基因芯片技術(shù)基因芯片檢測(cè)技術(shù)

基因芯片技術(shù)基因芯片檢測(cè)技術(shù)第1頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第3章基因芯片檢測(cè)技術(shù)內(nèi)容提要：第一節(jié)基因芯片檢測(cè)儀一、基本原理及主要組成部分二、有關(guān)檢測(cè)系統(tǒng)的重要參數(shù)及掃描過(guò)程

第二節(jié)基因芯片掃描儀簡(jiǎn)介一、激光共聚焦掃描儀二、激光非共聚焦掃描儀三、CCD基因芯片檢測(cè)儀第三節(jié)芯片圖像處理一、芯片圖像的性質(zhì)二、芯片圖像的處理三、常用的芯片圖像處理軟件第2頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四簡(jiǎn)介：熒光染料發(fā)光原理：激發(fā)光激發(fā)熒光染料，熒光染料產(chǎn)生熒光光子，熒光的強(qiáng)弱可以代表熒光化合物的含量，用光探測(cè)器檢測(cè)并確定熒光化合物的含量，從而計(jì)算出DNA或RNA的含量。生物芯片的掃描：目標(biāo)DNA（或RNA、抗原、抗體、其他受體等）與芯片上的探針?lè)磻?yīng)后，通過(guò)儀器將生物芯片上成千上萬(wàn)個(gè)點(diǎn)陣的反應(yīng)結(jié)果閱讀出來(lái)，轉(zhuǎn)變成計(jì)算機(jī)可以處理的數(shù)據(jù)的過(guò)程。第3頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四簡(jiǎn)介：根據(jù)生物芯片所使用的標(biāo)記物不同，相應(yīng)的信號(hào)檢測(cè)方法有：放射性同位素法、生物素標(biāo)記法、熒光染料標(biāo)記法等。目前基因芯片最普遍采用的標(biāo)記和檢測(cè)法是熒光法，相應(yīng)的檢測(cè)裝置主要有：激光共聚焦顯微鏡、CCD相機(jī)、激光掃描熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描儀等?；蛐酒瑱z測(cè)系統(tǒng)可以分為硬件系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)兩個(gè)部分，由于常用的基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)采用掃描的方式得到圖像，因此又稱為基因芯片掃描儀。第4頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四掃描儀第5頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)基因芯片檢測(cè)儀芯片檢測(cè)體系的硬件部分主要包括：照明光源光路系統(tǒng)光探測(cè)器機(jī)械部分A/D轉(zhuǎn)換器第6頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一、基本原理及主要組成部分

