微生物制藥的學(xué)習(xí)教案

微生物制藥的學(xué)習(xí)教案第1頁/共116頁24.1微生物發(fā)酵的類型

4.2原料的選擇和處理4.3滅菌和空氣凈化工程4.5菌種的培養(yǎng)4.6發(fā)酵過程的分析檢驗(yàn)4.微生物發(fā)酵工程概述4.7發(fā)酵培養(yǎng)方法

第2頁/共116頁3發(fā)酵工程是利用微生物細(xì)胞的代謝過程生產(chǎn)有用的各種產(chǎn)物的過程，它由三個(gè)核心部分組成：一、生產(chǎn)特定產(chǎn)物的微生物菌種的選育；二、利用適當(dāng)?shù)脑O(shè)備和技術(shù)為菌種提供最佳條件，充分發(fā)揮菌種的生產(chǎn)能力；三、將發(fā)酵產(chǎn)生的產(chǎn)物經(jīng)分離、純化，以提高收率獲得質(zhì)量合格的產(chǎn)品。微生物發(fā)酵工業(yè)以發(fā)酵為主，發(fā)酵水平的好壞是整個(gè)生產(chǎn)的關(guān)鍵，但后處理在發(fā)酵生產(chǎn)中也占有重要的地位。完整的微生物發(fā)酵工程應(yīng)該包括從原料到獲得終產(chǎn)品的過程，即菌種是基礎(chǔ)，發(fā)酵是關(guān)鍵，分離純化是保障。第3頁/共116頁44.1微生物發(fā)酵的類型

按照微生物對(duì)氧氣的要求、發(fā)酵采用的方式、發(fā)酵產(chǎn)物的特性，將發(fā)酵分為不同的類型：4.1.1按照微生物對(duì)氧氣的要求分類1、好氧發(fā)酵：指發(fā)酵產(chǎn)物形成時(shí)需要充足的氧氣。如檸檬酸發(fā)酵、草酸發(fā)酵、谷氨酸發(fā)酵以及各種抗生素發(fā)酵等。2、厭氧發(fā)酵：指發(fā)酵時(shí)不需要提供氧氣，如丙酮-丁醇發(fā)酵、乳酸發(fā)酵、丙酸發(fā)酵、丁酸發(fā)酵等。3、兼性厭氧發(fā)酵：產(chǎn)生酒精的酵母菌是一種兼性厭氧微生物，在缺氧條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵，積累酒精，在大量通氣條件下則進(jìn)行好氧發(fā)酵，產(chǎn)生大量酵母細(xì)胞。第4頁/共116頁54.1.2按微生物發(fā)酵采用的培養(yǎng)基狀態(tài)分類1、固體發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵是指沒有或幾乎沒有自由水存在下，在有一定濕度下的固態(tài)基質(zhì)中，用一種或多種微生物的一個(gè)生物反應(yīng)過程。第5頁/共116頁6固體發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、發(fā)酵過程容易控制、對(duì)無菌要求相對(duì)較低、不易發(fā)生大面積的污染；基質(zhì)含水量低，生物反應(yīng)器的體積??；發(fā)酵的副產(chǎn)物可以綜合利用，不需廢水處理；供氧由氣體擴(kuò)散或間接通風(fēng)完成，能耗低；能在一定程度上解除產(chǎn)物抑制，可獲得較高的次級(jí)代謝產(chǎn)物。第6頁/共116頁7缺點(diǎn)：廠房面積大；生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)不夠完善；難以準(zhǔn)確測(cè)定含水量、菌體量和二氧化碳生成量等發(fā)酵參數(shù)；微生物生長(zhǎng)速度緩慢，容易污染；只適合用于耐低活性水的菌等的發(fā)酵。第7頁/共116頁82.液體發(fā)酵

液體發(fā)酵的方式：1、將培養(yǎng)基放在瓷盤內(nèi)，進(jìn)行靜止培養(yǎng)，稱淺盤發(fā)酵（表面發(fā)酵）。該法存在不少的缺點(diǎn)，如勞動(dòng)強(qiáng)度大，占地面積大，產(chǎn)量小，易染雜菌等，因此迅速被液體深層發(fā)酵所取代。2、將培養(yǎng)液放入不銹鋼制成的發(fā)酵罐，在罐內(nèi)進(jìn)行深層發(fā)酵。第8頁/共116頁9液體深層發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)：1、液體為懸浮狀態(tài)為許多微生物提供最適合生長(zhǎng)環(huán)境，菌體生長(zhǎng)快，發(fā)酵產(chǎn)率高，發(fā)酵周期短；2、在液體中，菌體、底物、產(chǎn)物以及發(fā)酵產(chǎn)生的熱量易于擴(kuò)散，使發(fā)酵可在均質(zhì)條件下進(jìn)行，易于控制，便于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模；3、廠房面積小，生產(chǎn)效率高，易進(jìn)行自動(dòng)控制，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；4、產(chǎn)品易于提取和精制。但液體深層發(fā)酵消耗能源多，設(shè)備復(fù)雜，需要較大的投資，有廢物排除等缺點(diǎn)。第9頁/共116頁104.1.3發(fā)酵的一般工藝過程微生物發(fā)酵產(chǎn)物雖然多種多樣，發(fā)酵類型不一，但總體上的工藝流程是相似的，包括以下過程：1、原料的處理和滅菌；2、空氣的凈化除菌；3、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)；4、發(fā)酵的條件控制；5、產(chǎn)品的提取精制等階段。第10頁/共116頁114.2原料的選擇及處理培養(yǎng)基是微生物生長(zhǎng)繁殖需要的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。培養(yǎng)基成分包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、微量元素和水等。4.2.1選擇合適的原料標(biāo)準(zhǔn)：1、原料中碳的可利用率高；2、發(fā)酵率高，而且盡可能使發(fā)酵殘余物少；3、原料質(zhì)量好，成分穩(wěn)定，污染變質(zhì)少，易滅菌；4、廉價(jià)，來源方便，易于保藏。第11頁/共116頁124.2.2淀粉水解糖的制備

淀粉是由葡萄糖組成的生物大分子，除少數(shù)霉菌可以直接利用淀粉外，目前大多數(shù)微生物都不能直接利用淀粉，如氨基酸產(chǎn)生菌、酒精酵母、抗生素產(chǎn)生菌等。因此在氨基酸、抗生素有機(jī)酸等的生產(chǎn)中，都要求先對(duì)淀粉或淀粉原料進(jìn)行糖化，制成淀粉水解糖后使用。將淀粉水解為葡萄糖的過程稱為糖化，制得的糖溶液叫淀粉水解糖。淀粉藍(lán)糊精紅糊精無色糊精麥芽糖葡萄糖（C6H10O5)n+nH2OnC6H12O6酸或酶第12頁/共116頁13一、淀粉水解糖的制備方法

葡萄糖值---DE值

工業(yè)上用DE值（也稱G值）表示淀粉糖的糖組成。糖化液中的還原糖含量（以G計(jì)算）占干物質(zhì)的百分率稱為。

還原糖含量DE值=100%

干物質(zhì)含量

用于制備淀粉的原料主要有薯類、玉米、小麥、大米等富含淀粉的農(nóng)產(chǎn)品。根據(jù)原料淀粉的性質(zhì)及采用的催化劑不同，淀粉水解為葡萄糖的方法有酸解法、酶解法以及酸酶結(jié)合法等三種。

