分子生物學基因組概述

分子生物學基因組概述第1頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四CH3

THECONTENT

OFTHEGENOME

基因組概述第2頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四3.1Introduction

3.2Genomescanbemappedbylinkage,restrictioncleavage,orDNAsequence(用連鎖、限制酶切割或者DNA測序繪制基因組圖譜

)3.3Individualgenomesshowextensivevariation(個體基因組變化很大

)3.4RFLPsandSNPscanbeusedforgeneticmapping(RFLP和SNP能夠用來繪制遺傳圖譜

)3.5Whyaregenomessolarge(基因組為何如此之大

)?3.6ThehumangenomehasfewergenesthanExpected(人類基因組的基因數(shù)目比預想的要少

)第3頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四3.7Howmanygenesareessential(有多少基因是必需的

)?3.8Genesareexpressedatwidelydifferinglevels(基因的表達量相差很大

)3.9OrganelleshaveDNA(細胞器也含有DNA)3.10OrganellegenomesarecircularDNAsthatcodefororganelleproteins(細胞器基因組是環(huán)狀ONA分子，它們編碼細胞器蛋白質(zhì))3.11MitochondrialDNAorganizationisvariable(線粒體DNA的結構是可變的

)3.12Mitochondriaevolvedbyendosymbiosis(線粒體是通過內(nèi)共生演化來的

)3.13ThechloroplastgenomecodesformanyproteinsandRIMAs(葉綠體基因組編碼多種蛋白質(zhì)和RNA)第4頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

3.1IntroductionThegenomeisthecompletesetofgenesofanorganism.UltimatelyitisdefinedbythecompleteDNAsequence,althoughasapracticalmatteritmaynotbepossibletoidentifyeverygeneunequivocallysolelyonthebasisofsequence.基因組（genome

）是有機體內(nèi)一組完整的基因，它最終由DNA的全序列決定，實際上我們不可能只根據(jù)序列來準確鑒定每一條基因。第5頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四基因組，Genome，一般的定義是單倍體細胞中的全套染色體為一個基因組，或是單倍體細胞中的全部基因為一個基因組?？墒腔蚪M測序的結果發(fā)現(xiàn)基因編碼序列只占整個基因組序列的很小一部分。因此，基因組應該指單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子。說的更確切些，核基因組是單倍體細胞核內(nèi)的全部DNA分子；線粒體基因組則是一個線粒體所包含的全部DNA分子；葉綠體基因組則是一個葉綠體所包含的全部DNA分子。

第6頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

基因是生命遺傳的基本單位，由30億個堿基對組成的人類基因組，蘊藏著生命的奧秘。始于1990年的國際人類基因組計劃，被譽為生命科學的“登月”計劃，原計劃于2005年完成。各國所承擔工作比例約為美國54％，英國33％，日本7％，法國2.8％，德國2.2％，中國1％。此前，人類基因組“工作框架圖”已于2000年6月完成，科學家發(fā)現(xiàn)人類基因數(shù)目約為2.5萬個，遠少于原先10萬個基因的估計。人類基因組是全人類的共同財富。國內(nèi)外專家普遍認為，基因組序列圖首次在分子層面上為人類提供了一份生命“說明書”，不僅奠定了人類認識自我的基石，推動了生命與醫(yī)學科學的革命性進展，而且為全人類的健康帶來了福音。第7頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四基因組（GENOME）一詞是1920年Winkles從GENes和chromosOEs鑄成的，用于描述生物的全部基因和染色體組成的概念。1986年美國科學家ThomasRoderick提出了基因組學（Genomics），指對所有基因進行基因組作圖（包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄本圖譜），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一門科學。因此，基因組研究應該包括兩方面的內(nèi)容：以全基因組測序為目標的結構基因組學（structuralgenomics）和以基因功能鑒定為目標的功能基因組學（functionalgenomics)，又被稱為后基因組（postgenome）研究。第8頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四功能基因組學（Functuionalgenomics）又往往被稱為后基因組學（Postgenomics），它利用結構基因組所提供的信息和產(chǎn)物，發(fā)展和應用新的實驗手段，通過在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能，使得生物學研究從對單一基因或蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向多個基因或蛋白質(zhì)同時進行系統(tǒng)的研究。這是在基因組靜態(tài)的堿基序列弄清楚之后轉(zhuǎn)入對基因組動態(tài)的生物學功能學研究。第9頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四研究內(nèi)容包括基因功能發(fā)現(xiàn)、基因表達分析及突變檢測?；虻墓δ馨ǎ荷飳W功能，如作為蛋白質(zhì)激酶對特異蛋白質(zhì)進行磷酸化修飾；細胞學功能，如參與細胞間和細胞內(nèi)信號傳遞途徑；發(fā)育功能，如參與形態(tài)建成等。采用的手段包括經(jīng)典的減法雜交，差示篩選，cDNA代表差異分析以及mRNA差異顯示等，但這些技術不能對基因進行全面系統(tǒng)的分析，新的技術應運而生，包括基因表達的系統(tǒng)分析（serialanalysisofgeneexpression,SAGE），cDNA微陣列（cDNAmicroarray），DNA芯片（DNAchip）等。第10頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四Thetranscriptomeisthecompletesetofgenesexpressedunderparticularconditions.ItisdefinedintermsofthesetofRNAmoleculesthatispresent,andcanrefertoasinglecelltypeortoanymorecomplexassemblyofcellsuptothecompleteorganism.BecausesomegenesgeneratemultiplemRNAs,thetranscriptomeislikelytobelargerthanthenumberofgenesdefineddirectlyinthegenome.ThetranscriptomeincludesnoncodingRNAsaswellasmRNAs.

轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）是在特定條件下表達的一組完整基因，這是根據(jù)細胞中所存在的某一組RNA分子來決定，它可以指一種細胞類型，或者是任何一個更為復雜的細胞群體，甚至是一個完整的有機體。由于一條基因可能產(chǎn)生多條mRNA分子，所以從轉(zhuǎn)錄組定義的基因數(shù)目可能大于基因組中定義的基因數(shù)目。轉(zhuǎn)錄組包括非編碼的RNA和編碼的mRNA

。第11頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)錄組學（transcriptomics），是一門在整體水平上研究細胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學科。簡而言之，轉(zhuǎn)錄組學是從RNA水平研究基因表達的情況。

轉(zhuǎn)錄組學即一個活細胞所能轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA。研究轉(zhuǎn)錄組的一個重要方法就是利用DNA芯片技術檢測有機體基因組中基因的表達。從基因組DNA轉(zhuǎn)錄的基因總和，即轉(zhuǎn)錄組，也稱為表達譜，是研究細胞表型和功能的一個重要手段。而研究生物細胞中轉(zhuǎn)錄組的發(fā)生和變化規(guī)律的科學就稱為轉(zhuǎn)錄組學(transcriptomics)。第12頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

Theproteome

isthecompletesetofproteins.ItshouldcorrespondtothemRNAsinthetranscriptome,althoughtherecanbedifferencesofdetailreflectingchangesintherelativeabundanceorstabilitiesofmRNAsandproteins.Itcanbeusedtorefertothesetofproteinscodedbythewholegenomeorproducedinanyparticularcellortissue.

蛋白質(zhì)組（proteome）是一組完整的蛋白質(zhì)，它應該對應于轉(zhuǎn)錄組中的mRNA

。雖然在相對豐度或者穩(wěn)定性上，mRNA和蛋白質(zhì)有一些細微的差別，但它可以用來指由整個基因組編碼的一組蛋白質(zhì)，或者在某些特殊的細胞或組織中產(chǎn)生的一組蛋白質(zhì)。第13頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四proteome

蛋白質(zhì)組:蛋白質(zhì)組是指組織或細胞中所有的蛋白質(zhì)。自從1994年提出此概念以來，對它的研究已逐步走向深入。蛋白質(zhì)組系統(tǒng)地、大尺度地研究一個器官、組織或細胞中表達的是什么蛋白質(zhì)，而且要研究這些蛋白質(zhì)的動態(tài)性質(zhì)，如修飾等。與基因組學相比，它是一個動態(tài)的概念。蛋白質(zhì)組的內(nèi)容大于基因組，特別是在真核生物中，可想而知，蛋白質(zhì)的數(shù)量大于基因的數(shù)量是由于RNA在進行轉(zhuǎn)譯時有剪接(Splicing)的作用，在轉(zhuǎn)譯后修飾時蛋白質(zhì)特殊部位會有磷酸化或糖基化的作用。第14頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)組學（Proteomics）一詞，源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組學（genomics）兩個詞的組合，意指“一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識，這個概念最早是在1995年提出的。第15頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)組學的研究不僅能為生命活動規(guī)律提供物質(zhì)基礎，也能為眾多種疾病機理的闡明及攻克提供理論根據(jù)和解決途徑。通過對正常個體及病理個體間的蛋白質(zhì)組比較分析，我們可以找到某些“疾病特異性的蛋白質(zhì)分子”，它們可成為新藥物設計的分子靶點，或者也會為疾病的早期診斷提供分子標志。確實，那些世界范圍內(nèi)銷路最好的藥物本身是蛋白質(zhì)或其作用靶點為某種蛋白質(zhì)分子。因此，蛋白質(zhì)組學研究不僅是探索生命奧秘的必須工作，也能為人類健康事業(yè)帶來巨大的利益。第16頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

蛋白質(zhì)組學研究中以前最常用的方法是二維電泳（2DE，or2-DElectrophorensis），二維電泳的第一維過程中，蛋白質(zhì)依其等電點的不同被分離開來，第二維的過程是用SDS將蛋白質(zhì)依分子量的不同加以分離，電泳結束后可將膠片以銀染或CoomassieBlue的方式染色，讓蛋白質(zhì)顯現(xiàn)出來。目前基于色譜分離與質(zhì)譜的大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定技術已成為蛋白質(zhì)組學研究的中心。這種技術可以大規(guī)模地對蛋白質(zhì)進行分析，通過質(zhì)譜儀把蛋白質(zhì)或肽段的組成信息以一級圖譜與二級圖譜的形式表現(xiàn)出來，最后把這些圖譜與蛋白質(zhì)或肽段產(chǎn)生的理論圖譜相比較確定相似性（也即搜庫），并最終確定樣品中包含那些肽段，并通過肽段與蛋白質(zhì)的對應關系，最終推斷樣品中包含的蛋白質(zhì)。第17頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四雙向電泳（two-dimensionalelectrophoresis）是等電聚焦電泳和SDS的組合，即先進行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后再進行SDS（按照分子大小），經(jīng)染色得到的電泳圖是一個二維分布的蛋白質(zhì)圖。等電聚焦電泳（IFE，isoelectricfocusingelectrophoresis）聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamidegelelectrophoresis）第18頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四隨著蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，定量蛋白質(zhì)組學（比較蛋白質(zhì)組學）也獲得了廣泛研究。它不僅檢測基因表達的全部蛋白質(zhì)，而且要檢測其表達蛋白質(zhì)的含量。定量蛋白質(zhì)組學的主要研究內(nèi)容可以說是蛋白質(zhì)定量技術，而這種技術是生物標志物發(fā)現(xiàn)的重要途徑。總體來說，蛋白質(zhì)組學現(xiàn)在只是一種工具，且這種工具還存在許多未解決的問題。第19頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四3.2Genomescanbemappedbylinkage,restrictioncleavage,orDNAsequence(用連鎖、限制酶切割或者DNA測序繪制基因組圖譜