1.熒光染料與熒光光譜當(dāng)熒光化合物或者染料受到特定波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)后，會(huì)吸收激發(fā)光子，然后發(fā)射熒光光子。各種熒光化合物有各自特定的最大激發(fā)光吸收波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)。兩峰值波長(zhǎng)差值稱為斯托克斯位移(Stokesshift)。斯托克斯位移太小，激發(fā)光和發(fā)射熒光的光譜有較大部分重疊，影響對(duì)熒光強(qiáng)度的測(cè)量精度。實(shí)際中，選取斯托克斯位移較大的熒光材料。熒光強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與激發(fā)光的強(qiáng)度成正比。熒光分子受到激發(fā)后，以球狀方式發(fā)射熒光光子Cy3550-570nm20nmCy5649-670nm21nm第7頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.照明光源熒光染料激發(fā)光的光源主要包括：激光光源和非激光光源。選擇光源遵循兩個(gè)原則：一是為了提高檢測(cè)的靈敏度，需要選擇高強(qiáng)度的激發(fā)光源，以激發(fā)較多的熒光光子，二是激發(fā)光的波長(zhǎng)范圍要避免將其所激發(fā)的熒光波長(zhǎng)覆蓋。第8頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四激光光源單色性好、方向性好、能量集中、亮度高、相干性好、能產(chǎn)生強(qiáng)度較高的發(fā)射熒光，可以大大地提高檢測(cè)靈敏度。為了同時(shí)檢測(cè)多種熒光，在具體實(shí)現(xiàn)過(guò)程中，光源系統(tǒng)都設(shè)計(jì)成多波長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，通常采用多個(gè)激光器。氣體激光器，比如氦氖激光器，輸出連續(xù)光，輸出光束質(zhì)量很好，單色性好，穩(wěn)定性高，輸出光為可見(jiàn)光。半導(dǎo)體激光器，波長(zhǎng)范圍廣。體積小，質(zhì)量輕，價(jià)格便宜。第9頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四非激光光源非激光光源，波長(zhǎng)范圍比較寬。為了避免激發(fā)光對(duì)熒光的干擾，通常需要加裝濾光片來(lái)選擇與熒光最大激發(fā)波長(zhǎng)相吻合的光。要檢測(cè)多種熒光，采用多個(gè)濾光片來(lái)選擇多種特定的波長(zhǎng)。低氬汞燈和短弧氙燈。第10頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四照明方式照明區(qū)域是線和面，可以同時(shí)激發(fā)大面積的熒光，實(shí)現(xiàn)光強(qiáng)的均勻性，主要是非激光光源。激光高相干性，在較大面積上光強(qiáng)很難一致。一般激光光源為點(diǎn)照明方式，為了實(shí)現(xiàn)大面積成像，必須通過(guò)掃描來(lái)實(shí)現(xiàn)。第11頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3光探測(cè)器光探測(cè)器是基因芯片掃描儀檢測(cè)系統(tǒng)的核心器件，其主要用途是探測(cè)熒光光子，并把熒光光子的光信號(hào)轉(zhuǎn)變成模擬的電信號(hào)。目前基因芯片掃描儀所選用的光探測(cè)器件各不相同，主要有基于用PMT（photomultipliertube，光電倍增管）和CCD（charge-coupleddevices，電荷偶合器件）作為感光器件的兩種。第12頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四光電倍增管（PMT）將光輻射變成電子流光陰極：執(zhí)行光電變換倍增級(jí)：執(zhí)行電子的倍增放大陽(yáng)極：收集電子流第13頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四光電倍增管（PMT）增益依賴于光電倍增管內(nèi)部光陰極的數(shù)量和加在光電倍增管上的電壓，光陰極的數(shù)量多、電壓高則增益大。電子數(shù)目可增加到108芯片掃描儀用光電倍增管的選擇應(yīng)考慮下列兩個(gè)因素。一是由于不同的光陰極模式對(duì)不同的波長(zhǎng)的光的靈敏度不一樣，因此應(yīng)選擇對(duì)被測(cè)熒光波長(zhǎng)靈敏度高的光電倍增管；而是應(yīng)選擇耐用的高信噪比的光電倍增管。第14頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PMT的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)PMT的優(yōu)點(diǎn)：光電倍增管在可見(jiàn)光波范圍內(nèi)是最靈敏的探測(cè)器，通過(guò)改變電壓可以很方便地改變光電倍增管的靈敏度；一般用激光作為激發(fā)光源，能激發(fā)出較強(qiáng)的熒光，增加靈敏度；通過(guò)點(diǎn)成像探測(cè)并結(jié)合高速XY軸掃描而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物芯片進(jìn)行掃讀，均一性好；可以與共聚焦系統(tǒng)相兼容以降低背景噪聲。

PMT的缺點(diǎn)：由于采用點(diǎn)成像探測(cè)及XY軸掃描，成像速度較慢，一般需要10分鐘以上；雖然激光光源使用壽命可以達(dá)到幾千小時(shí)以上，但光源隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)而老化，其強(qiáng)度逐漸減弱，導(dǎo)致靈敏度隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。