第13頁/共116頁14又稱酸糖化法，它是以酸為催化劑在高溫下將淀粉水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖的方法。優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)方便，設(shè)備簡(jiǎn)單，水解時(shí)間短，設(shè)備生產(chǎn)能力大；缺點(diǎn)：a反應(yīng)在高溫高壓及酸條件下進(jìn)行，對(duì)設(shè)備有耐腐蝕、耐高溫和耐高壓的要求；

b發(fā)生副反應(yīng)，葡萄糖損失，淀粉的轉(zhuǎn)化率低；

c對(duì)原料要求嚴(yán)格。1、酸解法

第14頁/共116頁15

酶解法是利用專一性很強(qiáng)的淀粉酶及糖化酶將淀粉水解為葡萄糖的方法。酶解法可分為兩步：第一步，利用α-淀粉酶將淀粉液化；第二步，利用糖化酶將糊精或低聚糖進(jìn)一步水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖。生產(chǎn)上這兩步分別稱為液化和糖化。由于在該過程中淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下進(jìn)行的。因此酶解法又稱為雙酶法或多酶法。2、酶解法

第15頁/共116頁161.酶解法是在酶的作用下進(jìn)行的，反應(yīng)條件較溫和，不需要耐高溫高壓或耐酸腐蝕的設(shè)備；2.酶作為催化劑的特點(diǎn)是專一性強(qiáng)，副反應(yīng)少，故水解糖液純度高，淀粉轉(zhuǎn)化率高；3.可在較高的淀粉乳濃度下水解。如酸解法一般使用含18%--20%淀粉的淀粉乳，而酶解法可用含34%--40%淀粉的淀粉乳，并且可以采用粗原料。4.用酶解法制得的糖液較純凈、顏色淺、無苦味、質(zhì)量高，有利于糖液的充分利用。優(yōu)點(diǎn)第16頁/共116頁17缺點(diǎn)

酶解法反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，設(shè)備要求較多，且酶是蛋白質(zhì)，易引起糖液過濾困難。當(dāng)然，隨著酶制劑生產(chǎn)及應(yīng)用技術(shù)的提高，酶解法制糖將逐漸取代酸解法制糖。

第17頁/共116頁183酸酶結(jié)合法

酸酶結(jié)合法是集中了酸解法和酶解法制糖的優(yōu)點(diǎn)而采用的生產(chǎn)方法，它又可分為：A、酸酶法：是先將淀粉用酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶將其水解成葡萄糖的工藝。一般采用將淀粉先用酸水解到DE值達(dá)10-15，在降溫中和后，用糖化酶進(jìn)行糖化。

優(yōu)點(diǎn)：酸液化速度快，糖化時(shí)可以采用較高的淀粉乳濃度，提高生產(chǎn)效率；酸用量少，產(chǎn)品的色澤淺，糖液質(zhì)量高。第18頁/共116頁19B、酶酸法：是先將淀粉乳用α-淀粉酶液化到一定程度，再用酸水解成葡萄糖的工藝。有些淀粉原料顆粒大小不一，如用酸法水解，則常使水解不均勻，出糖率低。生產(chǎn)中應(yīng)用酶酸法，可采用粗淀粉為原料，粉料濃度較酸解法高，生產(chǎn)易控制，耗時(shí)短，且酸解時(shí)PH值稍高，以減輕淀粉水解的副反應(yīng)。從水解糖的質(zhì)量和降低糖耗，提高原料的出糖率來看，酶解法最好，酸解法最差。從制糖過程所需的時(shí)間看，酸解法最短，酶解法最長(zhǎng)。第19頁/共116頁204.2.2.2淀粉酸水解原理及技術(shù)1、淀粉酸水解原理

淀粉藍(lán)糊精紅糊精無色糊精麥芽糖葡萄糖水解過程：水解過程中存在三大化學(xué)反應(yīng)：

復(fù)合二糖復(fù)合低聚糖水解淀粉葡萄糖

5-羥甲基糖醛有機(jī)酸、有色物質(zhì)132第20頁/共116頁21（1）水解反應(yīng)速度（C6H10O5)n+nH2OnC6H12O6酸影響水解反應(yīng)速度常數(shù)k的幾個(gè)因素

k=α·N·δ·λ

1）α為催化劑活性系數(shù)催化劑HClH2SO4H3PO4HACHBrHIα值10.5-0.520.30.0251.72.5各種酸的α值2）N為酸的摩爾濃度3）δ為多糖的水解性常數(shù)多糖的種類棉花淀粉木材稻草半纖維素蔗糖δ值14002.0-2.510-400100第21頁/共116頁224）λ為水解溫度不同溫度下淀粉水解反應(yīng)速度常數(shù)

溫度℃119133138143k值0.1250.4700.7701.200結(jié)論：淀粉水解所用的催化劑種類、濃度、反應(yīng)溫度均對(duì)水解反應(yīng)速度有很大的影響，是我們?cè)谒膺^程中必須注意的主要因素。（2）葡萄糖的復(fù)合反應(yīng)2C6H12O6C12H22O11+H2O酸和熱

復(fù)合反應(yīng)中兩個(gè)葡萄糖分子通過復(fù)合反應(yīng)聚合成二糖時(shí)，并不是經(jīng)過1，4-糖苷鍵聚合成為麥芽糖，而主要是經(jīng)由1，6-糖苷鍵聚合成異麥芽糖或經(jīng)由1，6-糖苷鍵聚合成龍膽二糖。當(dāng)然此復(fù)合反應(yīng)是可逆的，復(fù)合糖可以再水解變成葡萄糖。第22頁/共116頁23（3）葡萄糖的分解反應(yīng)葡萄糖（失水）5`-羥甲基糠醛+甲酸

腐植質(zhì)（色素）實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：

1）5`-羥甲基糠醛是產(chǎn)生色素的根源；

2）色素的生成量隨葡萄糖濃度的增加而增加；

3）PH值等于3時(shí)，色素的生成量最小。酸法水解淀粉過程中，由于反應(yīng)溫度、壓力過高，時(shí)間過長(zhǎng)，葡萄糖受酸和熱的影響發(fā)生分解反應(yīng)，生成5’-羥甲基糠醛，因5’-羥甲基糠醛的性質(zhì)不穩(wěn)定，又可進(jìn)一步分解生成乙酰丙酸、蟻酸等物質(zhì)，而這些物質(zhì)又能自身相互聚合，或與淀粉中所含的其他有機(jī)物質(zhì)相結(jié)合，產(chǎn)生色素。第23頁/共116頁241）酸法糖化工藝流程淀粉鹽酸蒸汽水調(diào)漿糖化冷卻中和脫色壓濾濾渣糖液活性炭Na2CO32、酸水解工藝

淀粉的酸水解工藝是根據(jù)淀粉在水解過程中的水解反應(yīng)和復(fù)合反應(yīng)規(guī)律性來決定的。在制定工藝條件時(shí)既要保證淀粉的徹底水解，達(dá)到較高葡萄糖量，又要盡可能減少葡萄糖復(fù)合、分解反應(yīng)的發(fā)生程度，此外，還要符合目的產(chǎn)物的發(fā)酵條件，符合發(fā)酵工藝的實(shí)際情況。

第24頁/共116頁252）水解條件選擇及其控制1、淀粉乳濃度的選擇

2、HCl用量淀粉乳濃度（BX）2624222019181716DE值89.1789.2789.9291.191.392.7792.8193.01濃度控制在18-19BX。用量為淀粉量的0.6%-0.7%，淀粉乳的PH為1.5左右。第25頁/共116頁263、水解時(shí)間