)第20頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四Agenetic(orlinkage)map

identifiesthedistancebetweenmutationsintermsofrecombinationfrequencies.Itislimitedbyitsrelianceontheoccurrenceofmutationsthataffectthephenotype.Becauserecombinationfrequenciescanbedistortedrelativetothephysicaldistancebetweensites,itdoesnotaccuratelyrepresentphysicaldistancesalongthegeneticmaterial.

遺傳圖譜（geneticmap）或連鎖圖譜（linkagemap）是根據(jù)重組頻率來確定突變位點之間的距離。這種方法需要依靠對表型有影響的突變體的產(chǎn)生，故其應用非常有限，而且由于重組頻率并不能準確反映位點之間的物理距離，所以它不能確切反映遺傳物質(zhì)的物理距離。第21頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四Arestrictionmap

isconstructedbycleavingDNAintofragmentswithrestrictionenzymesandmeasuringthedistancesbetweenthesitesofcleavage.ThisrepresentsdistancesintermsofthelengthofDNA,soitprovidesaphysicalmapofthegeneticmaterial.

限制圖譜（restrictionmap）是通過用限制性內(nèi)切核酸酶把DNA切成片段，然后測量切割位點之間的距離來構建的。這是用DNA的長度來表示距離的，因此，它提供了遺傳物質(zhì)的物理圖譜（physicalmap

）。第22頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四Bycomparingthesequenceofawild-typeDNAwiththatofamutantallele,wecandeterminethenatureofamutationanditsexactsiteofoccurrence.Thisdefinestherelationshipbetweenthegeneticmap(basedentirelyonsitesofmutation)andthephysicalmap(basedonorevencomprisingthesequenceofDNA).(通過比較野生型和突變型等位基因的DNA序列，我們能夠確定突變的本質(zhì)以及突變發(fā)生的準確位置。通過這種方式，我們可以確定遺傳圖譜（完全根據(jù)突變位置）和物理圖（根據(jù)比較DNA序列）的關系。)第23頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四Similartechniquesareusedtoidentifyandsequencegenesandtomapthegenome.Ineachcase,theprincipleistoobtainaseriesofoverlappingfragmentsofDNA,whichcanbeconnectedintoacontinuousmap.Thecrucialfeatureisthateachsegmentisrelatedtothenextsegmentonthemapbycharacterizingtheoverlapbetweenthem,sothatwecanbesurenosegmentsaremissing.

(這些相似的技術可被用來鑒定和測序基因以及繪制基因組圖譜。原則上，我們都要獲得一系列的DNA重疊片段，然后將這些重疊片段互相連接，形成連續(xù)圖譜。關鍵是通過分析它們之間的重疊部分，在圖譜上，將每一片段與另一片段聯(lián)系起來，這樣我們就能夠確保不丟失某些片段。)第24頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四3.3Individualgenomesshowextensivevariation

(個體基因組變化很大)

第25頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四TheoriginalMendelianviewofthegenomeclassifiedallelesaseitherwild-typeormutant.Subsequentlywerecognizedtheexistenceofmultiplealleles,eachwithadifferenteffectonthephenotype.Insomecasesitmaynotevenbeappropriatetodefineanyonealleleas“wild-type”.(最初的孟德爾觀點認為基因組的等位基因不是野生型就是突變型。后來我們認識到機體存在著多條等位基因，每一條等位基因都會對表型產(chǎn)生不同的影響，所以在一些例子中，定義某一種等位基因為野生型是不恰當?shù)摹?第26頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四Figure1.29Thewlocushasanextensiveseriesofalleles,whosephenotypesextendfromwild-type(red)colortocompletelackofpigment.

(w基因座上有一系列的等位基因，其表型從野生型(紅眼)到無色)。紅眼(野生表型)血紅桃紅淺黃蜜黃杏黃曙黃象牙白檸檬黃雜色白色(無色)每個等位基因具有不同的表型等位基因純合子表型(w+相對其他基因來說是顯性的，它們有很多不同的突變等位基因)第27頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

Thecoexistenceofmultipleallelesatalocusiscalledgeneticpolymorphism.Anysiteatwhichmultipleallelesexistasstablecomponentsofthepopulationisbydefinitionpolymorphic.Analleleisusuallydefinedaspolymorphicifitispresentatafrequencyof>1%inthepopulation.

(我們把在一個基因座上有多條等位基因的現(xiàn)象稱作遺傳多態(tài)性（geneticpolymorphism）。當多條等位基因在一個種群中穩(wěn)定存在時，這些等位基因所在的位置被認為是多態(tài)性的。如果某條等位基因在種群中存在的概率大于1%，那么我們就可以認為它是多態(tài)性的。)第28頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

Achangeinasinglenucleotidewhenallelesarecomparediscalledasinglenucleotidepolymorphism(SNP).Oneoccursevery~1330basesinthehumangenome.DefinedbytheirSNPs,everyhumanbeingisunique.