第15頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四CCD的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)CCD的優(yōu)點(diǎn)：CCD一次可成像很大面積的區(qū)域，激發(fā)光源多采用氙燈或高壓汞燈等高亮度光源，在單一光源下可通過(guò)更換濾光片的方式來(lái)滿足激發(fā)不同熒光的需要；由于CCD芯片掃描儀時(shí)能同時(shí)對(duì)整張芯片表面信號(hào)進(jìn)行讀取，不需要X-Y二維移動(dòng)平臺(tái)，大大提高了獲取熒光圖像的速度，使得這種掃描速度相對(duì)比PMT激光掃描儀要快，一般僅需要0.5-2分鐘。缺點(diǎn)：樣品點(diǎn)受到的激發(fā)光可能不夠均勻一致，從而引入測(cè)量誤差；CCD對(duì)微弱信號(hào)的放大功能不及光電倍增管，因而需要額外的放大系統(tǒng)來(lái)將信號(hào)放大才能達(dá)到光電倍增管的靈敏度范圍的上限。第16頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四4.光路系統(tǒng)光收集：熒光收集多采用光學(xué)透鏡系統(tǒng)，透鏡收集光的立體角的大小直接影響系統(tǒng)的效率。透鏡收集光的效率以數(shù)碼孔徑（NA）表示。NA為1.0，表明透鏡收集了整個(gè)半球面的光，相對(duì)應(yīng)的光收集效率為50％。多數(shù)共聚焦激光微陣列掃描儀物鏡的NA為0.5～0.9，而絕大多數(shù)CCD陣列掃描儀的NA為0.2～0.5。激發(fā)/發(fā)射光的識(shí)別和分離：由于熒光發(fā)射強(qiáng)度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于激發(fā)光強(qiáng)度，因此要從激發(fā)光中檢測(cè)出微弱的熒光信號(hào)，就需要對(duì)這兩種類型的光進(jìn)行分離。

第17頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四激發(fā)/發(fā)射光的識(shí)別和分離

幾何分離：根據(jù)激發(fā)光和熒光光路的幾何關(guān)系進(jìn)行分離。一種方式用一個(gè)很小的反光鏡將激發(fā)光束反射，而讓環(huán)形部分的熒光光束通過(guò)；另一種方式是激發(fā)光束和系統(tǒng)光路不同軸，在成像過(guò)程中，激發(fā)光束所成的像和熒光光束所成的像會(huì)發(fā)生分離，從而過(guò)濾掉激發(fā)光束。

波長(zhǎng)分離：根據(jù)激發(fā)光和熒光的波長(zhǎng)差異進(jìn)行分離。根據(jù)激發(fā)光波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)不完全重合的事實(shí)，用濾光片將其分離。

第18頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四激發(fā)光的入射角度芯片不平整，芯片表面的灰塵，片基不均勻，環(huán)境中的塵粒都會(huì)引起光的強(qiáng)烈散射，產(chǎn)生散射光，另外入射光照在芯片上也產(chǎn)生反射光。但干涉濾光片不能完全濾除散射光與反射光。檢測(cè)角度確定時(shí)，雜質(zhì)微粒引起的散射光的強(qiáng)度與入射光角度有關(guān)。入射光與檢測(cè)角成0度時(shí)最強(qiáng)，90度時(shí)最弱。但生物芯片掃描儀難以實(shí)現(xiàn)與入射光成90度的檢測(cè)，因?yàn)闊晒鈾z測(cè)必須在芯片的正上方，與芯片垂直，以保證最大的采光量并避免芯片熒光圖像的失真。入射光與檢測(cè)成0度是激光系統(tǒng)芯片掃描儀常采用的方式。CCD系統(tǒng)芯片掃描儀及部分激光系統(tǒng)掃描儀多采用入射光與檢測(cè)成45度或135度的方式。第19頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第20頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第21頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第22頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四5.其他器件A／D轉(zhuǎn)換器：將PMT或CCD收集的模擬的電信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字圖像信號(hào)。載片臺(tái)：固定和放置微陣列固相基質(zhì)的裝置，多芯片數(shù)掃描儀載片臺(tái)的大小只能適合標(biāo)準(zhǔn)顯微載玻片。機(jī)械傳動(dòng)裝置：生物芯片檢測(cè)儀根據(jù)相對(duì)激光器及探測(cè)器是否移動(dòng)分為掃描檢測(cè)和固定檢測(cè)。CCD檢測(cè)儀大多采用固定檢測(cè)，PMT掃描儀則是以單束固定波長(zhǎng)的激光來(lái)掃描，因此需要激光頭或載片臺(tái)的機(jī)械運(yùn)動(dòng)來(lái)使激光掃到整個(gè)面積。絕大部分激光共聚焦生物芯片掃描儀采用了載片臺(tái)移動(dòng)的檢測(cè)方法，即將激光器及光探測(cè)器固定，生物芯片置于載片臺(tái)并隨著載片臺(tái)在X方向正反線掃描和Y方向步進(jìn)向前運(yùn)動(dòng)。第23頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四二、有關(guān)檢測(cè)系統(tǒng)的重要參數(shù)