4、水解設(shè)備

一般15min，水解終點(diǎn)的檢查，用無水酒精檢查無白色為止。不銹鋼或搪瓷襯底設(shè)備。5、糖化液6、脫色冷卻降溫，并加純堿中和調(diào)節(jié)PH為4.6-5.0，溫度控制在60-70℃。活性炭脫色，添加量為淀粉量的0.6-0.8％，在PH4.6-5.0，溫度65℃，攪拌脫色30min，經(jīng)過濾掉蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，即獲得較純的水解糖。第26頁/共116頁274.2.2.3雙酶法制糖原理酶解法也稱雙酶法，它是由淀粉酶和糖化酶將淀粉糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的方法。酶解法優(yōu)點(diǎn)：以作用專一性的酶制劑作為催化劑，因此反應(yīng)條件溫和，復(fù)合和分解反應(yīng)較少，因此采用酶法生產(chǎn)不僅可提高淀粉的轉(zhuǎn)化率及糖液的濃度，而且還可大幅度地改善了糖液的質(zhì)量，是目前最為理想、應(yīng)用最廣的制糖方法。

缺點(diǎn)：時(shí)間長(zhǎng)；過濾難。第27頁/共116頁281、淀粉酶解法的兩個(gè)步驟

酶水解位置水解次序水解產(chǎn)物液化淀粉酶1，4糖苷鍵無先后次序葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖異麥芽糖、低聚糖糖化糖化酶1，4和1，6從非還原性葡萄糖糖苷鍵末端開始一、液化過程，采用高溫α-淀粉酶，將高溫糊化了的淀粉液化，生成糊精及低聚糖，使淀粉和其結(jié)合蛋白分離；二、糖化過程，利用糖化酶將液化生成的糊精、低聚糖進(jìn)一步水解生成葡萄糖。第28頁/共116頁29淀粉糊化是指淀粉受熱后，淀粉顆粒膨脹，晶體結(jié)構(gòu)消失，互相接觸變成糊狀液體，即使停止攪拌，淀粉也不會(huì)再沉淀的現(xiàn)象。

由于淀粉顆粒的結(jié)晶性結(jié)構(gòu)對(duì)酶作用的抵抗力非常強(qiáng),不能使淀粉酶直接作用于淀粉,而需要先加熱淀粉乳,使淀粉顆粒吸水膨脹、糊化，破壞其結(jié)晶性的結(jié)構(gòu)。1、液化原理1）淀粉的糊化與老化

第29頁/共116頁30糊化溫度：發(fā)生糊化現(xiàn)象時(shí)的溫度稱為糊化溫度，一般來講，糊化溫度有一個(gè)范圍。不同的淀粉有不同的糊化溫度。

淀粉的老化：分子間氫鍵已斷裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氫鍵的過程，也就是復(fù)結(jié)晶過程。老化的弊端：淀粉酶很難進(jìn)入老化淀粉的結(jié)晶區(qū)起作用，使淀粉很難液化，更不能糖化。糊化淀粉是在淀粉酶的作用下液化的，α-淀粉酶可以水解淀粉分子鏈的α-1，4糖苷鍵，不能水解α-1，6糖苷鍵，但能越過α-1，6糖苷鍵繼續(xù)水解α-1，4糖苷鍵，水解沒有規(guī)律性的先后次序。第30頁/共116頁312、糖化的原理糖化酶又稱糖化型淀粉酶或葡糖淀粉酶，它對(duì)底物作用是從非還原性末端開始切割，一個(gè)分子切割下葡萄糖單位。它不但可以水解α-1，4糖苷鍵，而且也水解α-1，6糖苷鍵和α-1，3糖苷鍵。它可以直接將淀粉水解成葡萄糖，也能水解糊精、低聚糖，最終產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為葡萄糖。酶的用量原則：酶活力低，液化液濃度高，用量則多，反之則少。生產(chǎn)用量：30%淀粉，80-100單位/克淀粉。第31頁/共116頁324.2.3糖蜜預(yù)處理1、糖蜜稀釋：糖蜜在處理前要加水稀釋，加水量為1：1，否則黏度太高不利于后續(xù)操作；2、糖蜜澄清：由于其中含有大量灰分和膠體，不但影響菌體的生長(zhǎng)，也影響產(chǎn)品的純度，膠體使發(fā)酵中產(chǎn)生大量泡末，影響發(fā)酵；3、脫鈣調(diào)PH值：對(duì)酸性原料，PH應(yīng)該調(diào)得比堿性原料要高些，因?yàn)樗哂醒訒r(shí)緩沖性，用它配制的培養(yǎng)基在滅菌后會(huì)酸化；而堿性原料的性質(zhì)正好相反。調(diào)PH一般用硫酸或碳酸鈉，調(diào)PH6.0-7.2。4、調(diào)節(jié)金屬離子的濃度：最常用的方法是采用添加黃血鹽（亞鐵氰化鉀）或EDTA等絡(luò)合劑、離子交換樹脂和活性碳吸附。第32頁/共116頁334.3滅菌與空氣凈化工程

4.3.1培養(yǎng)基濕熱滅菌方法及設(shè)備滅菌原理：當(dāng)溫度超過最高限度時(shí)，微生物細(xì)胞中的原生質(zhì)和酶的基本成分----蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變化，使微生物在很短時(shí)間內(nèi)死亡。以能否殺死細(xì)菌的芽孢為標(biāo)準(zhǔn)。。殺死微生物的極端溫度稱為致死溫度。在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時(shí)間稱為致死時(shí)間。第33頁/共116頁344.3.1.1連續(xù)滅菌及設(shè)備

連續(xù)滅菌也叫連消，將配制好的培養(yǎng)基在高溫快速的情況下，向發(fā)酵罐輸送的同時(shí)經(jīng)過加溫，保溫，冷卻的過程進(jìn)行滅菌。其滅菌的溫度一般以126-132℃為宜。連續(xù)滅菌時(shí)培養(yǎng)基可瞬時(shí)被加熱到144℃，并保持此溫度至滅菌要求，也能很快地被冷卻，因此是高溫瞬時(shí)滅菌法，有利于減少培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的破壞。第34頁/共116頁35第35頁/共116頁36連續(xù)滅菌的基本設(shè)備一般包括：1、配料預(yù)熱罐：將配制好的料液預(yù)熱到60-70℃，以免連續(xù)滅菌料液與蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水氣碰擊聲。2、連消器：主要作用是使高溫蒸汽與料液迅速接觸混合，并使料液的溫度很快提高到滅菌溫度。3、維持罐：連消器加熱的時(shí)間很短，僅靠這段時(shí)間滅菌不夠，維持罐的作用是使料液在滅菌溫度下保持5-7min，以達(dá)到滅菌的目的。4、冷卻器：從維持罐出來的料液要經(jīng)過冷卻器進(jìn)行冷卻（40-50℃）。第36頁/共116頁37第37頁/共116頁38連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)及注意事項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)：1）培養(yǎng)基受熱時(shí)間短，可縮短發(fā)酵周期；同時(shí)培養(yǎng)基成分破壞也較少。2）蒸汽負(fù)荷均衡，鍋爐利用率高，操作方便。3）適于自動(dòng)控制，降低勞動(dòng)強(qiáng)度。缺點(diǎn)：設(shè)備復(fù)雜，投資大。注意事項(xiàng)：1）連消前，應(yīng)先進(jìn)行空罐、維持罐、冷卻系統(tǒng)的滅菌。2）確保管路無滲漏。第38頁/共116頁394.3.1.2間歇滅菌及設(shè)備