(當比較等位基因時，其單個核苷酸的改變被稱為單核苷酸多態(tài)性（SNP）。在人類基因組中，大約每1330個堿基就有一個單核苷酸多態(tài)性。從SNP

的角度來看，每一個人的基因組都是獨一無二的，SNP可以通過不同的方法進行檢測，從直接的序列比較到質(zhì)譜或者生物化學方法，這些方法都是根據(jù)在特定區(qū)域中序列的變化來顯示差異的。)第29頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四Figure

3.1

Apointmutationthataffectsarestrictionsiteisdetectedbyadifferenceinrestrictionfragments.圖3.1

通過檢測限制片段的大小可以發(fā)現(xiàn)影響酶切位點的點突變DNA在一個區(qū)段上有三個靶位點突變消除了其中一個靶位點酶切產(chǎn)生兩條內(nèi)部片段有一些點突變會改變限制圖譜酶切產(chǎn)生一條內(nèi)部片段片段C第30頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

Adifferenceinrestrictionmapsbetweentwoindividualsiscalledarestrictionfragmentlengthpolymorphism(RFLP).BasicallyaRFLPisaSNPthatislocatedinthetargetsiteforarestrictionenzyme.Itcanbeusedasageneticmarkerinexactlythesamewayasanyothermarker.Insteadofexaminingsomefeatureofthephenotype,wedirectlyassessthegenotype,asrevealedbytherestrictionmap.(兩個個體之間的限制圖譜的不同稱作限制性片段長度多態(tài)性(RFLP）。基本上，一個RFLP就是一個SNP，只是這個SNP位于一個酶切位點中，它能夠與任何其他遺傳標記一樣，也可同樣用來作為遺傳標記。只是它檢測的不是一些特征性表型，而是通過檢測限制圖譜來直接揭示基因型。圖3.2顯示了一個祖孫三代的限制性多態(tài)家譜，這個圖譜表明了DNA分子標記片段的孟德爾分離規(guī)律。)第31頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四Figure

3.2

RestrictionsitepolymorphismsareinheritedaccordingtoMendelianrules.Fourallelesforarestrictionmarkerarefoundinallpossiblepairwisecombinations,andsegregateindependentlyateachgeneration.圖3.2

限制位點多態(tài)性的遺傳規(guī)律符合孟德爾定律。在所有可能的配對重組中，某個限制標記的4條等位基因都能找到，并且它們在每一代中獨立地分離.

親代3個是雜合子，1個是C的純合子F2代遺傳A或D來自親代一方，B或C來自親代另一方限制性位點表現(xiàn)出孟德爾遺傳的特性第32頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

F1基因可以隨機進入它所產(chǎn)生的配子中

3.4RFLPsandSNPscanbeusedforgeneticmapping(RFLP

和SNP

能夠用來繪制遺傳圖譜

)(PAUSEDHERE，L4—2016)第33頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四3.4RFLP和SNP

能夠用來繪制遺傳圖譜Becauserestrictionmarkersarenotrestrictedtothosegenomechangesthataffectthephenotype,theyprovidethebasisforanextremelypowerfultechniqueforidentifyinggeneticlociatthemolecularlevel.Atypicalproblemconcernsamutationwithknowneffectsonthephenotype,wheretherelevantgeneticlocuscanbeplacedonageneticmap,butforwhichwehavenoknowledgeaboutthecorrespondinggeneorprotein.(由于限制標記不限于那些對表型有影響的基因組變化，因此它們成為了分子水平上測定遺傳基因座的有力工具。與已知表型的突變相關的一個典型問題是：相關的遺傳基因座應該標在遺傳圖譜上的哪一個位置，而此時我們還不清楚它們對應的基因或者蛋白質(zhì)是什么)。第34頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四補充內(nèi)容——基因的分離與鑒定等引言“克隆”（clone）的含義在當今生命科學的各個研究領域中，克隆一詞被廣泛使用。它不僅在詞義上有名詞和動詞之分，而且在不同的學科之間和不同的研究層次上亦有不同的含義。

在多細胞的高等生物個體水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物種的兩個個體或數(shù)個個體組成的群體。

在細胞水平上，克隆是指由同一個祖細胞（perogenitorcell）分裂而來的一群遺傳上同一的子細胞群體。

在分子水平上，克隆是指凡帶有一段DNA插入序列的、獨特的寄主／載體單元。第35頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

克隆是英文clone的音譯，簡單講就是一種人工誘導的無性繁殖方式。

但克隆與無性繁殖是不同的。無性繁殖是指不經(jīng)過雌雄兩性生殖細胞的結合、只由一個生物體產(chǎn)生后代的生殖方式，常見的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、莖、葉等經(jīng)過壓條或嫁接等方式產(chǎn)生新個體也叫無性繁殖。綿羊、猴子和牛等動物沒有人工操作是不能進行無性繁殖的?？茖W家把人工遺傳操作動物繁殖的過程叫克隆，這門生物技術叫克隆技術。第36頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四基因的克隆：包含待研究的目的基因的分離和鑒定兩個主要的內(nèi)容。整個基因克隆的過程則包括如下四個基本的步驟：

（i）用于基因克隆的DNA材料的選擇，及DNA分子的片段化；

（ii）外源DNA片段與載體分子的體外連接反應；

（iii）將人工重組的DNA分子導入它們能夠進行正常復制的寄主細胞的程序；

（iv）獲得了重組體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的選擇或篩選（圖1）。

用于基因克隆的DNA材料的來源，主要是從特定組織提取的染色體基因組DNA或是mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA拷貝。