1.信噪比：熒光信號(hào)的峰值除以信號(hào)的變異。信噪比太低，則表示信號(hào)有較大的變異，所得到的結(jié)果就不能反映實(shí)際的信號(hào)值。暗電流噪聲：沒(méi)有光輸入時(shí)的噪聲。暗電流主要是由器件的缺陷和熱力學(xué)導(dǎo)致的量子漲落引起，因此降低系統(tǒng)溫度，可有效地降低暗電流的量值。發(fā)射噪聲：光輸入過(guò)程中產(chǎn)生的噪聲。越多的光子導(dǎo)致越多的光子數(shù)量的變異，因此，發(fā)射噪聲的絕對(duì)數(shù)量隨著信號(hào)的增加而增加。直接來(lái)自于器件的物理性質(zhì)，因此很難避免。此外，基因芯片也會(huì)引入噪聲，如基因芯片基片玻璃質(zhì)地或空氣中灰塵的熒光本底干擾，基因芯片基片與標(biāo)記樣本之間的非特異雜交等，都會(huì)引入一定的熒光噪聲。

第24頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.光漂白現(xiàn)象

光漂白是指熒光染料分子在激發(fā)光的照射下，其產(chǎn)生熒光的強(qiáng)度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸變?nèi)跸У倪^(guò)程。幾乎所有的熒光染料都存在這種光漂白現(xiàn)象,光漂白的程度隨光照強(qiáng)度的增加和照射時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。激光系統(tǒng)掃描儀中，聚焦后的激光束直徑較小，一般在5～10μm，光強(qiáng)較大，因此光漂白的作用較強(qiáng)。CCD系統(tǒng)雖然激發(fā)光較弱，但CCD掃描時(shí)通常采用長(zhǎng)時(shí)間曝光方式，因此也同樣存在光漂白現(xiàn)象。第25頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四在生物芯片掃描中，通常一次掃描產(chǎn)生的光漂白并不顯著，可以忽略，但是多次重復(fù)掃描產(chǎn)生的光漂白必須考慮。Cy3多次掃描測(cè)定，平均每掃描一次，熒光強(qiáng)度下降0.7%?？梢?jiàn)光漂的作用還是比較強(qiáng)的。第26頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.靈敏度與動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍

靈敏度是指掃描儀測(cè)定最微弱熒光的能力。通常用每平方微米能測(cè)定的熒光分子數(shù)來(lái)表示靈敏度。目前商業(yè)生物芯片掃描儀的靈敏度可達(dá)0.1～1熒光分子/μm2。動(dòng)態(tài)范圍是指儀器能夠響應(yīng)超過(guò)噪音水平的信號(hào)強(qiáng)度的范圍。第27頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.靈敏度與動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍

儀器的動(dòng)態(tài)范圍是儀器所有組件共同作用的結(jié)果，影響信號(hào)的動(dòng)態(tài)范圍的因素很多，主要由熒光的物理特性、CCD的動(dòng)態(tài)工作范圍和A／D轉(zhuǎn)換器的動(dòng)態(tài)范圍等因素決定。對(duì)于激光系統(tǒng)，其動(dòng)態(tài)范圍可達(dá)16位（bit），即216(即65536)灰度值（96分貝）。對(duì)于CCD系統(tǒng)，由于不同器件的噪聲強(qiáng)度差別很大，一般動(dòng)態(tài)范圍為12～16位，即212~16（4096-65536）灰度值（72分貝-96分貝）。第28頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四靈敏度范圍很重要

雖然通常掃描儀的灰度值在0-65535之間，有很大的動(dòng)態(tài)范圍，但調(diào)節(jié)儀器的靈敏度范圍對(duì)于基因芯片來(lái)講仍是很重要的。第一，在不同的樣本之間，由于樣本RNA的質(zhì)量、標(biāo)記效率和雜交效率等原因，使不同樣本之間的熒光強(qiáng)度變化很大；第二，在同一樣本內(nèi)部，不同的基因表達(dá)豐度相差極大，高豐度的mRNA可以占mRNA中1％的豐度，而一些微量表達(dá)的基因只占mRNA中百萬(wàn)分之一以下的豐度。第29頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四靈敏度范圍很重要