間歇滅菌法：將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他容器中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所有設(shè)備儀器一起加熱，達(dá)到預(yù)定滅菌溫度后維持一段時(shí)間，再冷卻到發(fā)酵溫度的濕熱滅菌的過程，也稱實(shí)罐滅菌。間歇滅菌的過程一般包括升溫、保溫和冷卻三個(gè)階段。間歇滅菌時(shí)，加熱和冷卻所需的時(shí)間長(zhǎng)，且發(fā)酵罐容積越大，時(shí)間越長(zhǎng)，就增加了發(fā)酵前的準(zhǔn)備時(shí)間，也相應(yīng)地延長(zhǎng)了發(fā)酵周期，使發(fā)酵罐的利用率下降。第39頁/共116頁401、在進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌之前，通常應(yīng)先把發(fā)酵罐的分空氣過濾器滅菌并用無菌空氣吹干。2、預(yù)熱：向夾套或蛇管中通入蒸汽，間接將培養(yǎng)基加熱至70℃左右。作用：減少冷凝水的生成；減輕噪音。3、開啟蒸汽管，向培養(yǎng)基中通入蒸汽，升溫。4、罐壓達(dá)0.1MPa時(shí)，按裝在發(fā)酵罐封頭的接種管、補(bǔ)料管、消泡劑管等應(yīng)排汽。第40頁/共116頁415、保溫：調(diào)節(jié)好各進(jìn)汽和排汽閥門，使罐壓和溫度保持在一穩(wěn)定水平，維持一定時(shí)間。在保溫階段，凡進(jìn)口在培養(yǎng)基液面下的各管道都應(yīng)通入蒸汽；在液面上的其余管道則應(yīng)排放蒸汽，這樣才能保證滅菌徹底，不留死角。6、保溫結(jié)束后，依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥；待罐內(nèi)壓力降至0.5kg/cm2左右時(shí)，向罐內(nèi)通入無菌空氣，向夾套或蛇管中通入冷水，使培養(yǎng)基降至所需溫度。通入無菌空氣的作用：加速降溫；保持罐內(nèi)正壓。第41頁/共116頁42間歇滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1）不需專門的滅菌設(shè)備，投資少、設(shè)備簡(jiǎn)單、滅菌效果可靠。2）對(duì)蒸汽的要求較低，一般3-4kg/cm2即可滿足。缺點(diǎn)：在滅菌過程中蒸汽用量變化大，造成鍋爐負(fù)荷波動(dòng)大，中小型罐經(jīng)常采用。第42頁/共116頁434.3.2空氣凈化及設(shè)備4.3.2.1空氣凈化的要求發(fā)酵用的無菌空氣,就是將自然界的空氣經(jīng)過壓縮,冷卻,減濕,過濾等過程達(dá)到:1連續(xù)提供一定流量的壓縮空氣。2空氣的壓強(qiáng)為0.2-0.4Mpa3進(jìn)入過濾器之前，空氣的相對(duì)濕度≤70%4進(jìn)入發(fā)酵罐的空氣溫度可比培養(yǎng)溫度高10-30℃5壓縮空氣的潔凈度一般以失敗概率為10-3為指標(biāo)。第43頁/共116頁44空氣凈化的方法：（1）熱滅菌法：加熱后微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)熱變性而死亡。空氣在進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)之前，一般需要經(jīng)過壓縮機(jī)壓縮，提高壓力，所以，空氣熱滅菌時(shí)所需要的溫度，就不必用蒸汽或其它載熱體加熱，而可直接利用空氣壓縮時(shí)的溫度提高來實(shí)現(xiàn)的，空氣經(jīng)過壓縮后溫度能夠升到200℃以上，保持一定時(shí)間后，便可以實(shí)現(xiàn)干熱滅菌。第44頁/共116頁45（2）靜電除菌法：使用靜電除塵器除去空氣中的水霧塵埃等，同時(shí)也除去空氣的微生物。靜電除菌是采用靜電引力來吸附帶電粒子而達(dá)到除塵滅菌的目的。懸浮于空氣中的微生物及孢子大多帶有不同的電荷，不帶電荷的微粒進(jìn)入高壓靜電場(chǎng)時(shí)也會(huì)被電離成帶電微粒，但對(duì)于一些直徑較小的微粒，所帶電荷少，微粒就不容易被吸附沉降。第45頁/共116頁46過濾介質(zhì)絕對(duì)過濾深度過濾

介質(zhì)的空隙小于被攔截的微生物大小，如用聚四氟乙烯或纖維素酯材料做成的微孔濾膜。

介質(zhì)孔隙大于被攔截的微生物大小，但介質(zhì)有一定厚度，機(jī)理是靜電，擴(kuò)散，慣性及攔截作用。如棉花過濾器，超細(xì)玻璃纖維紙，金屬燒結(jié)管等。（3）介質(zhì)過濾除菌第46頁/共116頁47第47頁/共116頁48介質(zhì)過濾除菌法是采用定期滅菌干燥介質(zhì)來阻截流過的空氣所含的微生物，從而獲得無菌的空氣。棉花：未脫脂棉花，纖維直徑為16-20μm，其實(shí)密度為1520Kg/m3。填充率為8.5-10%。

玻璃纖維：用無堿的玻璃纖維介質(zhì)作為過濾介質(zhì)。纖維直徑為3-20μm，其實(shí)密度為2600Kg/m3。填充率為5-11%。

活性炭：常與纖維狀介質(zhì)分層堆放成過濾床。通過過濾器的氣流速度一般為0.2-0.3m/s。3第48頁/共116頁494.3.2.2空氣凈化流程及提高過濾除菌的效率措施

空氣凈化過程中，要保持深層介質(zhì)過濾器在較高的效率下對(duì)空氣進(jìn)行過濾除菌，必須有：供氣設(shè)備（空氣壓縮機(jī)），對(duì)空氣提供足夠的能量；高效的過濾除菌設(shè)備（空氣過濾器），以除去空氣中的微生物顆粒；一系列加熱、冷卻及分離和除雜的附屬設(shè)備來保證。第49頁/共116頁501）.兩級(jí)冷卻，加熱除菌流程特點(diǎn)：兩次冷卻，兩次分離，適當(dāng)加熱。適應(yīng)性廣，充分分離油水，節(jié)約冷卻水。第50頁/共116頁512）.冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程特點(diǎn)：省去第二冷卻后的分離設(shè)備和空氣再加熱設(shè)備，流程比較簡(jiǎn)單，冷卻水用量少。適用于中等濕度的地區(qū)。第51頁/共116頁523）.高效前置過濾空氣除菌流程第52頁/共116頁532、提高過濾介質(zhì)除菌效率的措施如何提高過濾除菌效率設(shè)計(jì)合理預(yù)處理設(shè)備選擇合適凈化流程保證進(jìn)口空氣的潔凈度。降低空氣相對(duì)濕度保證過濾介質(zhì)干燥合理空氣過濾器，除菌效率高的過濾介質(zhì)第53頁/共116頁544.5菌種的培養(yǎng)4.5.1菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)就是為每次發(fā)酵罐投料，提供相當(dāng)數(shù)量的種子。4.5.2發(fā)酵階段的條件控制

反映發(fā)酵過程變化的參數(shù)分為兩類：一、是可以直接采用特定的傳感器檢測(cè)的參數(shù)，如溫度、罐壓、攪拌功率、轉(zhuǎn)速、泡沫、發(fā)酵液的黏度等稱為直接參數(shù)；二、難以用傳感器檢測(cè)到的數(shù)據(jù)，如細(xì)胞的生長(zhǎng)速率、產(chǎn)物生成情況等，稱為間接參數(shù)。上述參數(shù)中，對(duì)發(fā)酵過程影響較大的有營(yíng)養(yǎng)濃度、溫度、溶氧、PH、泡沫等。第54頁/共116頁554.5.2.1營(yíng)養(yǎng)條件的控制

