(wěn)定表達；

③具有多克隆位點，便于目的基因的插入；

④該載體具有neo基因，可以采用G418來篩選已成功轉染了該載體的靶細胞。

這些特殊的結構可以實現(xiàn)目的基因在靶細胞內的穩(wěn)定表達。

現(xiàn)在是98頁\一共有180頁\編輯于星期三GFP的相關知識：

綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)基因來源于JellyfishAequoreaVictoria，是Shimomura等于1962年發(fā)現(xiàn)的蛋白質，由238個氨基酸組成，分子量約為27Kd。GFP在包括熱、極端PH和化學變性劑等苛刻條件下都很穩(wěn)定，用甲醛固定后會持續(xù)發(fā)出熒光，但在還原環(huán)境下熒光會很快熄滅。

現(xiàn)在是99頁\一共有180頁\編輯于星期三與以往常用的報告基因相比，GFP具有以下優(yōu)點：

①在熒光顯微鏡下，用波長約490nm的紫外線激發(fā)后，即可觀察到綠色熒光，直接、簡捷、便于檢測；

②無需任何的作用底物或共作用物,檢測的靈敏度不受反應效率的影響，保證了極高的檢出率；

③蛋白本身性質穩(wěn)定；

④可在多種異源生物中表達且無細胞毒性；

⑤其基因片段長度較小(約717bp)，易于構建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發(fā)活性，為研究其他基因表達產(chǎn)物的分布提供了方便。

現(xiàn)在是100頁\一共有180頁\編輯于星期三EGFP是一種優(yōu)化的突變型GFP，使其產(chǎn)生的熒光較普通GFP強35倍，大大增強了其報告基因的敏感度。EGFP與其他蛋白的融合表達已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影響其發(fā)光。

現(xiàn)在是101頁\一共有180頁\編輯于星期三2.病毒型載體外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重組DNA隨病毒顆粒而復制(多需輔助病毒或包裝細胞的存在)。如：逆轉錄病毒載體、腺病毒載體等現(xiàn)在是102頁\一共有180頁\編輯于星期三病毒型載體的類型整合型整合入宿主染色體，隨染色體復制而復制可持續(xù)表達外源基因安全性低：插入誘變SV40載體，逆轉錄病毒載體，慢病毒載體，腺相關病毒載體游離型不整合生物安全性高瞬時表達腺病毒載體，痘苗病毒載體現(xiàn)在是103頁\一共有180頁\編輯于星期三SV40(猴空泡病毒40)載體dsDNA病毒，基因組約5.2kb基因結構清楚,含有整套基因表達調控序列早期區(qū)：T、t抗原（腫瘤蛋白質或抗原）T抗原是細胞轉化的啟動所必須的。t抗原對于細胞的轉化不是必需的，但可起加強作用。

晚期區(qū)：產(chǎn)生病毒衣殼蛋白（VP1，VP2及VP3)，包裝病毒顆粒所必需復制起始位點：早、晚區(qū)基因之間現(xiàn)在是104頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是105頁\一共有180頁\編輯于星期三特點載體構建：早期取代晚期取代天然SV40載體宿主范圍窄，容量?。?.5kb）易形成野生型病毒溶源生長：導致宿主細胞裂解死亡故較少使用，做瞬時轉染用（轉化COS細胞），或利用其調控元件。pSV系列由SV40派生的一系列質粒型載體現(xiàn)在是106頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是107頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是108頁\一共有180頁\編輯于星期三逆轉錄病毒載體(RV)

基因組結構：ssRNA(9.2kb)LTRgagpolenvLTRφLTR（longterminalrepeat）:長末端重復序列,含啟動子和polyA信號,介導病毒整合。φ包裝信號：是包裝病毒顆粒時所必須的非編碼序列。結構蛋白：核心蛋白(gag)、逆轉錄酶（pol)、衣殼蛋白(env)?，F(xiàn)在是109頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是110頁\一共有180頁\編輯于星期三逆轉錄病毒穿梭載體pLXSNMCS現(xiàn)在是111頁\一共有180頁\編輯于星期三載體元件：LTR、標記基因及質粒部分組成逆轉錄病毒載體系統(tǒng)包括：一個含有目的基因的表達載體；一個編碼VSV-G（皰疹性口腔炎病毒糖蛋白G，是一種包膜蛋白，具有廣泛的宿主范圍）的輔助質粒；表達gag/pol的輔助質粒；293T（人胚腎細胞）包裝細胞。