如果掃描儀的靈敏度范圍設(shè)置不當(dāng)，會(huì)出現(xiàn)兩種情況：第一，掃描強(qiáng)度太弱，總體信號(hào)太弱，弱信號(hào)點(diǎn)（無(wú)效點(diǎn)）比例太高，對(duì)于大量的低豐度表達(dá)基因無(wú)法測(cè)出；第二，掃描強(qiáng)度太大，總體信號(hào)太強(qiáng)，導(dǎo)致大量的點(diǎn)信號(hào)達(dá)到飽和，飽和點(diǎn)的信號(hào)會(huì)導(dǎo)致兩種熒光信號(hào)比值壓縮，無(wú)法分析差異表達(dá)基因，另外，大強(qiáng)度掃描還會(huì)導(dǎo)致高背景及激光管迅速老化。第30頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四調(diào)整儀器靈敏度范圍的方法

其一是改變激發(fā)光的強(qiáng)度，如用激光衰減器可調(diào)整改變激發(fā)光的強(qiáng)度其可調(diào)范圍至少為100：1其二是改變光探測(cè)器的靈敏度，如果PMT掃描儀，則改變光電倍增管的靈敏度，通過(guò)變化輸入電壓的大小，光電倍增管的靈敏度改變范圍至少為100：1對(duì)于CCD檢測(cè)系統(tǒng)，改變鏡頭的數(shù)字光圈可以提高采光效率，從而改變檢測(cè)靈敏度。

第31頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四4.像素與分辨率

像素是構(gòu)成圖像的最小單元，即圖像上不同顏色或灰度的點(diǎn)，這些點(diǎn)組合起來(lái)形成一幅完整的圖像。在CCD上為CCD的最小感光單元，其大小通常在幾個(gè)微米到十幾個(gè)微米，通過(guò)成像公式可換算成檢測(cè)芯片上對(duì)應(yīng)區(qū)域的大小。對(duì)于激光系統(tǒng)，像素的大小為激光光斑的尺寸，可以通過(guò)改變光斑直徑來(lái)改變像素的大小。分辨率是指能夠區(qū)分的最近兩個(gè)點(diǎn)的最小距離。像素的大小決定了分辨率的高低，像素越大，分辨率越高，分辨率越高則圖像越清晰，定量的準(zhǔn)確度就越高，可以提供更精細(xì)的具有統(tǒng)計(jì)意義的數(shù)據(jù)。第32頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四像素與分辨率激光系統(tǒng)掃描儀的分辨率主要是由激光的聚焦直徑?jīng)Q定的，分辨率一般為5～10μｍ。CCD系統(tǒng)掃描儀的分辨率主要決定于CCD像素的數(shù)目，一次成像型CCD掃描儀的分辨率一般為大于或等于20μm，多次掃描拼接成像型則可達(dá)2.5μm。第33頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)掃描儀簡(jiǎn)介控制和自動(dòng)化系統(tǒng)是由電腦來(lái)完成的。圖形化的操作界面使得初學(xué)者只需接受簡(jiǎn)單的訓(xùn)練或閱讀操作手冊(cè)就能夠使用儀器，因此掃描儀使用者并不需要精通掃描儀的光學(xué)和電子學(xué)部分的原理控制軟件具有許多自動(dòng)設(shè)置功能，如不同的用戶掃描不同樣品可設(shè)置、保存、再現(xiàn)掃描參數(shù)；可自動(dòng)設(shè)定2個(gè)以上的掃描激光波長(zhǎng)并自動(dòng)保存圖像結(jié)果；對(duì)某一掃描波段自動(dòng)調(diào)整靈敏度、激發(fā)光強(qiáng)度及探測(cè)器探測(cè)范圍等。第34頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四商品化生物芯片掃描儀

激光共聚焦掃描儀

—ScanArray系列、SureScan芯片掃描儀、DNAscope?

