基礎(chǔ)生化第十章的生物合成

第1頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA指導(dǎo)的RNA的合成一、轉(zhuǎn)錄的一般特點(diǎn)二、DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶三、原核生物轉(zhuǎn)錄過程四、真核生物轉(zhuǎn)錄第2頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四一、轉(zhuǎn)錄的一般特點(diǎn)不對稱轉(zhuǎn)錄:一條為負(fù)鏈（模板鏈）；另一條不做模板的鏈叫正鏈（編碼鏈）。2.轉(zhuǎn)錄不需要引物，最先被轉(zhuǎn)錄的通常是嘌呤核苷酸3.以4種NTP為原料，需要Mg2+4.轉(zhuǎn)錄需要模板、解鏈，鏈的延長方向也是5′→3′，也有忠實(shí)性，調(diào)控主要在起始階段。第3頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四5335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向不對稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)a.在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；b.模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。第4頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（一）原核生物RNA聚合酶

二、DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶n1ATPn2CTPn3GTPn4UTPRNA聚合酶DNA模板RNA+（n1+n2+n3+n4)PPi特點(diǎn):（1）只有5′→3′聚合酶活性，而無外切酶活性（2）可催化從頭合成，不需引物（3）啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄需識(shí)別啟動(dòng)子P557第5頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四核心酶coreenzyme全酶

holoenzymea2bb'ws=a2bb'w+s

全酶核心酶

此外，每個(gè)RNA聚合酶還含有2個(gè)Zn離子。P558ωω大腸桿菌RNA聚合酶亞基組成：第6頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四亞基基因亞基數(shù)目功能rpoA2識(shí)別啟動(dòng)子上游序列解開前方的DNA雙螺旋、恢復(fù)后面的DNA雙螺旋βrpoB1結(jié)合底物核苷酸催化磷酸二酯鍵的形成β'rpoC1與DNA的模板鏈結(jié)合σrpoD1識(shí)別啟動(dòng)子部位，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始ω1未知大腸桿菌RNA聚合酶各亞基的性質(zhì)和功能催化中心第7頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四第8頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四多個(gè)通道：核苷酸入口；RNA出口；DNA入口第9頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（二）真核生物的RNA聚合酶功能分工種類分布轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相對活性α-鵝膏蕈堿敏感性對放線菌素D敏感性RNApolⅠ核仁28S,18S,5.8SrRNA50-70％不敏感非常RNApolⅡ核質(zhì)hnRNA，SnRNA20-40％高度輕度RNApolⅢ核質(zhì)tRNA，5SrRNA，SnRNA，ScRNA10％種特異性輕度環(huán)狀八肽本身不能直接識(shí)別起點(diǎn)，需借助于轉(zhuǎn)錄因子P561第10頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個(gè)問題：RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。三、原核生物轉(zhuǎn)錄過程（一）轉(zhuǎn)錄起始P559第11頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四DNA序列按正鏈RNA來書寫。將在DNA上開始轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)堿基定為+1，沿轉(zhuǎn)錄方向下游的核苷酸序列均用正值表示；上游的核苷酸序列均用負(fù)值表示。1.轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的確定啟動(dòng)子（Promoter）：RNA聚合酶能夠識(shí)別、并與模板DNA結(jié)合而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA序列。約20-200個(gè)堿基的特定順序。P561第12頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四

××AGTCTTGACA××××××××××××××××××TAT××××××××××××××ATAAAT××××××AACTGT××××AAT××××××××××××××××Pribnow框-10-35識(shí)別區(qū)16-19bp5-9bp起點(diǎn)大腸桿菌啟動(dòng)子共有序列及其功能兩個(gè)序列的高度保守，之間的距離也非常重要，將影響σ因子的作用，從而改變起始效率。P562第13頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四ThenucleotidesequencesofrepresentativeE.colipromoters

-10區(qū)順序：TATAAT一致性序列（Pribnowbox）是雙螺旋解開的區(qū)域-35區(qū)順序：TTGACA一致性序列,是RNA-pol對轉(zhuǎn)錄起始的識(shí)別位點(diǎn)