（1）碳源和氮源之比在發(fā)酵培養(yǎng)基的配制過程中，要嚴(yán)格控制好碳氮比、無機(jī)鹽、維生素和金屬離子的濃度的比例，其中碳氮比的影響最為明顯。如谷氨酸發(fā)酵碳氮比為4：1時(shí)，菌體大量繁殖，積累少量的谷氨酸；而碳氮比為3：1時(shí)，則產(chǎn)生大量的谷氨酸，菌體增殖受到抑制。生產(chǎn)上用控制碳氮比以滿足菌體大量繁殖，同時(shí)又能促進(jìn)谷氨酸的產(chǎn)量。第55頁/共116頁56（2）補(bǔ)料在分批發(fā)酵中糖過多，會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)過旺，供氧不足，產(chǎn)量低。解決這一問題的方法是間歇或連續(xù)進(jìn)行補(bǔ)糖和補(bǔ)料。如在發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)物合成期時(shí)及時(shí)補(bǔ)料，可以延長(zhǎng)產(chǎn)物合成的旺盛階段，避免菌體過早衰老，也可控制PH和代謝方向。如生產(chǎn)利福霉素的過程中，根據(jù)還原糖的變化，中途加葡萄糖延長(zhǎng)利福霉素的合成期。補(bǔ)料方法可采用一次大量補(bǔ)料或連續(xù)流加的方法。第56頁/共116頁571、溫度的影響溫度對(duì)發(fā)酵的影響表現(xiàn)在影響酶的反應(yīng)速率，改變菌體代謝產(chǎn)物的合成方向，影響微生物的代謝調(diào)控機(jī)制；還影響到發(fā)酵液的黏度、氧在發(fā)酵過程中的溶解度，某些基質(zhì)的分解和吸收速率等，進(jìn)而影響發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)特性和產(chǎn)物的生物合成。4.5.2.2溫度的影響及控制第57頁/共116頁582、影響發(fā)酵溫度的因素在發(fā)酵過程中溫度是不斷變化的。發(fā)酵開始微生物處于延遲期，釋放熱量少，應(yīng)提高溫度，滿足菌體生長(zhǎng)的需要；當(dāng)微生物進(jìn)入對(duì)數(shù)期，菌體進(jìn)行呼吸作用和發(fā)酵作用，放出大量的熱，溫度劇烈上升；發(fā)酵后期，呼吸和發(fā)酵作用逐漸緩慢，釋放熱量少，溫度下降。在發(fā)酵過程中，引起溫度變化的因素有生物熱、攪拌熱、通氣熱、蒸發(fā)熱、輻射熱和顯熱。發(fā)酵熱是發(fā)酵過程中釋放出的凈熱量。Q發(fā)酵=Q生物

+Q攪拌

+Q通氣

-Q蒸發(fā)

-Q顯

–Q輻射第58頁/共116頁59A、生物熱（Q生物）在發(fā)酵過程中，菌體不斷利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，將其分解氧化而產(chǎn)生的能量，其中一部分用于合成高能化合物提供細(xì)胞合成和代謝產(chǎn)物合成需要的能量，其余一部分以熱的形式散發(fā)出來，這散發(fā)出來的熱就叫生物熱。

這種熱的主要來源是培養(yǎng)基中的碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等分解為二氧化碳、氨氣、水和其他物質(zhì)時(shí)釋放出來的。第59頁/共116頁60B、攪拌熱：在機(jī)械攪拌通氣發(fā)酵罐中，由于機(jī)械攪拌帶動(dòng)發(fā)酵液作機(jī)械運(yùn)動(dòng)，造成液體之間，液體與攪拌器等設(shè)備之間的摩擦，產(chǎn)生的熱量。攪拌熱受攪拌設(shè)備、攪拌方式和發(fā)酵液的粘度等影響。C、通氣熱：是指通入空氣溫度高于發(fā)酵液溫度時(shí)所產(chǎn)生的熱量。通氣熱的大小，取決于通入的空氣和發(fā)酵液的溫度差和通氣量。第60頁/共116頁61D、蒸發(fā)熱：發(fā)酵液蒸發(fā)水分帶走的熱量?？諝膺M(jìn)入發(fā)酵罐后，就和發(fā)酵液廣泛接觸進(jìn)行熱交換，同時(shí)必然會(huì)引起水分的蒸發(fā)，蒸發(fā)所需的熱量即為蒸發(fā)熱。E、顯熱：發(fā)酵排氣散發(fā)帶走的熱量。F、輻射熱：由于罐內(nèi)外的溫差，輻射帶走的熱量。因罐內(nèi)外的溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過罐體向外輻射。輻射熱的大小決定于罐內(nèi)外的溫差、罐的表面積等。冬天大一些，夏天小一些，一般不超過發(fā)酵熱的5％第61頁/共116頁623、溫度控制

溫度過高、過低均對(duì)微生物發(fā)酵不利。過高微生物很少繁殖并很快衰老死亡；過低微生物生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵時(shí)間很長(zhǎng)，所以發(fā)酵要在最適的溫度下進(jìn)行，但生長(zhǎng)最適溫度不一定是積累產(chǎn)物的最適溫度。因此要控制好發(fā)酵各階段的不同溫度，使微生物大量生長(zhǎng)繁殖，又可得到大量產(chǎn)物。

溫度影響微生物生長(zhǎng)的機(jī)理：

(1)影響酶活性。

(2)影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性。

(3)影響物質(zhì)的溶解度。第62頁/共116頁63溫度對(duì)微生物發(fā)酵的影響1）溫度影響產(chǎn)物合成的速率及產(chǎn)量從酶動(dòng)力學(xué)來看，溫度升高，反應(yīng)速率加大，代謝加快，生產(chǎn)期提前；但因酶本身很易因熱而失去活性，溫度越高，酶的失活也越快，表現(xiàn)在菌體易于衰老，發(fā)酵周期縮短，影響產(chǎn)物的最終產(chǎn)量。溫度除了直接影響發(fā)酵過程中各種反應(yīng)速率外，還通過改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，間接影響菌的生物合成。黑曲霉生長(zhǎng)最適溫度33-37℃

，積累檸檬酸的最適溫度在32℃

。第63頁/共116頁642）溫度可能會(huì)影響終產(chǎn)物的質(zhì)量例如凝結(jié)芽孢桿菌合成α-淀粉酶時(shí)，發(fā)酵溫度控制在55℃時(shí)，合成的α-淀粉酶耐高溫，在90℃、60min條件下，其活性喪失僅10％左右，而發(fā)酵溫度控制在35℃時(shí)，合成的α-淀粉酶在相同條件下喪失90％。3）溫度還可能影響生物合成的方向例如：四環(huán)素發(fā)酵中金色鏈霉菌同時(shí)能產(chǎn)生金霉素。在低于30℃下，該菌合成金霉素能力較強(qiáng)；溫度提高，合成四環(huán)素的比例提高；在溫度達(dá)到35℃時(shí)，則只產(chǎn)生四環(huán)素，金霉素的合成停止。第64頁/共116頁654.5.2.3溶氧的影響及控制