系列。激光非共聚焦掃描儀

—GenePix系列CCD基因芯片檢測(cè)儀

—AlphaArrayTM

基因芯片掃描分析系統(tǒng)、GeneTAC掃描儀、SpotWare基因芯片掃描儀、ArrayWoRx“e”掃描儀國(guó)產(chǎn)掃描儀

—成都中科百奧科技有限公司SCAN-1、北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司EcoSCANTM-100

第35頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四掃描過(guò)程應(yīng)注意的問(wèn)題由于芯片掃描儀有極高的靈敏度和分辨率，芯片上很小的塵?；螂s質(zhì)污染都會(huì)引起非常明亮的背景和噪音，因此在芯片的制作，雜交和清洗過(guò)程中都應(yīng)在潔凈的環(huán)境中進(jìn)行，最好在潔凈臺(tái)或者潔凈間操作，并注意防靜電。芯片完成雜交和清洗后應(yīng)盡可能立即掃描測(cè)定，防止熒光標(biāo)記靶分子降解。雜交后的芯片應(yīng)避免長(zhǎng)期暴露在強(qiáng)光下，因而導(dǎo)致光漂白，影響測(cè)定結(jié)果。芯片掃描中由于有機(jī)械傳動(dòng)裝置，因此儀器應(yīng)放置在平穩(wěn)堅(jiān)固的平臺(tái)上，并注意防止外源性震動(dòng)。第36頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一、芯片圖像的性狀

灰度圖最原始的圖譜是黑白的，顯現(xiàn)的是灰度值，一般掃描儀所得到的圖譜為16位的Tif、Jpeg、Raw等格式的圖像（也有些掃描儀能得到更高的24位的圖像）第三節(jié)芯片圖像處理每個(gè)像素的灰度值在0-65535之間的范圍內(nèi)，每個(gè)灰度值都反應(yīng)了圖像所對(duì)應(yīng)芯片位置的熒光分子相對(duì)強(qiáng)度信息。第37頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四偽彩圖在掃描儀配套的掃描軟件中一般都內(nèi)建有能將原始的灰度圖改為偽彩圖的功能。由于肉眼對(duì)區(qū)分同種顏色的不同強(qiáng)度（灰度）并不敏感，因此就人為的將灰度值根據(jù)其數(shù)值大小轉(zhuǎn)化成不同顏色，以便于肉眼觀察掃描圖譜時(shí)便能一目了然的區(qū)分出同一張芯片上各種基因的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)弱。

第38頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四疊加圖對(duì)于基因表達(dá)譜芯片，為了便于掃描完畢就能大致判斷芯片中是否有上調(diào)或下調(diào)的差異基因，有些掃描或分析軟件中還提供疊加圖的功能。它是將同一張芯片所對(duì)應(yīng)的兩種不同雜交樣本掃描所得圖譜分別轉(zhuǎn)變成綠色和紅色的圖譜。一般對(duì)照樣本（通常用Cy3標(biāo)記）被轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，而實(shí)驗(yàn)樣本（通常用Cy5標(biāo)記）被轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。當(dāng)兩張圖譜疊加在一起時(shí)，每個(gè)基因點(diǎn)的最終色彩由兩種顏色的比率而決定。第39頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四如果點(diǎn)的顏色為紅色，說(shuō)明該基因在實(shí)驗(yàn)樣本中的表達(dá)量比對(duì)照樣本中的表達(dá)量高，該基因?yàn)樯险{(diào)基因；如果最終基因點(diǎn)的顏色為綠色，則該基因在實(shí)驗(yàn)樣本中的表達(dá)量比對(duì)照樣本中的表達(dá)量低，該基因?yàn)橄抡{(diào)基因；如果最終基因點(diǎn)的顏色為黃色，該基因沒(méi)有顯著變化。第40頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第41頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四多Block的芯片芯片圖像上的點(diǎn)象格子一樣排列。有些芯片的圖像還包括幾個(gè)部分，每個(gè)部分含有相同行和相同列的點(diǎn)的子格，并且每個(gè)子格之間的距離大概相等，所有的子格合在一起就是一整張芯片。第42頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四理想的芯片圖像1）所有子格大小相同。2）子格之間距離相等。3）子格中行和列之間的距離相等。4）點(diǎn)中心的位置應(yīng)在行線和列線的交點(diǎn)處。5）點(diǎn)的形狀是個(gè)圓，并且所有圓的大小相同。6）片子上沒(méi)有灰塵或者其他污染。7）圖像背景均一而且值很小。實(shí)際情況和這種理想情況往往有很大偏離。