現(xiàn)在是112頁\一共有180頁\編輯于星期三優(yōu)點：宿主范圍廣，能感染多種動物和人類的不同類型的細胞而無嚴格的組織特異性；逆轉錄病毒載體能夠高效地感染分裂的宿主細胞，感染細胞后能夠將載體基因組穩(wěn)定整合到宿主基因組的隨機位點上，使目的基因長期穩(wěn)定表達。逆轉錄病毒的免疫原性較低。缺點：只能感染分裂細胞，而不能感染非分裂細胞；能夠插人的外源基因較小(7～8kb)，難以滿足較大基因的轉移；載體DNA整合人宿主染色體是隨機的，并因隨機整合使原癌基因激活或抑癌基因失活，從而具有引發(fā)癌癥的風險；

現(xiàn)在是113頁\一共有180頁\編輯于星期三目的基因

RV穿梭載體

包裝細胞系重組RV載體E．coli大量擴增病毒載體DNA重組逆轉錄病毒顆粒受體細胞

表達蛋白，研究宿主細胞性狀克隆共轉染感染轉化輔助質粒篩選、擴增現(xiàn)在是114頁\一共有180頁\編輯于星期三

慢病毒載體（lentivirus）屬逆轉錄病毒亞屬，是一類非鼠源性逆轉錄病毒，以人類免疫缺陷病毒（HIV）為代表。慢病毒源性載體（lentivirus-basedvector，LV）：能將外源基因整合入非分裂細胞的基因組內。無明顯免疫反應，長期的轉基因表達。具有嚴格的宿主范圍、滴度低及HIV-1獨特的致病性，限制了它作為轉基因載體的應用。主要應用于轉染神經(jīng)元，效果好于腺相關病毒載體和逆轉錄病毒載體。

現(xiàn)在是115頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是116頁\一共有180頁\編輯于星期三腺相關病毒載體（AAV）腺相關病毒：Adeno-AssociatedVirus，AAV線狀單鏈DNA病毒，4.7kb，缺陷型非病原性人類細小病毒，只有與腺病毒、單純皰疹病毒等共感染時才能進行有效復制。感染細胞范圍廣，可感染分裂期與分裂后期細胞野生型病毒可定點整合人類19號染色體長臂，基因表達穩(wěn)定;

現(xiàn)在是117頁\一共有180頁\編輯于星期三缺點外源基因插入容量小（5kb以下）感染效率比逆轉錄病毒低制備滴度低存在一定的免疫反應主要應用于轉染骨骼肌、視網(wǎng)膜、肝細胞、神經(jīng)元細胞等現(xiàn)在是118頁\一共有180頁\編輯于星期三腺病毒（Ad）載體基因結構：dsDNA,線性，36kbφE1A

E1BL1E3E2AE2BE4Φ：包裝信號E1—E4:結構蛋白現(xiàn)在是119頁\一共有180頁\編輯于星期三載體構建：取代結構基因特點：安全性高(人為自然宿主，不整合)滴度高（1011pfu/ml）容量大（--36kb)可感染非分裂細胞可直接體內應用，原位感染組織是目前基因治療的最常用載體缺點：免疫原性高，表達時間短無組織特異性真核細胞內篩選復雜，費時現(xiàn)在是120頁\一共有180頁\編輯于星期三AdEasy-1systemAdEasy-1system具有以下優(yōu)點：1.效率高：可以感染分裂期與靜止期細胞2.篩選方便：帶有目的基因的穿梭載體與病毒骨架質粒的同源重組發(fā)生于原核細胞（如細菌）內。3.生物安全性高：不整合4.插入容量大現(xiàn)在是121頁\一共有180頁\編輯于星期三AdEasy-1system包括：腺病毒穿梭載體：可連接外源基因骨架質粒：含有腺病毒大部分結構基因的質粒，pAdEasy-1受體細胞：E.coliBJ5183包裝細胞：轉入E1或E4基因區(qū)的HEK293（人胚腎細胞）或911細胞（人胚視網(wǎng)膜細胞）現(xiàn)在是122頁\一共有180頁\編輯于星期三穿梭載體現(xiàn)在是123頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是124頁\一共有180頁\編輯于星期三痘苗病毒載體容量大安全性好：長期用作預防天花的疫苗可用來構建多價疫苗