第37頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

對于大分子量的染色體基因組DNA分子，必須先片段化成適于克隆的DNA片段群體。這些DNA片段群體，在體外同選擇好的載體分子重組后，被導入到大腸桿菌感受態(tài)細胞群體中，并涂布在含特定抗菌素的培養(yǎng)基平板上生長。由于載體分子的轉(zhuǎn)化子細胞才能夠生長存活，而且每一個抗性細胞均生長成一個菌落（或噬菌斑），即克隆。如此在細菌中增殖形成的克隆DNA片段之集合體，便叫做基因文庫。Vector(載體)：在分子克隆中攜帶外源DNA的質(zhì)粒、噬菌體或重組體。第38頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四圖1應用大腸桿菌作寄主進行DNA克隆的綜合實驗方案(箭頭表示有利方向)第39頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四基因的分離從基因文庫中篩選出含有目的基因的特定克隆。這就是所謂的克隆基因的分離。

對于編碼產(chǎn)物是已知的目的基因，一方面可以應用互補的核苷酸序列作探針進行直接的分離。另一方面，也可以應用特定的蛋白質(zhì)抗體及蛋白質(zhì)的功能測定，來篩選克隆基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。

對于其編碼產(chǎn)物未知的目的基因，則需要用特殊的分離手段，諸如差別顯示技術、差減雜交方法等。此處主要敘述在大腸桿菌中克隆真核基因的一般程序（圖2）并討論基因克隆的不同實驗方案以及重組體克隆的選擇與鑒定等內(nèi)容。第40頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四圖2真核基因克隆的基本步驟第41頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

1.基因組DNA的片段化

（l）利用限制酶片段化基因組DNA的一般問題

基因克隆的頭一步，需要從實驗的生物材料中制備包含“目的基因”在內(nèi)的DNA片段群體。當然，這樣的DNA片段群體必須包容著整個基因組的全部序列，而且還應該是高純度的，片段的大小上要適合于基因操作的要求。如果待克隆的給體材料是雙鏈的基因組DNA，那么有好幾種方法都可以用來制備片段化的DNA群體。但其中最簡單的一種辦法是利用限制酶消化給體基因組DNA。這種消化產(chǎn)物，不經(jīng)過凝膠電泳分部分離，就直接用來同載體分子作連接反應的克隆方法，叫做鳥槍法(shot-gunapproach)。一、DNA克隆片段的產(chǎn)生與分離第42頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

鳥槍法（shotgunapproach）最明顯的缺點是，所形成的重組體分子，實際上是一群帶有大小不同的插入片段的重組體的混合群體，篩選工作量大。

目的基因的核苷酸序列中，對所采用的限制酶可能會存在著一個甚至數(shù)個識別位點。就必須同時分離好幾個克隆，才有可能獲得目的基因的全序列。

此外，應用限制酶消化并對片段化的基因組DNA進行克隆，還會因某些限制片段的分子量太大或太小的緣故，而出現(xiàn)不能被克隆的情況。

選擇用于產(chǎn)生DNA克隆片段的限制酶，還必須考慮到它對DNA序列應該具有最佳的識別位點分布規(guī)律。第43頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四（2）基因組DNA的雙酶消化策略

1978年，T．Maniatis等人提出了利用兩種限制酶混合消化基因組DNA的實驗策略。應用這種方法可以獲得適于克隆的隨機片段化的DNA群體。他們所選用的均是具有4個核苷酸識別位點的核酸內(nèi)切限制酶，因此對基因組DNA具有較高的切割頻率。在Maniatis倡議的消化策略中，使用的是兩種識別序列完全無關的核酸內(nèi)切酶HaeⅢ和AluⅠ。第44頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四2．將DNA片段按大小分離在克隆之前，先對片段化的給體DNA群體進行按大小的部分分離，會明顯地提高克隆基因的分離頻率。

通常是使用瓊脂糖凝膠電泳或蔗糖梯度離心進行DNA片段的分部分離。采用瓊脂糖凝膠電泳分部分離技術，可以在很窄的范圍內(nèi)獲得高純度的某種DNA片段，或是大小相近的DNA片段。第45頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四3．編碼目的基因克隆片段的富集

經(jīng)限制酶消化的基因組DNA，通過凝膠電泳或蔗糖梯度離心之后，不同長度的DNA片段便會按大小順序彼此分開。根據(jù)事先已測定的編碼目的基因的克隆片段的分子量大?。畯碾娪灸z的相應譜帶上或蔗糖梯度的相應部位中，收集DNA片段，于是便達到了富集目的基因DNA片段的要求。

應用這些方法富集目的克隆片段，有一個基本的前提，那就是被克隆的目的基因的全序列，必須是位于一條DNA片段上，而不是分布在彼此交疊內(nèi)的數(shù)種片段上。因此，隨機片段化的DNA是不適用于這種方法的。第46頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四二、重組體DNA分子的構建及導入受體細胞本節(jié)對構建重組體DNA分子所涉及的主要步驟（圖3）作簡要的敘述。

1．外源DNA片段同載體分子的重組外源DNA片段同載體分子連接的方法，即DNA分子體外重組技術，主要是依賴于限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用。

大多數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶都能夠切割DNA分子，形成具有1～4個核苷酸的粘性末端。當載體和外源給體DNA用同樣的限制酶，或是用能夠產(chǎn)生相同的粘性末端的限制酶切割時所形成的DNA末端就能夠彼此退火，并被T4連接酶共價連接，形成重組體分子。第47頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四圖3構建重組DNA分子的途徑第48頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四（1）外源DNA片段定向插入載體分子