第14頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四如何確定啟動(dòng)子的位置和序列？DNA足跡法（Foot-printing）P562第15頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四σ因子識(shí)別并與啟動(dòng)子特異性結(jié)合（上游序列由α亞基識(shí)別）RNA聚合酶全酶結(jié)合到起始點(diǎn)，形成封閉型復(fù)合物-10區(qū)雙鏈打開形成開放型復(fù)合物合成10個(gè)以上核苷酸的RNA鏈σ因子脫落，RNA聚合酶離開啟動(dòng)子，進(jìn)入RNA鏈延伸階段P559第16頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四1）RNA聚合酶與dsDNA非特異結(jié)合（疏松），滑動(dòng)掃描2）RNA聚合酶全酶與啟動(dòng)子-35區(qū)特異結(jié)合，形成封閉復(fù)合物（未解鏈）3）封閉復(fù)合物異構(gòu)化，轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放復(fù)合物（解鏈形成轉(zhuǎn)錄泡）4）第一個(gè)磷酸二酯鍵形成（通常為嘌呤核苷酸）5）啟動(dòng)子清空（參入6-10nt后σ因子釋放，RNA聚合酶離開）2.轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成（限速）啟動(dòng)子強(qiáng)度不同，鏈延伸的速度平均50nt/ｓ聚合酶全酶上的σ因子能識(shí)別啟動(dòng)子，并識(shí)別有義鏈，從而使全酶定位到啟動(dòng)子部位。第17頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合第18頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四σ因子識(shí)別并與啟動(dòng)子特異性結(jié)合（上游序列由α亞基識(shí)別）RNA聚合酶全酶結(jié)合到起始點(diǎn)，形成封閉型復(fù)合物-10區(qū)雙鏈打開形成開放型復(fù)合物合成10個(gè)以上核苷酸的RNA鏈σ因子脫落，RNA聚合酶離開啟動(dòng)子，進(jìn)入RNA鏈延伸階段P559第19頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四

當(dāng)s因子從核心酶上脫落后，核心酶與DNA鏈的結(jié)合變得疏松，可以在模板鏈上滑動(dòng)，方向?yàn)镈NA模板鏈的3′→5′，同時(shí)將核苷酸逐個(gè)加到RNA鏈的3'-OH端，使RNA鏈以5′→3′方向延伸。（二）轉(zhuǎn)錄的延伸A型雙螺旋第20頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四RNApol轉(zhuǎn)錄復(fù)合物：酶-DNA-RNA：轉(zhuǎn)錄空泡RNADNA上的解螺旋區(qū)：在RNA鏈延伸的同時(shí)，RNA聚合酶繼續(xù)解開它前方的DNA雙螺旋，暴露出新的模板鏈，而后面被解開的兩條DNA單鏈又重新形成雙螺旋，DNA上的解螺旋區(qū)保持約17個(gè)堿基對的長度。（轉(zhuǎn)錄泡）第21頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四終止子：DNA分子上終止轉(zhuǎn)錄的特殊信號(hào)。原核生物終止子都有一個(gè)回文序列，產(chǎn)生的RNA可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可使RNA聚合酶減慢移動(dòng)或暫停合成。NusA等因子：輔助RNA聚合酶識(shí)別終止子。如NusA因子促進(jìn)其在終止子位置的停頓。（三）轉(zhuǎn)錄的終止P566第22頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四1.依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止（當(dāng)終止信號(hào)較弱時(shí)）ρ因子5′3′Polymerase富含C的短的回文對稱區(qū)P566第23頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四ρ因子功能識(shí)別并與新生RNA5′結(jié)合ATP供能ρ因子沿新生RNA單鏈推進(jìn),遇到暫停的RNA聚合酶新生RNA單鏈從DNA模板上分離下來（1）識(shí)別結(jié)合富含C的RNA鏈（2）依賴于RNA的ATPase活性（3）RNA-DNA解螺旋酶活性第24頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)錄方向TCGGGCGAGCCCGCCGCCCGAGCGGGCTAAAAAATTTTTT3′3′5′5′DNA模板鏈編碼鏈2.不依賴ρ因子的終止子（主要方式，又稱簡單終止）反向重復(fù)序列3′5′AAAAAAUUUUUUCGCCCGAGCGGGCU5′TTTTTTDNA模板鏈編碼鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3′3′5′第25頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（1）DNA模板上有終止信號(hào)富含GC的回文結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄出來的RNA自身互補(bǔ)形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)（2）轉(zhuǎn)錄出來的RNA