現(xiàn)在是125頁\一共有180頁\編輯于星期三常用的病毒載體的特點：現(xiàn)在是126頁\一共有180頁\編輯于星期三（三）受體細胞1、CHO細胞（中國倉鼠卵巢癌細胞）可穩(wěn)定表達外源基因，并可大規(guī)模生產(chǎn)藥物、抗體及診斷試劑，被美國FDA確認為基因工程受體細胞。2、COS細胞（猴腎細胞系）能瞬時大量表達外源蛋白，是進行外源基因瞬時表達時用途最廣的宿主細胞。3、其他細胞：如腫瘤細胞Hela(人宮頸癌細胞）等。現(xiàn)在是127頁\一共有180頁\編輯于星期三（四）重組載體導入細胞的方法現(xiàn)在是128頁\一共有180頁\編輯于星期三1.病毒感染：借用病毒的感染方式，將外源基因事先插入到病毒的基因組中，并用適當?shù)姆绞桨b成有感染活性的重組病毒顆粒，用于感染細胞，從而將外源病毒導入到相應的細胞中。常用：逆轉錄病毒；腺病毒；皰疹病毒等。優(yōu)點：整和效率高,可使外源基因在宿主細胞中長期表達,適用于難以轉染的原代細胞。缺點：重組病毒建立有一定難度；存在潛在的安全危險性?，F(xiàn)在是129頁\一共有180頁\編輯于星期三目的基因

AdV穿梭載體

包裝細胞HEK293

重組AdV載體E．coli

BJ5183同源重組陽性的腺病毒基因組載體DNA重組rAd病毒顆粒受體細胞

表達蛋白，研究宿主細胞性狀克隆轉染感染骨架質粒共轉染轉化E．coli

擴增轉化Ecoli擴增現(xiàn)在是130頁\一共有180頁\編輯于星期三圖1：復制缺陷型重組腺病毒載體制備原理圖圖2輔助病毒依賴型腺病毒載體制備示意圖現(xiàn)在是131頁\一共有180頁\編輯于星期三2.轉染：外源DNA導入到細胞中的非病毒方法，通常稱為轉染。分化學方法和物理方法。理想的轉染方法：操作簡單、高效、低毒、對細胞正常生理狀況影響小、重復性好、成本低。磷酸鈣共沉淀法陽離子脂質體轉染受體介導的基因轉移電穿孔顯微注射基因槍現(xiàn)在是132頁\一共有180頁\編輯于星期三Atypicalmammalianexpressionvectorforhigh-levelproteinexpression現(xiàn)在是133頁\一共有180頁\編輯于星期三磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣有利于促進外源DNA與靶細胞表面結合,氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定的比例混和,形成極小的磷酸鈣-DNA復合物沉淀黏附在細胞膜表面,借助內吞作用進入細胞質。沉淀顆粒的大小和質量對于轉染的成功至關重要?，F(xiàn)在是134頁\一共有180頁\編輯于星期三磷酸鈣共沉淀法的優(yōu)缺點優(yōu)點：能用于任何DNA導入哺乳類動物,瞬時轉染和穩(wěn)定轉染。缺點：轉染效率低：進入細胞的DNA只有１％－５％可以進入細胞核,其中只有不到１％的DNA可以與細胞DNA整合,在細胞中進行穩(wěn)定表達。重復性不佳：pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應時間、細胞孵育時間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對結果產(chǎn)生影響?，F(xiàn)在是135頁\一共有180頁\編輯于星期三脂質體介導基因轉移法中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA,借助脂質膜將DNA導入細胞膜內。

現(xiàn)在是136頁\一共有180頁\編輯于星期三帶正電的陽離子脂質體,DNA并沒有預先包埋在脂質體中,而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上,形成DNA-陽離子脂質體復合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經(jīng)過內吞被導入細胞?，F(xiàn)在是137頁\一共有180頁\編輯于星期三脂質體介導方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：適用于把ＤＮＡ轉染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞,可用于瞬時轉染和穩(wěn)定轉染；轉染效率高,比磷酸鈣法高5-100倍；能夠把ＤＮＡ和ＲＮＡ轉染到各種細胞,轉染的穩(wěn)定性好,可重復性高,轉染時最好不加血清和抗生素。缺點：陽離子脂質體細胞毒性相對較高,對部分細胞可能會干擾細胞的代謝。現(xiàn)在是138頁\一共有180頁\編輯于星期三受體介導的基因轉移

配體寡肽E5針對細胞表面受體（IGFRI，II）HA20流感病毒血凝素功能域20肽，作為內吞小體釋放寡肽多聚陽離子多肽PCP多聚賴氨酸（PL）攜帶外源基因的質粒DNA現(xiàn)在是139頁\一共有180頁\編輯于星期三質粒DNAE5-PCP-PLHA20-PCP-PLHA20：破壞溶酶體膜E5：特異性導入肝癌細胞吞噬溶酶體現(xiàn)在是140頁\一共有180頁\編輯于星期三電穿孔介導基因轉移法

靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞.