用兩種不同的限制酶同時消化一種特定的DNA分子，將會同時出現(xiàn)具有兩種不同粘性末端的DNA片段。如果載體分子和待克隆的DNA分子，都是用同一對核酸內(nèi)切限制酶切割，然后混合起來，那么載體分子和外源DNA片段將按一種取向退火形成重組DNA分子（圖4）

。

第49頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四圖4外源DNA片段定向克隆第50頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四（2）非互補粘性末端DNA分子間的連接

具有非互補粘性末端的兩種DNA片段之間，經(jīng)過專門作用于單鏈DNA的Sl核酸酶處理變成平末端之后，可以使用T4DNA連接酶進行有效連接。

可以使用附加銜接物的辦法來提高平末端間的連接作用的效率。銜接物是一種用人工方法合成的DNA短片段，具有一個或數(shù)個在其要連接的受體DNA上并不存在的限制酶識別位點。如果要連接的是具有非互補的粘性末端的載體分子和外源DNA片段，可先用Sl核酸酶除去粘性末端，形成平末端的片段，便可按平末端連接法分別給它們加上相同的一段銜接物。如此帶有銜接物的載體分子和外源DNA片段，隨后再用只在銜接物中具有的唯一識別位點的限制酶切割，結果就會產(chǎn)生出能夠彼此互補的粘性末端。這樣就可以按照常規(guī)的辦法，用T4DNA連接酶將它們連接起來（圖5）。

此外，應用附加接頭或同聚物加尾技術也能夠有效地連接DNA分子。第51頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四圖5應用化學合成的銜接物構建粘性末端進行基因克隆的程序5’

CTGCA↓G3’G↓ACGTC第52頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四（3）最佳連接反應

阻止經(jīng)限制酶切割后的線性載體分子自身的再環(huán)化作用，以提高DNA片段的插入效率。目前通用的有三種辦法：第一，用堿性磷酸酶處理由限制酶消化產(chǎn)生的線性載體分子。第二，使用同聚物加尾連接技術。第三，應用柯斯質(zhì)粒。

在連接反應中，正確地調(diào)整載體DNA和外源DNA之間的比例，是能否獲得高產(chǎn)量的重組體轉(zhuǎn)化子的一個重要因素。如果是應用λ噬菌體或柯斯質(zhì)粒作載體時，配制高比值的載體DNA／給體DNA的連接反應體系，則有利于重組體分子的形成。若是使用質(zhì)粒分子作為克隆的載體；當載體DNA與給體DNA的比值為l時，會有利于這類重組體分子的形成。

第53頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四此外，在體外連接反應中，DNA的總濃度對形成什么樣的DNA分子類型同樣也會有所影響。一般規(guī)律是，低濃度的DNA(低于20μgDNA/ml）分子間的相互作用機會少，有利于環(huán)化作用；而高濃度的DNA（高于300～400μgDNA/ml）,則有利于形成長的多連體DNA分子。

連接反應的溫度也是影響連接效果的另一個重要因素。第54頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四2.重組體分子導入受體細胞的途徑

基因的擴增，是指帶有外源DNA片段的重組體分子在體外構成之后，導入適當?shù)募闹骷毎M行繁殖，從而獲得大量的單一的重組體DNA分子的過程。

將外源重組體分子導人受體細胞的途徑，包括轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）、轉(zhuǎn)導、顯微注射和電穿孔等多種不同的方式。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導主要適用于細菌一類的原核細胞和酵母這樣的低等真核細胞，而顯微注射和電穿孔則主要應用于高等動植物的真核細胞。

第55頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四（1）重組體DNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染

在基因操作中，轉(zhuǎn)化（transformation）一詞嚴格地說是指，感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕獲和表達質(zhì)粒載體DNA分子的生命過程；而轉(zhuǎn)染（transfection）一詞，則是專指感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕獲和表達噬菌體DNA分子的生命過程。但從本質(zhì)上講，兩者并沒有什么根本的差別。無論轉(zhuǎn)化還是轉(zhuǎn)染，其關鍵的因素都是用氯化鈣處理大腸桿菌細胞，以提高膜的通透性，從而使外源DNA分子能夠容易地進入細胞內(nèi)部。

細菌轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）的具體操作程序是：將DNA分子同經(jīng)過氯化鈣處理的大腸桿菌感受態(tài)細胞混合，置冰浴中培養(yǎng)一段時間之后，轉(zhuǎn)移到42℃下作短暫的熱刺激。第56頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四（2）體外包裝的λ噬菌體的轉(zhuǎn)導