第43頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四實(shí)際的偏離點(diǎn)位置偏移：原因在于芯片生產(chǎn)過(guò)程中的機(jī)械方面。每個(gè)點(diǎn)之間的間隔可能會(huì)不一致。另外還有機(jī)器人系統(tǒng)，點(diǎn)樣儀器的不精確和放置片子的托盤(pán)的穩(wěn)定性不好，還有一些點(diǎn)位置不易確定。點(diǎn)大小和形狀不規(guī)則：點(diǎn)樣時(shí)DNA溶液的液滴大小不同，導(dǎo)致點(diǎn)的大小也不同。另外，液滴中DNA濃度和鹽的濃度不同，點(diǎn)的形狀可能與圓相差很大。在一個(gè)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的圓內(nèi)，各處DNA密度也不盡相同。污染：灰塵的污染，樣品中核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞和組織碎片的污染，掃描得到的圖像有的并不“干凈”，存在較大的雜質(zhì)亮點(diǎn)或者部分區(qū)域的污染。全局性的因素：片子本身的不均勻性，芯片表面烘干時(shí)的不均勻以及芯片掃描儀本身存在的系統(tǒng)噪音第44頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ArrayGene軟件圖像處理第45頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第46頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第47頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第48頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第49頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第50頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第51頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第52頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四二、芯片圖像的處理

樣點(diǎn)的識(shí)別和位置的確定確定樣點(diǎn)的大概位置通常的做法是根據(jù)芯片陣列的行和列的數(shù)目(一般會(huì)由芯片制造者事先給定)，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)生成一個(gè)網(wǎng)格（gridding），每個(gè)格對(duì)應(yīng)一個(gè)樣點(diǎn)，這個(gè)網(wǎng)格為每個(gè)點(diǎn)提供了一個(gè)相對(duì)位置的坐標(biāo)。其次還要對(duì)網(wǎng)格進(jìn)行定位，確定網(wǎng)格在圖像上的位置。在網(wǎng)格生成之后，還得對(duì)樣點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別。有的圖像處理軟件在網(wǎng)格交點(diǎn)出設(shè)計(jì)一個(gè)圓，每個(gè)圓套住一個(gè)樣點(diǎn)。有的設(shè)計(jì)成方格形，然后在方格內(nèi)再產(chǎn)生一個(gè)圓，每個(gè)圓套住一個(gè)樣點(diǎn)。實(shí)際上芯片樣點(diǎn)的大小并不一致，因此有些軟件會(huì)根據(jù)特定的計(jì)算方法逐步調(diào)節(jié)圓的位置和大小，使圓正好能套住樣點(diǎn)。第53頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第54頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四樣點(diǎn)的識(shí)別和位置的確定整個(gè)芯片圖像可能是由好幾個(gè)塊組成，各個(gè)子塊的位置可能還需要微調(diào)。有時(shí)候片子中圖像有些歪斜，而計(jì)算機(jī)生成的網(wǎng)格是橫平豎直的，需要將片子旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)的角度也是一個(gè)重要參數(shù)。第55頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四手動(dòng)定位：網(wǎng)格生成步驟中，用戶可以手動(dòng)將格子框架放到圖像中，并可以調(diào)整網(wǎng)格，使之與樣點(diǎn)能盡量對(duì)齊。由于圖像中的點(diǎn)的間隔并不均一，用戶可能要逐條調(diào)整網(wǎng)格線，使之與點(diǎn)對(duì)齊。一個(gè)芯片圖像有成千上萬(wàn)個(gè)樣點(diǎn)，手動(dòng)定位非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力；對(duì)樣點(diǎn)間隔不均一的片子和樣點(diǎn)大小差別很大的片子，人為的錯(cuò)誤會(huì)帶來(lái)很大的誤差。第56頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四半自動(dòng)定位：

用戶可能需要將格子覆蓋在圖上，調(diào)整格子大小，使之與點(diǎn)的位置大致匹配，或者需要告訴程序圖像中格子的四個(gè)角。算法就能自動(dòng)的調(diào)整格子線，和各個(gè)點(diǎn)，從而來(lái)定位樣點(diǎn)節(jié)省時(shí)間；即便信號(hào)強(qiáng)度很弱，也能識(shí)別出來(lái)。在點(diǎn)之間間隔不均一的情況下也能很好的識(shí)別信號(hào)點(diǎn)；能正確識(shí)別真正信號(hào)點(diǎn)旁邊的污染物第57頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四自動(dòng)定位