1、溶解氧影響由于氧在水中的溶解度很小，在培養(yǎng)基中的溶解度更小，而微生物細(xì)胞只能利用溶解氧，很少能直接從空氣泡中獲得氧，所以需要不斷通風(fēng)和攪拌，才能滿足發(fā)酵需氧的要求。引起溶解氧異常升高的原因：a、菌體代謝出現(xiàn)異常，耗氧能力下降，使溶解氧上升；b、污染烈性噬菌體，產(chǎn)生菌未裂解前，呼吸受到抑制，溶解氧可能迅速上升，到菌體破裂后，完全失去呼吸能力，溶解氧直線上升。第65頁/共116頁66發(fā)酵工藝中引起溶解氧異常下降的原因有：1、污染好氣性雜菌，大量的溶解氧被消耗掉，可能使溶解氧短時(shí)間內(nèi)降到零附近，如果雜菌本身好養(yǎng)量不強(qiáng)，溶解氧變化可能也不明顯；2、菌體代謝發(fā)生異常現(xiàn)象，需氧要求增加，使溶解氧下降；3、某些設(shè)備或工藝控制發(fā)生故障或變化，也可能引起溶解氧下降。如攪拌速度變慢，影響供氧能力，也會(huì)使溶解氧迅速下降。第66頁/共116頁672、溶解氧濃度的控制

發(fā)酵液的溶解氧濃度是由供氧和需氧兩方面決定的。當(dāng)供氧量大于需氧量時(shí)，溶解氧濃度上升，直至飽和；如需氧量大于供氧量，溶解氧濃度則下降。因此控制溶解氧濃度應(yīng)從供氧和需氧兩個(gè)方面考慮。（1）影響供氧的因素a、增加空氣中氧的含量，使氧分壓增高；b、提高罐壓力；但同時(shí)會(huì)增加CO2的溶解度影響pH，可能會(huì)影響菌的代謝。c、調(diào)節(jié)通風(fēng)速率；d、調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速。第67頁/共116頁68（2）影響耗氧的因素a、菌齡影響耗氧：呼吸旺盛，耗氧力強(qiáng)，發(fā)酵后期菌體處于衰老狀態(tài)，耗氧能力自然減弱。b、培養(yǎng)基的成分和濃度顯著影響耗氧：培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)豐富，菌體生長(zhǎng)快，耗氧量大；發(fā)酵液濃度高，耗氧量大；發(fā)酵過程補(bǔ)料或補(bǔ)糖，微生物對(duì)氧的攝取量隨著增大。C、發(fā)酵條件影響耗氧：在最適條件下發(fā)酵，耗氧量大。第68頁/共116頁69不同種類微生物，對(duì)pH要求不同；酵母：pH3.8－6.0細(xì)菌：pH6.5－7.5霉菌：pH4.0－6.0放線菌：pH7.0－8.04.5.2.4PH的影響及控制1、PH的影響

第69頁/共116頁70pH不同，微生物代謝產(chǎn)物不同

黑曲霉pH：2－3，檸檬酸發(fā)酵pH：7.0，草酸發(fā)酵谷氨酸菌pH：7－8，谷氨酸發(fā)酵pH：5.0－5.8，谷氨酰胺發(fā)酵釀酒酵母pH：4.5-7.0，乙醇發(fā)酵pH：8.0，甘油發(fā)酵第70頁/共116頁71微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵的最適宜pH可能不同。丙酮丁醇菌生長(zhǎng)：pH5.5－7.0;發(fā)酵：pH4.3-5.3;鏈霉素菌生長(zhǎng)：pH6.3-6.9發(fā)酵：pH6.7-7.3青霉素菌生長(zhǎng)：pH6.5-7.2發(fā)酵：pH6.2-6.8第71頁/共116頁72a、影響酶的活性，當(dāng)pH值抑制菌體中某些酶的活性時(shí)，會(huì)阻礙菌體的新陳代謝；b、影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細(xì)胞膜的通透性，影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的排泄；c、影響培養(yǎng)基中某些組分的解離；d、pH值不同，往往引起菌體代謝過程的不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。pH值對(duì)發(fā)酵的影響第72頁/共116頁732、發(fā)酵過程中pH值的調(diào)節(jié)及控制最適pH值的確定：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同的pH值出發(fā)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程中定時(shí)測(cè)定和調(diào)節(jié)pH值以維持出發(fā)pH值，或者利用緩沖液配制培養(yǎng)基來維持。定時(shí)觀察菌體的生長(zhǎng)情況，以菌體生長(zhǎng)達(dá)到最高值的pH值為生長(zhǎng)最適pH。同樣的方法可測(cè)得產(chǎn)物合成的最適pH值。但同一產(chǎn)物的最適pH值，還與所用的菌種、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件有關(guān)。第73頁/共116頁74在發(fā)酵過程中使pH穩(wěn)定在最適合的范圍的方法1、在設(shè)計(jì)培養(yǎng)基時(shí)考慮到維持pH的需要。選擇合適的營(yíng)養(yǎng)物和適當(dāng)?shù)呐浔?，使發(fā)酵過程中的pH維持在合適的范圍。2、生理酸性和生理堿性物質(zhì)的利用。中和代謝過程中產(chǎn)生的堿或酸，以維持一定的pH。3、緩沖液的利用。在培養(yǎng)基中加入碳酸鈣或磷酸鹽，可以減緩發(fā)酵液中pH的變化。4、通過中間補(bǔ)料控制pH。通過補(bǔ)加糖、玉米漿、氨水以及通氨等來調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pH變化。第74頁/共116頁754.5.2.5發(fā)酵過程中泡沫的影響和控制微生物在深層培養(yǎng)過程中由于通風(fēng)和攪拌、代謝氣體的逸出以及培養(yǎng)基中糖、蛋白質(zhì)、代謝物等穩(wěn)定泡沫的活性物質(zhì)存在，使發(fā)酵液中產(chǎn)生大量的泡沫。

泡沫產(chǎn)生的原因：1、強(qiáng)通風(fēng)攪拌而造成的泡沫；2、培養(yǎng)基某些成分如蛋白胨、玉米漿等主要的發(fā)泡物質(zhì)所產(chǎn)生。3、代謝產(chǎn)生的氣體也能產(chǎn)生泡沫。第75頁/共116頁761、泡沫的影響這些泡沫的存在可以增加氣液接觸面積，增加氧傳遞的速率。但也給發(fā)酵帶來不利的影響。1）干擾通氣；2）妨礙菌體的生長(zhǎng)和代謝；3）菌體得不到必要的溶解氧，也影響二氧化碳的排除；4）引起染菌：由于泡沫增多而引起逃液，增加了染菌的機(jī)會(huì)；5）泡沫傳熱差，造成滅菌不徹底；6）泡沫的表面張力會(huì)引起產(chǎn)生的酶失活。第76頁/共116頁772、泡沫的控制泡沫的控制，可以采用三種途徑：①調(diào)整培養(yǎng)基中的成分(如少加或緩加易起泡的原材料)或改變某些物理化學(xué)參數(shù)(如pH值、溫度、通氣和攪拌)或者改變發(fā)酵工藝(如采用分次投料)來控制，以減少泡沫形成的機(jī)會(huì)。但這些方法的效果有一定的限度。第77頁/共116頁78②采用機(jī)械消泡或消泡劑消泡這兩種方法來消除已形成的泡沫：通過化學(xué)方法，降低泡沫液膜的表面張力，使泡沫破滅；利用物理方法，使泡沫液膜的局部受力，打破液膜原來受力平衡而破裂。③采用菌種選育的方法，篩選不產(chǎn)生泡沫的菌種，來消除起泡的內(nèi)在因素，如：雜交選育不產(chǎn)泡沫的土霉素生產(chǎn)菌株。對(duì)于已形成的泡沫，工業(yè)上可以采用機(jī)械消泡和化學(xué)消泡劑消泡或兩者同時(shí)使用消泡。第78頁/共116頁79化學(xué)消泡法1、消泡機(jī)理1）降低泡沫的機(jī)械強(qiáng)度，使泡沫破裂。2）降低液膜的表面黏度，使液膜的液體流失，導(dǎo)致泡沫破裂。當(dāng)泡沫表層存在著由極性的表面活性物質(zhì)形成的雙電層時(shí)，可以加入另一種具有相反電荷的表面活性劑，以降低泡沫的機(jī)械強(qiáng)度；或加入某些具有強(qiáng)極性的物質(zhì)與發(fā)泡劑爭(zhēng)奪膜上的空間，降低液膜強(qiáng)度，使泡沫破裂。當(dāng)泡沫的液膜具有較大的表面黏度時(shí)，可以加入某些分子內(nèi)聚力較小的物質(zhì)，以降低液膜黏度。第79頁/共116頁80常用的一些消泡劑：①天然油脂：常用豆油、玉米油、米糠油。②高碳醇、脂肪酸和酯類：十八醇是常用的一種，它可以單獨(dú)或與載體一起使用。