體外包裝顆粒的轉(zhuǎn)導，是一種使用體外包裝體系的特殊的轉(zhuǎn)導技術。它先將重組的λ噬菌體DNA或重組的柯斯載體DNA，包裝成具有感染能力的λ噬菌體顆粒，然后經(jīng)由在受體細胞表面上的λDNA接受器位點（receptorsites）,使這些帶有目的基因序列的重組體DNA注入大腸桿菌寄主細胞。第57頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四三、基因克隆的實驗方案從生物有機體中克隆某一特定DNA片段（或基因）的實驗程序，總稱為基因克隆的實驗方案或策略。目前已經(jīng)發(fā)展出了好幾種諸如cDNA克隆和基因組DNA克隆等不同的基因克隆實驗方案。在正式開始實驗之前，正確地選擇一種適宜的克隆方案無疑是十分重要的。如人的-珠蛋白(-globin)，其大小約為1.5kb，而人的單倍體基因組總長度是3106kb左右。那么究竟需要克隆多少個長度為1.5kb的不同限制片段，才能夠確保(99%)在重組DNA轉(zhuǎn)化子克隆群體中，至少有一個是獲得了這個基因的分子呢？第58頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四也就是說一個完整的人基因組DNA基因文庫，究竟應包含多少個獨立的克隆？這取決于基因組的大小和所克隆DNA片段的平均大小兩個參數(shù)。理論克隆數(shù)：給體生物(細菌、真菌、動物等)的基因組DNA總量除以克隆片段的平均大小得到，實際克隆按Clarke-carbon公式計算。第59頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四克隆片段的平均大小(bp)基因組的大小(bp)2106(細菌)2107(真菌)3109(動物)理論克隆數(shù)實際克隆數(shù)理論克隆數(shù)實際克隆數(shù)理論克隆數(shù)實際克隆數(shù)5103101032010340103400200100501,8319194582784,0002,0001,00050018,4189,2084,6032,300600,000300,000150,00075,0002,763,1101,381,550690,774345,386不同生物的完全基因組基因文庫應具有的理論克隆數(shù)和實際克隆數(shù)理論克隆數(shù)=給體生物的基因組DNA總量/克隆片段的平均大?。粚嶋H克隆按Clarke-carbon公式計算。第60頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四1.互補作用基因克隆如果被克隆的DNA片段，同重組體DNA分子的寄主細胞的染色體DNA是同源的，那么使用互補作用進行基因克隆，將是一種十分有效的方法。它的一種最簡單的方式是，將大腸桿菌DNA的克隆片段“庫”，即一組含有大腸桿菌基因組全部DNA序列結構的重組體DNA分子的異源群體，導入一種大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株（auxotrophicstrain）的受體細胞。然后將此受體細胞涂布在一種缺少該菌株所需要的底物的基本培養(yǎng)基上。因此，只有那些獲得了營養(yǎng)缺陷型互補基因的受體細胞才會長成轉(zhuǎn)化子菌落。第61頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四2．cDNA基因克隆

cDNA克隆的基本過程是通過一系列的酶催作用，使總poly（A）mRNA制劑轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體，并插入到適當?shù)妮d體分子上，然后再轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主菌株的細胞內(nèi)。如此便構成了包含著所有基因編碼序列的cDNA基因文庫（圖6）

。第62頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四圖6具有poly(A)的mRNA在oligo(dT)引物和反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，可合成出雙鏈cDNA。隨后將它與質(zhì)粒載體構成重組分子，并轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細胞進行擴增。應用這種方法能夠分離和擴增我們所期望研究的基因或DNA片段末端轉(zhuǎn)移酶（Terminaltransferase,TdT）是一種無需模板的DNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結合到DNA分子的3'羥基端。

TdTS1核酸酶第63頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四（l）cDNA文庫的構建

（i）構建cDNA文庫的第一步是分離細胞總RNA，然后從中純化出主要含mRNA的分部。一段僅由脫氧胸腺嘧啶核苷酸組成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]，能夠同惰性物質(zhì)如纖維素（或瓊脂糖）結合。當細胞總RNA制劑通過已用oligo（dT）處理過的纖維素柱時，mRNA分子的pol（A）尾巴便會同oligo（dT）序列雜交而粘附到柱子的填充物纖維素上，而其余的rRNA及tRNA分子則流出柱子。經(jīng)過處理，可從纖維素柱子中洗脫下了純凈的mRNA分子（圖7）

。

（ii）構建cDNA文庫第二步是合成第一鏈cDNA。其中一種方法叫做oligo（dT）引導的cDNA合成法。

另外一種叫做隨機引物引導的cDNA合成法（randomlyprimedcDNAsynthesis）。此法的基本原理是，根據(jù)許多可能的序列，合成出6～10個核苷酸長的寡核昔酸短片段（混合物），作為合成第一鏈cDNA的引物。在這種情況下，cDNA的合成可以從mRNA模板的許多位點同時發(fā)生。第64頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四poly(A)mRNA與oligo(dT)雜交而被吸附，其它的RNA及rRNA仍處游離狀態(tài)加入總RNA(mRNA,tRNA和rRNA)收集洗脫下來的poly(A)mRNA圖7用纖維素柱純化poly(A)mRNA的流程示意圖oligo(dT)纖維素100mMNaCI洗脫下來的tRNA和rRNA100mMTris1mMEDTA第65頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四（iii）構建cDNA文庫第三步是將mRNA-DNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA分子?？刹捎米晕乙龑Ш铣煞ɑ蛑脫Q合成。

（iv）構建cDNA文庫的第四步是將合成的雙鏈cDNA重組到質(zhì)粒載體或噬菌體載體上，導入大腸桿菌寄主細胞增殖。

重組的方式是先用末端轉(zhuǎn)移酶給雙鏈cDNA分子加尾，或者更常用的是將人工合成的銜接物加到雙鏈cDNA分子的兩端，爾后再同經(jīng)適當處理而具有相應末端的載體分子連接。將如此構成的重組體分子導入大腸桿菌寄主細胞進行擴增，于是便得到了所需的cDNA文庫。圖8表示出了λ噬菌體載體λgt為雙鏈DNA克隆的基本流程。第66頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四圖8以λ噬菌體作載體構建成cDNA文庫的流程圖第67頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

λ噬菌體與細菌質(zhì)粒相比較，它可以攜帶較長的外源DNA片段，其最大容量為18－22kb，這是因為在λ噬菌體基因組中含有一個從基因J之后到N之前的非必需區(qū)，也稱為可替代區(qū)，它約占整個λ基因組的1／3。如果用外源基因片段替代這個區(qū)域，不會影響噬菌體顆粒的形成，正是這一特性構成了λ噬菌體作為外源基因克隆載體的基礎。