3′尾端有≥4個(gè)U，RNA-DNA為弱鍵配對簡單終止的序列特征5′pppG5335RNA-pol莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理RNAPol遇莖環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生停頓，誘導(dǎo)RNA聚合酶構(gòu)象改變；密集A-U配對使DNA和RNA穩(wěn)定性下降，轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，釋放轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。第26頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)延長階段53RNA啟動(dòng)子Promoter

終止子terminator5RNA聚合酶5353553離開第27頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄比較復(fù)雜。1.真核基因的順式作用元件（cis-actingelement）：即DNA上對基因表達(dá)有調(diào)節(jié)活性的特定序列，按其功能可分為：啟動(dòng)子、增強(qiáng)子（enhancer）和沉默子（silencer）等。對應(yīng)三類RNA聚合酶，有三類啟動(dòng)子，RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子序列多樣。四、真核生物轉(zhuǎn)錄（了解）第28頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四

TATA盒

CAAT盒

GC盒

增強(qiáng)子

順式作用元件結(jié)構(gòu)基因-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始真核生物啟動(dòng)子保守序列第29頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四TATA框是RNA聚合酶Ⅱ和轉(zhuǎn)錄因子形成前起始復(fù)合物的主要裝配點(diǎn)。起始子（initiator，Inr）：轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)TATAPyPyANTAPyPy+1Inr第30頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四2.轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactor，TF）：RNA聚合酶在啟動(dòng)子部位起始轉(zhuǎn)錄需要的輔助因子（蛋白質(zhì)）。真核生物的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)子由轉(zhuǎn)錄因子而不是RNA聚合酶識(shí)別。參與RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄起始的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目眾多，分為三類：通用轉(zhuǎn)錄因子（generaltranscriptionfactor，GTF）、上游因子、可誘導(dǎo)因子。第31頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四參與RNA-polⅡ轉(zhuǎn)錄的TFⅡ

P564第32頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四POL-ⅡTFⅡFⅡAⅡBRNA-PolⅡ催化轉(zhuǎn)錄的PIC（前起始復(fù)合物）的組裝

Pol-ⅡTFⅡFⅡHⅡETBPTAFTFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA復(fù)合物TATAⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡHⅡECTD-PPIC組裝完成，TFⅡH使CTD磷酸化P564第33頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四原核生物與真核生物轉(zhuǎn)錄的區(qū)別