③聚醚類；④硅酮類；主要是聚二甲基硅氧烷及衍生物，無色液體，不溶于水。純聚二甲基硅氧烷的消泡能力低，常加分散劑來提高消泡活性。第80頁/共116頁81化學(xué)消泡最顯著的缺點(diǎn)是影響氧氣的溶解，使其減少1/3～1/5，這對(duì)微生物供氧極為不利；機(jī)械消泡能克服這一缺點(diǎn)，但其應(yīng)用效果不如化學(xué)消泡迅速可靠，不能從根本上消除引起穩(wěn)定泡沫的因素。機(jī)械消泡是依靠物理學(xué)原理，即通過機(jī)械力引起強(qiáng)烈振動(dòng)或壓力變化，使泡沫破裂。優(yōu)點(diǎn)：不需外加物質(zhì)；節(jié)省原材料；減少污染機(jī)會(huì)。缺點(diǎn)：不能從根本上消除引起泡沫穩(wěn)定的原因。物理消泡法第81頁/共116頁824.6發(fā)酵過程中的檢驗(yàn)發(fā)酵生產(chǎn)中必須建立一套檢驗(yàn)常規(guī)，檢驗(yàn)的具體項(xiàng)目隨不同發(fā)酵產(chǎn)品而有所不同，經(jīng)常檢驗(yàn)的項(xiàng)目有：4.6.1生物學(xué)檢驗(yàn)一般是用顯微鏡觀察菌體形態(tài)的變化以及無菌檢查。1.菌體的觀察和吸光度測(cè)定用顯微鏡檢查各個(gè)發(fā)酵階段的菌體形態(tài)，同時(shí)對(duì)菌體的生長(zhǎng)情況進(jìn)行吸光度測(cè)定。例如，枯草芽孢桿產(chǎn)生蛋白酶發(fā)酵過程中的發(fā)酵初期，只有營(yíng)養(yǎng)體，隨后芽孢逐漸增多，到發(fā)酵后期芽孢達(dá)細(xì)胞總第82頁/共116頁83數(shù)的95％以上，吸光度不再升高，糖也消耗完，應(yīng)停止發(fā)酵。2、無菌檢查為及時(shí)發(fā)現(xiàn)雜菌，以便采取有效的措施，對(duì)每次無菌取樣的發(fā)酵液必須進(jìn)行無菌檢查。4.6.2生化檢驗(yàn)1、殘?zhí)堑臏y(cè)定

發(fā)酵過程中糖量變化，可以衡量發(fā)酵是否正常。糖消耗越快，說明生長(zhǎng)越旺盛，但只有糖份下降，而無發(fā)酵產(chǎn)物的增加，應(yīng)該考慮是否有雜菌污染。殘?zhí)菧y(cè)定可作為分批發(fā)酵的終點(diǎn)的指標(biāo)之一，一般認(rèn)為殘?zhí)窍陆档?.5％以下則發(fā)酵是徹底的。第83頁/共116頁84糖測(cè)定方法有物理法和化學(xué)法。2、含氮量測(cè)定發(fā)酵過程中一般變化不大，一般不測(cè)，但某些產(chǎn)品如石油脫蠟等發(fā)酵中氮源消耗是判斷發(fā)酵旺盛或衰敗的一個(gè)主要標(biāo)志之一，必須要測(cè)定。3、發(fā)酵目的產(chǎn)物的測(cè)定如發(fā)酵目的物已不再上升，結(jié)合碳源已接近耗盡，菌體衰老自溶，溫度不在上升，就可以停止發(fā)酵。第84頁/共116頁854.6.3雜菌和噬菌體的污染、防治和挽救4.6.3.1雜菌污染的檢查1、平板劃線法2、液體培養(yǎng)基檢查法3、顯微鏡檢查法4.6.3.2噬菌體污染的檢查

發(fā)酵過程中除容易遭雜菌污染外，還常被噬菌體污染。如谷氨酸發(fā)酵過程中的種子或發(fā)酵罐污染噬菌體一般都在對(duì)數(shù)期。此時(shí)，發(fā)酵液泡沫增多，pH升高，吸光度不增加，二氧化碳下降，耗糖慢或停止。顯微鏡下發(fā)現(xiàn)菌體數(shù)量顯著減少，形態(tài)變粗第85頁/共116頁86染色不均勻，細(xì)胞壁不整齊，菌體逐漸裂解后出現(xiàn)碎片，發(fā)酵液發(fā)黏，完整菌體很少，這時(shí)懷疑有噬菌體污染。檢測(cè)方法：a、培養(yǎng)法：發(fā)酵液樣品離心后，取上清液，取0.1ml置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，另取新鮮對(duì)數(shù)期內(nèi)的生產(chǎn)菌液0.2ml于之接觸，然后倒入固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后觀察是否有噬菌體。b、載玻片法：將被檢查樣品和菌液與含有0.8％瓊脂的培養(yǎng)基混合，涂于無菌載玻片上，凝固后，經(jīng)數(shù)小時(shí)培養(yǎng)，在顯微鏡下放大觀察噬菌體是否存在。第86頁/共116頁874.6.3.3雜菌污染和防治1、造成雜菌污染的原因a、設(shè)備結(jié)構(gòu)不嚴(yán)密；b、空氣過濾不徹底，帶有雜菌；c、種子不純，帶有雜菌；d、原料滅菌不徹底；e、環(huán)境不衛(wèi)生等。2、污染的防治a、防止種子帶入雜菌；第87頁/共116頁88b、培養(yǎng)基的徹底滅菌；c、防止空氣系統(tǒng)染菌；d、注意環(huán)境衛(wèi)生，建立衛(wèi)生制度。4.6.3.4噬菌體污染的防治噬菌體污染的防治的主要是選育抗噬菌體的菌株。發(fā)酵過程中要注意以下事項(xiàng)：A、嚴(yán)禁活菌體排放；B、建立經(jīng)常性的環(huán)境衛(wèi)生制度；C、把握種子關(guān)，嚴(yán)防噬菌體進(jìn)入種子罐和發(fā)酵罐；第88頁/共116頁89D、合理布置車間；E、利用藥物防治。4.6.3.5雜菌和噬菌體污染后的挽救污染后的挽救措施主要根據(jù)污染的原因分析，盡可能避免污染擴(kuò)大，節(jié)約原材料，爭(zhēng)取得到產(chǎn)品。

種子擴(kuò)大培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)污染就應(yīng)放棄種子；第89頁/共116頁90發(fā)酵早期發(fā)現(xiàn)染菌時(shí)，可采用接入大量種子，使生產(chǎn)菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，抵制雜菌的繁殖；或立即將發(fā)酵液滅菌重新接種；