現(xiàn)在是141頁\一共有180頁\編輯于星期三電穿孔法的優(yōu)缺點優(yōu)點：轉染效率較高缺點：需要昂貴的儀器（電穿孔儀）；對細胞的損傷較大,每次轉染需要更多的細胞和DNA；每種細胞電轉的條件都需要進行多次優(yōu)化.

現(xiàn)在是142頁\一共有180頁\編輯于星期三其它方法顯微注射：借助顯微注射器直接把DNA注入核內,使之整合入受體細胞基因組中.優(yōu)點：轉染效率高,可用于瞬時轉染和穩(wěn)定轉染。缺點：導入DNA時需要一個細胞一個細胞注射,不適合大量轉染。基因槍：依賴攜帶了核酸的高速粒子將核酸導入細胞內.

現(xiàn)在是143頁\一共有180頁\編輯于星期三基因體內治療方法exvivo途徑：即體外細胞介導法，通過移植攜帶靶基因的工程細胞完成目的基因轉移，是基因轉移技術和腦內移植技術的結合。特點：經(jīng)典、安全，效果較易控制，但是存在操作步驟多、技術復雜、難度大及若采用人類胚胎細胞則涉及倫理學問題。

invivo途徑：即體內直接轉染法，是體內基因治療的直接途徑，操作簡便、易推廣，但方法尚不成熟、未能解決療效短、免疫和安全問題。包括非病毒介導途徑與病毒載體介導途徑。

現(xiàn)在是144頁\一共有180頁\編輯于星期三目的基因靶細胞體外擴增工程細胞或基因修飾的細胞篩選鑒定腦內靶區(qū)Minipump分泌營養(yǎng)因子，神經(jīng)遞質，酶

移植

現(xiàn)在是145頁\一共有180頁\編輯于星期三基因的體內直接轉移方法非病毒類載體介導途徑：通過物理法、化學法或融合法直接將目的基因導入體內。1）裸DNA2）脂質體(Liposome)介導：Lipid/DNAcomplex3）基因槍：基因槍是一種專門用于基因轉移的高壓槍,可以把平均直徑約為4μm的鎢等金屬粒子射入細胞中,若將目的DNA附著在金屬粒子表面,就可以實現(xiàn)基因的直接轉移。

4）電轉移法：體內電轉移是適用于向各種組織和器官轉運基因的一種物理方法,而且成本低、最易實現(xiàn)、安全性高,其效率還可通過改善靶組織的生物擾動性、質粒DNA的結構和編碼蛋白的設計來提高?，F(xiàn)在是146頁\一共有180頁\編輯于星期三病毒類載體介導途徑：將無復制能力含外源基因的重組病毒直接應用于患者體內。雖然病毒載體作為基因傳遞的工具已廣泛采用,但病毒性載體仍存在著不少的局限性:如均可誘導機體產(chǎn)生某種程度的免疫反應,具有插入突變致瘤、致毒的風險,載體的容量有限,制備滴度不高等。

現(xiàn)在是147頁\一共有180頁\編輯于星期三

瞬時轉染：外源基因導入到哺乳動物細胞后1～4天，就可以檢測到基因的表達情況。表達完全由導入的質粒來執(zhí)行，絕大多數(shù)質粒沒有整合到染色體上而被降解或隨細胞分裂而丟失。永久轉染：導入的基因整合到細胞的染色體DNA中。

（五）外源基因在哺乳動物細胞中的表達方式現(xiàn)在是148頁\一共有180頁\編輯于星期三（六）哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的缺點需要組織培養(yǎng)篩選時間長價格昂貴現(xiàn)在是149頁\一共有180頁\編輯于星期三昆蟲細胞表達系統(tǒng)現(xiàn)在是150頁\一共有180頁\編輯于星期三優(yōu)點具有真核細胞的翻譯后修飾功能；

正確的蛋白折疊、二硫鍵形成，使重組蛋白在結構和功能上更接近天然蛋白；

高表達量，最高表達量可達昆蟲細胞蛋白總量的50%；

可表達非常大的外源性基因（～200kD）；

具有在同一個感染昆蟲細胞內同時表達多個基因的能力；

對脊椎動物是安全的?，F(xiàn)在是151頁\一共有180頁\編輯于星期三(一)昆蟲桿狀病毒載體1、昆蟲桿狀病毒許多農林業(yè)昆蟲的天敵，對人無寄生能力，安全性高?；蚪M特點：Baculivirus基因組龐大具復制非必需區(qū)，可用于改造為基因工程載體（多角體蛋白編碼序列、P10蛋白序列）現(xiàn)在是152頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是153頁\一共有180頁\編輯于星期三2、桿狀病毒載體轉移載體