原核生物真核生物

RNApol一種高度分工起始轉(zhuǎn)錄因子沒有需要（各不同）啟動(dòng)子以外序列沒有有且復(fù)雜轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物多順反子單順反子場所轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)不偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄終止兩種終止子不明確第34頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄原料dDNANTP模板完整兩條鏈雙向復(fù)制DNA區(qū)段一條鏈不對稱轉(zhuǎn)錄引物RNA為引物不需要酶與蛋白因子9種酶和蛋白因子全酶校正功能有無（很有限）差錯(cuò)率10-9-10-1010-4-10-5原核生物復(fù)制與轉(zhuǎn)錄比較第35頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工基因轉(zhuǎn)錄的直接產(chǎn)物是初級轉(zhuǎn)錄物，一般是無功能的，往往需經(jīng)過結(jié)構(gòu)和化學(xué)的變化（轉(zhuǎn)錄后加工）才會(huì)具有功能。轉(zhuǎn)錄后加工的方式有多種，但本質(zhì)相同：是增減核苷酸或核苷酸的修飾。三種主要的RNA在原核和真核生物中的加工方式不完全相同。幾個(gè)基本要點(diǎn)：即使同一RNA前體也可能有不同加工方式，產(chǎn)生幾種產(chǎn)物，這是基因表達(dá)調(diào)控的一種手段。P570第36頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四⑴真核細(xì)胞每種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都是各種RNA的前身，必須在胞核內(nèi)經(jīng)過適當(dāng)加工，使之變成具有活性的成熟RNA后，由胞核運(yùn)至胞質(zhì)才能執(zhí)行翻譯功能。⑵原核細(xì)胞mRNA不需加工，tRNA和rRNA需要加工。⑶mRNA前體加工復(fù)雜。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄作用和翻譯作用無論在空間上還是時(shí)間上都是彼此分開進(jìn)行的。真核細(xì)胞與原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后加工的比較：相同點(diǎn)：二者tRNA和rRNA加工相似不同點(diǎn)：第37頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四一、原核生物RNA的轉(zhuǎn)錄后加工（一）原核生物mRNA前體加工原核生物mRNA一般不穩(wěn)定，很少經(jīng)歷加工，多數(shù)是邊轉(zhuǎn)錄、邊翻譯。唯一的加工作用是多順反子mRNA在RNaseⅢ的催化下，裂解為單獨(dú)的順反子。（二）原核生物tRNA前體的加工原核生物tRNA初始轉(zhuǎn)錄本有三種P570原核生物基因表達(dá)調(diào)控的單位是操縱子，其轉(zhuǎn)錄物為多順反子。第38頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（1）多數(shù)為多順反子（3）由tRNA和rRNA串聯(lián)組成（2）少數(shù)為單順反子第39頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四5’成熟酶多順反子tRNA兩個(gè)末端的加工識(shí)別加工部位的空間結(jié)構(gòu)。由蛋白質(zhì)和RNA組成（核酶）。FFP572第40頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四P5723’成熟酶tRNA核苷酰轉(zhuǎn)移酶第41頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（1）RNaseP切除E.coli前體tRNA5′的前導(dǎo)序列（41nt）。（2）去尾，形成3’-OH末端。由內(nèi)切酶和外切酶（RNaseF和RNaseD）共同參與。（3）修飾。主要是堿基修飾，方式近百種，常見的如通過甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等的作用進(jìn)行修飾成為特殊的堿基（4）加上CCA剪切修剪核苷酸修飾原核生物tRNA前體的加工第42頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四堿基修飾（2）還原反應(yīng)如：UDHU（3）核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)如：Uψ（4）脫氨反應(yīng)如：AI如：AAm（1）甲基化（1）（1）（3）（2）（4）第43頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四原核生物rRNA以多順反子的形式存在，還可能帶有某些tRNA的基因。E.coli中rRNA有7個(gè)轉(zhuǎn)錄單位,每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位含有16S、23S、5SrRNA及一個(gè)或幾個(gè)tRNA。rRNA前體的加工由RNaseⅢ等負(fù)責(zé)。tRNA（三）原核生物rRNA的加工P571第44頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四1.剪切和修剪2.核苷酸的修飾（主要為核糖的甲基化，SAM作為供體）RNaseⅢ第45頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四二、真核生物RNA的轉(zhuǎn)錄后加工（一）mRNA前體加工

真核生物轉(zhuǎn)錄生成的mRNA要經(jīng)過較復(fù)雜的加工過程。包括：①5′末端加帽②3′端加尾③剪接④核苷酸編輯⑤甲基化修飾。

1.5′末端加帽

（1）帽子的種類P573第46頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四圖5-9帽子p161（1）帽子的種類第47頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（2）帽子的功能提高mRNA的穩(wěn)定性；參與識(shí)別起始密碼子；有利于mRNA從核到質(zhì)的轉(zhuǎn)移；5‘帽子結(jié)合蛋白涉及第一個(gè)內(nèi)含子剪接復(fù)合物的形成，直接影響mRNA的剪接效率（3）加帽反應(yīng)是共轉(zhuǎn)錄反應(yīng)鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶pppG5′磷酸酶ppGpi5′+pppGGpppG5′+ppiSAM甲基轉(zhuǎn)移酶第48頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四2.3′加尾加尾信號(hào)長度變化尾巴功能：增加mRNA的穩(wěn)定性；提高mRNA翻譯效率；poly（A）可影響mRNA前體最后一個(gè)內(nèi)含子的剪切，缺少poly（A）使剪接效率降低5-10倍。精確的剪切RNaseⅢ第49頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四Eukaryotepre-mRNAsoftenhaveinterveningintronsthatmustberemovedduringRNAprocessingintron=non-codingDNAsequencesbetweenexonsinagene.exon=expressedDNAsequencesinagene,codeforaminoacids.1993:RichardRoberts(NewEnglandBiolabs)&PhillipSharp(MIT)3.剪接（去除內(nèi)含子并連接外顯子）

P575第50頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四ElectronmicroscopyofanRNA-DNAhybridbetweenadenovirusDNAandthemRNAencodingthehexonprotein（P690）ModifiedfromPNAS1977,74:3171第51頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四類型Ⅰ自我剪接（廣泛，真核生物細(xì)胞器基因，低等真核生物核rRNA基因、細(xì)菌和噬菌體個(gè)別基因）類型Ⅱ自我剪接核mRNA剪接體的剪接（