發(fā)酵后期染菌，而雜菌又不影響生產(chǎn)菌的正常發(fā)酵，也不妨礙產(chǎn)品后處理，則讓其共生長(zhǎng)；如果雜菌影響發(fā)酵的正常進(jìn)行或產(chǎn)品的后處理，應(yīng)提前放罐；還可以在發(fā)酵液中加入抑制雜菌的物質(zhì)。第90頁/共116頁91發(fā)酵前期污染噬菌體應(yīng)停止攪拌、小通風(fēng)，立即培養(yǎng)抗性菌株，接入發(fā)酵罐，或更換生產(chǎn)菌種；在罐內(nèi)用夾層加熱至70-80℃，因噬菌體不耐熱，加熱可殺死發(fā)酵液內(nèi)的噬菌體，冷卻后，接入2倍的原菌種，PH正常后再攪拌。發(fā)酵初期發(fā)現(xiàn)感染噬菌體，可以利用噬菌體只能在生長(zhǎng)階段的細(xì)胞中繁殖的特點(diǎn)，將發(fā)酵正常并已培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的發(fā)酵液加入感染噬菌體的發(fā)酵液中，以等體積混合后再發(fā)酵。第91頁/共116頁924.7發(fā)酵培養(yǎng)方法微生物發(fā)酵過程可分為分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵、混菌發(fā)酵、高密度發(fā)酵及與產(chǎn)物回收結(jié)合的透析發(fā)酵、濾膜發(fā)酵等方法。不同的發(fā)酵技術(shù)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，了解生產(chǎn)菌在不同的發(fā)酵培養(yǎng)方法下細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝和產(chǎn)物的變化規(guī)律，有助于發(fā)酵生產(chǎn)的有效控制。第92頁/共116頁934.7.1分批發(fā)酵

1.概念：在一個(gè)密閉系統(tǒng)內(nèi)投入有限數(shù)量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后，然后接入少量的微生物菌種進(jìn)行培養(yǎng)，在特定的條件下只完成一個(gè)生長(zhǎng)周期的微生物培養(yǎng)方法。2.特點(diǎn)：（1）整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)與外界沒有其它物質(zhì)交換；（2）整個(gè)過程中菌的濃度、營(yíng)養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度不斷變化，是一種非穩(wěn)態(tài)的培養(yǎng)方法。第93頁/共116頁94特點(diǎn)

分批發(fā)酵過程一般可分為四個(gè)時(shí)期，即延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期；也可以分為六期：延遲期、加速期、對(duì)數(shù)期、減速期、靜止期和衰亡期。第94頁/共116頁95停滯期A現(xiàn)象：剛接種后一段時(shí)間，細(xì)胞數(shù)目和菌量不變，曲線平行于橫軸。。B.原因：由于細(xì)胞進(jìn)入新環(huán)境,細(xì)胞數(shù)目無增長(zhǎng)，甚至有所下降有一個(gè)適應(yīng)過程，進(jìn)行大量的酶的生成。

C.細(xì)胞特點(diǎn):細(xì)胞的新陳代謝非常旺盛，個(gè)體體積顯著增大，但不分裂繁殖，為細(xì)胞分裂作準(zhǔn)備。第95頁/共116頁96D.此期長(zhǎng)短：與菌種遺傳特性、菌齡、接種量、培養(yǎng)條件有關(guān)。E.意義：在發(fā)酵工作中，縮短遲緩期的措施：1）加大接種量（群體優(yōu)勢(shì)--適應(yīng)性增強(qiáng)）；2）用對(duì)數(shù)期的種子（此時(shí)細(xì)胞分裂旺盛）；3）調(diào)整培養(yǎng)基的成分，使種子基含有發(fā)酵培養(yǎng)基的成分；4）選用繁殖快的菌種。第96頁/共116頁97加速期在延滯期后對(duì)數(shù)期前，細(xì)胞生長(zhǎng)速率逐漸加快，進(jìn)入短的加速期。此菌已完全適應(yīng)周圍的環(huán)境，由于有充足的營(yíng)養(yǎng)，而且沒有抑制生長(zhǎng)的有害物質(zhì)，菌體開始大量繁殖，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)期。第97頁/共116頁98對(duì)數(shù)期1.現(xiàn)象：又稱指數(shù)期，生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞數(shù)目以幾何級(jí)數(shù)增加，其對(duì)數(shù)與時(shí)間呈直線關(guān)系。2.細(xì)胞特點(diǎn)：此時(shí)細(xì)胞的大小、形態(tài)、染色性、生理特征等均趨于一致，代謝活躍，對(duì)外界環(huán)境因素的作用敏感。生長(zhǎng)速率高，代時(shí)穩(wěn)定。研究細(xì)菌的性狀時(shí)應(yīng)選用該期的細(xì)菌。第98頁/共116頁99減速期

隨著營(yíng)養(yǎng)成分的減少、有害代謝產(chǎn)物的積累，生長(zhǎng)速度明顯放慢。雖然細(xì)胞總數(shù)仍在增加，但是細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率開始下降，細(xì)胞在代謝與形態(tài)方面逐漸衰退，經(jīng)短時(shí)間的減速后進(jìn)入靜止期。第99頁/共116頁100靜止期A.現(xiàn)象：活菌數(shù)目不增不減，生長(zhǎng)速率趨于0,曲線有一下降的趨勢(shì)。B.細(xì)胞特點(diǎn):

有害物增加，死亡數(shù)增加，細(xì)菌的芽胞、外毒素和抗生素等代謝產(chǎn)物在此期產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)開始貯藏物質(zhì)。穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達(dá)到最高。第100頁/共116頁101衰退期A現(xiàn)象：細(xì)胞死亡速率>生長(zhǎng)速率。一般總菌數(shù)不變,活菌數(shù)曲線下降。B特點(diǎn)：死菌數(shù)多于活菌數(shù)，菌體變形，大小不一，細(xì)胞出現(xiàn)自溶,生理代謝活動(dòng)停滯。所有的發(fā)酵產(chǎn)品必須在進(jìn)入死亡期以前結(jié)束發(fā)酵。第101頁/共116頁102分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):

操作簡(jiǎn)單，周期短，染菌機(jī)會(huì)少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握。缺點(diǎn):

產(chǎn)率低。勞動(dòng)強(qiáng)度大，而且每批發(fā)酵的結(jié)果都不完全一樣，對(duì)分離提純?cè)斐闪死щy。但由于操作相對(duì)較易，目前仍是發(fā)酵工業(yè)的主要方式。第102頁/共116頁1031.概念：微生物培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，在發(fā)酵罐中不斷添加新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)不斷放出代謝物，使微生物細(xì)胞在近似恒定狀態(tài)下生長(zhǎng)的發(fā)酵方式。2.特點(diǎn)：連續(xù)發(fā)酵可使發(fā)酵罐內(nèi)的液量維持恒定，微生物在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)。穩(wěn)定狀態(tài)可以有效的延長(zhǎng)分批培養(yǎng)中的對(duì)數(shù)期。在恒定的狀態(tài)下，微生物所處的環(huán)境條件如營(yíng)養(yǎng)濃度、產(chǎn)物濃度、pH、微生物細(xì)胞的濃度以及生長(zhǎng)速率等可以始終維持不變。4.7.2連續(xù)發(fā)酵第103頁/共116頁104

恒化連續(xù)發(fā)酵中控制適當(dāng)?shù)牧魉?，使?xì)胞消耗的營(yíng)養(yǎng)及時(shí)得到補(bǔ)充，恒化器中的營(yíng)養(yǎng)組成基本恒定，從而保持細(xì)胞的恒定生長(zhǎng)速率。恒濁連續(xù)發(fā)酵中，不斷調(diào)節(jié)流入和流出的速度，保持培養(yǎng)液中的濁度基本