轉移載體（transfervector):同時含有原核序列(復制起始信號、抗性基因)和病毒基因組序列的載體,除可攜帶外源基因在原核中復制、擴增外，還可通過細胞內同源重組，將外源基因插入病毒基因組，構建重組病毒。現(xiàn)在是154頁\一共有180頁\編輯于星期三基本元件原核序列：ori、抗性基因桿狀病毒啟動子桿狀病毒復制非必需區(qū)MCS現(xiàn)在是155頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是156頁\一共有180頁\編輯于星期三（二）受體細胞1、sf（秋粘蟲）細胞2、Bm（家蠶）細胞3、昆蟲幼蟲現(xiàn)在是157頁\一共有180頁\編輯于星期三（三）以桿狀病毒為載體表達目的基因的流程圖

現(xiàn)在是158頁\一共有180頁\編輯于星期三三、基因表達產(chǎn)物的檢測基因轉錄水平檢測NorthernBlot、RT-PCR蛋白翻譯水平檢測ELISA、WesternBlot生物活性檢測根據(jù)表達產(chǎn)物特性進行設計現(xiàn)在是159頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是160頁\一共有180頁\編輯于星期三RNA干擾將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導致其相應的基因沉默。這種轉錄后基因沉默機制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被稱為RNA干擾（RNAi）?，F(xiàn)在是161頁\一共有180頁\編輯于星期三

siRNA誘導干擾復合體(siRNAinducedinterferencecomplex,RISC),依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA2dependentRNApolymerase,RdRP)現(xiàn)在是162頁\一共有180頁\編輯于星期三RNAi研究的一般技術路線現(xiàn)在是163頁\一共有180頁\編輯于星期三現(xiàn)在是164頁\一共有180頁\編輯于星期三

各種siRNA制備方法比較比較項目

化學合成siRNA

DNA載體shRNA

Lentiviral-shRNA

siRNA結構

雙鏈RNA或發(fā)夾結構RNA

發(fā)夾結構RNA

發(fā)夾結構RNA

RNA干擾持續(xù)時間

<72小時

<10天

>30天

適合的細胞系

轉染效率大于70%的細胞

轉染效率大于20%

但是可以傳代的細胞

幾乎所有細胞

單次制備費用

低

中

高

重復使用費用

中

低

低

是否可自行擴增

不可以

可以

不可以

構建穩(wěn)定表達siRNA

的細胞株

不滿足

滿足，但有風險

滿足，可以同時制備

多種穩(wěn)定表達細胞系

組織特異性干擾實驗

不滿足

滿足

滿足

干細胞分化實驗

不滿足

不滿足

滿足

裸鼠荷瘤實驗

低重復性

低重復性

高重復性

轉基因knockdown實驗

不滿足

不滿足

滿足

現(xiàn)在是165頁\一共有180頁\編輯于星期三SiRNA的一般設計原則（1）從mRNA的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議不要針對5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslatedregions，UTRs）。這些地方有豐富的調控蛋白結合區(qū)域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。（2）將潛在的序列和相應的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST。（3）選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

現(xiàn)在是166頁\一共有180頁\編輯于星期三轉染細胞siRNAs需要進入細胞后才能對蛋白的表達進行抑制，因此將其高效地轉入細胞也是研究成功與否的關鍵步驟。例如，一個siRNA對某個特定基因表達的抑制效率是90%，但是其轉染效率只有10%，那么總的抑制率只有9%。目前傳統(tǒng)的轉染方法與試劑的效果都不是很理想。但是有專門的RNA轉染試劑，其原理也是基于脂質體技術，可用于多種真核細胞的RNAi研究。現(xiàn)在是167頁\一共有180頁\編輯于星期三陰性對照一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照。可以確認基因表達水平的降低是否是序列特異性的RNAi的結果。作為負對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和其他基因沒有同源性。

現(xiàn)在是168頁\一共有180頁\編輯于星期三陽性對照和空白對照陽性對照應該選用針對看家基因（GAPDH、ACTB）的siRNA進行實驗，以確認這條實驗途徑是可行的?？瞻讓φ詹坏扔陉幮詫φ眨瞻讓φ帐遣患觭iRNA的結果?，F(xiàn)在是169頁\一共有180頁\編輯于星期三RNAi的效果分析可從mRNA和蛋白質兩方面進行。mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern雜交等。蛋白質：Western雜交；ELISA；免疫熒光等。細胞的代謝過程，生理生化系數(shù)等表型參數(shù)的變化是RNAi效果最終和最大的體現(xiàn)。現(xiàn)在是170頁\一共有180頁\編輯于星期三MicroRNAMic