λ噬菌體的感染能力與包裝在衣殼內(nèi)的DNA長度有關，通常野生型λDNA長度為48.5kb，具有很強的感染力，而當DNA長度為野生型λDNA長度的75％或105％時，λ噬菌體雖然能夠包裝成具有感染性的顆粒，但感染效率明顯降低。若DNA長度短于野生型λDNA長度的75％或超出105％，則不能形成具有感染性的噬菌體顆粒，因此在利用λ載體構建基因克隆重組體時，應當注意選擇合適大小的外源DNA片段。第68頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

λgt11和λgt10均可用于cDNA文庫的構建，但當以核酸探針篩選重組體時，一般選用λgt10。λgt10在基因CⅠ內(nèi)有一個EcoRⅠ酶切位點，外源基因片段從EcoRⅠ位點的插入可使基因CⅠ失活，重組體呈現(xiàn)為CⅠ表型產(chǎn)生清亮型噬斑，其重組體的繁殖需選用高頻率溶原性突變株。即大腸桿菌的hfl突變株，λgt10在此宿主菌中不能形成噬斑，而重組體能以正常的效率感染宿主菌，并且有效地產(chǎn)生噬斑，利用這一特性可對重組體進行篩選。λ噬菌體第69頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

λgt11是一種表達型的載體，這種λ載體不僅可以擴增外源DNA片段，而且還可在大腸桿菌中表達外源DNA片段。該載體帶有大腸桿菌的LacZ基因片段，在半乳糖苷酶基因終止密碼子上游的53bp處存在單一的EcoRⅠ酶切位點，它可供外源基因片段的插人。在特定的宿主菌中，當插人的外源基因具有正確的密碼閱讀框架時，外源基因能隨半乳糖苷酶基因的表達而表達，并產(chǎn)生由β半乳糖苷酶的氨基端部分與下游外源基因編碼的肽鏈構成融合蛋白。利用融合蛋白的抗體可對重組體進行篩選。為了使融合蛋白在宿主菌中不致于降解，一般選擇蛋白水解酶缺失的突變株(lon-)作為宿主菌，常用的宿主菌為Y1089和Y1090。λgt11的特點在于能使外源基因具有較高的表達水平，因此凡是以抗體作為重組體篩選時，應該選用λgt11。λ噬菌體第70頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

溫和噬菌體λ的同源重組簡介

λ噬菌體的基因組可以進行兩種形式的重組：同源重組:λDNA—λDNA之間的重組；非同源重組:λDNA—E.coli的染色體DNA之間的重組。

1)重組基因

λ基因組上有三個重組基因：red、int和xis，它們的位置都在附著位點att的旁邊。int和xis是整合和切離過程中起主要作用的基因，red是同源重組中起主要作用的基因。λ噬菌體第71頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四2)λ的復制和重組系統(tǒng)游離λ的DNA是線狀的，感染寄主細胞以后粘性末端(cohesiveend,cos)連接成為環(huán)狀分子。在λ基因O和P的作用下大約產(chǎn)生20個環(huán)狀分子以后復制方式便轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)環(huán)式或σ式。通過這一方式形成多聯(lián)體。基因A產(chǎn)物Ter蛋白作用于cos位點而把多聯(lián)體中屬于一個基因組的DNA切下，并為頭部蛋白包裝起來成為成熟的噬菌體。第72頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四（2）cDNA克隆的優(yōu)越性

第一，cDNA克隆以mRNA為材料，這對于有些RNA病毒，它們的增殖并不經(jīng)過DNA中間體，特別適用。

第二，cDNA基因文庫的篩選比較簡單易行。

第三，由于每一個cDNA克隆都含有一種mRNA序列，這樣在選擇中出現(xiàn)假陽性的幾率就會比較低。

第四，cDNA克隆除了具備前述優(yōu)點之外，還具有其自身的特殊用途。這包括兩個方面，即克隆在細菌中表達的基因(獲得一種特殊的真核蛋白質(zhì)產(chǎn)物)和用作基因序列結構的測定(有效地分析間斷基因的結構)。

第73頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

3．基因組DNA克隆基因組DNA克隆與cDNA克隆不同，它的出發(fā)材料是基因組DNA。

由于cDNA分子比較小，可以在質(zhì)粒載體上克隆。高等真核生物染色體基因組DNA的基因文庫，通常是用λ噬菌體或柯斯質(zhì)粒作載體構建的。

（1）應用λ噬菌體載體構建基因組文庫

構建基因組文庫的第一步是，從給體生物制備基因組DNA，并用限制酶消化法產(chǎn)生出適于克隆的DNA片段。然后，在體外將這些DNA片段同適當?shù)摩耸删w連接成重組體分子，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的受體細胞中去。最后，從轉(zhuǎn)化子克隆群體中挑選出含有目的基因的克隆。

下面舉例說明基因文庫的建立。第74頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四1)采用HaeⅢ-AluⅠ雙酶消化法，選用兩種識別序列毫不相關的核酸內(nèi)切限制酶

HaeⅢ（5′…GG↓CC…3′）和AluI5′…AG↓CT…3′）對真核基因組DNA作局部混合酶切消化，收集到大小為20kb左右的隨機的DNA片段群體。由于這兩種酶切的結果形成的都是平末端的DNA片段分子，所以需要加用適宜的銜