圖像處理的最終目的：建立一個(gè)完全自動(dòng)的方法，能利用成熟的計(jì)算機(jī)圖像識(shí)別算法，在不需要任何人工干預(yù)的情況下識(shí)別信號(hào)點(diǎn)。BioDiscovery公司已經(jīng)發(fā)展了一個(gè)AutoGene工具。這個(gè)工具只需要用戶事先定好片子的一些參數(shù)（就是，行和列的數(shù)目），它將自動(dòng)的在圖像中找到正確的網(wǎng)格位置。極大的減少人工干預(yù)，最大限度的減少由于人工參與而帶來(lái)的誤差，保證了數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

第58頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.圖像的分割(Segmentation)

計(jì)算機(jī)可視化術(shù)語(yǔ)。指確定屬于前景（信號(hào)）（foreground）和背景（background）的像素在信號(hào)點(diǎn)定位之后，點(diǎn)和點(diǎn)周圍的一部分區(qū)域內(nèi)的像素就用來(lái)計(jì)算背景和前景強(qiáng)度。方法（按照像素的信息）可以分為三類：基于像素空間位置的分割；基于像素強(qiáng)度的分割；綜合像素強(qiáng)度和空間信息的分割。SignalBackground第59頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基于像素空間位置的分割利用信號(hào)點(diǎn)定位結(jié)果的空間信息來(lái)分開(kāi)屬于信號(hào)的像素和屬于背景的像素。相應(yīng)位置上的圓將信號(hào)和背景分開(kāi)。圓內(nèi)的像素是信號(hào)，而圓外則是背景。這種方法已經(jīng)被許多圖像分析工具所采用，適合快速且粗略的分析圖像數(shù)據(jù)。但是，在許多芯片圖像中點(diǎn)的大小和形狀都是不規(guī)則的，而且污染也大量存在，這種情況下，用這種方法分割會(huì)帶來(lái)很大的誤差，不能保證足夠的準(zhǔn)確性。第60頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四按照信號(hào)點(diǎn)幾何形狀的三種分割方法固定圓分割可調(diào)圓分割FixedcircleScanAlyze,GenePix,QuantArrayAdaptivecircleGenePix,DappleAdaptiveshapeSpot,regiongrowingandwatershedHistogrammethodImaGene,QuantArraymDeArrayandadaptivethresholding可調(diào)形狀分割第61頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基于像素強(qiáng)度的分割

所有像素按強(qiáng)度由小到大排列。假如不存在污染的話，強(qiáng)度值大的就認(rèn)為是信號(hào)點(diǎn)像素。柱狀圖法：用一個(gè)框架（mask）包含相應(yīng)點(diǎn)，在框架內(nèi)的像素強(qiáng)度就形成一個(gè)柱狀圖。當(dāng)像素強(qiáng)度值大于一個(gè)閾值的時(shí)候，這些像素就可以認(rèn)為是前景值，反之，則認(rèn)為是背景值。簡(jiǎn)單而且速度快得到的前景像素往往不相連，對(duì)于噪音大的點(diǎn)和弱信號(hào)點(diǎn)這種方法不適合BkgdForegroundBackground:meanbetween5thand20thpercentileForeground:meanbetween80thand95thpercentile第62頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四綜合像素強(qiáng)度和空間信息的分割

在信號(hào)點(diǎn)位置畫(huà)一個(gè)大小適合的圓，圓內(nèi)的像素暫時(shí)先認(rèn)為是信號(hào)，圓外認(rèn)為是背景。計(jì)算兩個(gè)區(qū)域中像素強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)上的差異，并進(jìn)行比較來(lái)分割出信號(hào)。Mann-Whitney檢驗(yàn)法和修剪法。第63頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Mann-Whitney檢驗(yàn)法

根據(jù)背景像素的統(tǒng)計(jì)性質(zhì)來(lái)確定在圓內(nèi)哪些像素是信號(hào)，Mann-Whitney檢驗(yàn)法用來(lái)確定強(qiáng)度水平的閾值。圓內(nèi)像素的強(qiáng)度超過(guò)這個(gè)閾值就認(rèn)為是信號(hào)。圓內(nèi)存在污染的時(shí)候，這些污染的像素也會(huì)被認(rèn)為是信號(hào)。假如在圓外有污染的像素或者點(diǎn)的位置沒(méi)有準(zhǔn)確地確定以至于一些信號(hào)的像素在圓外面，這些高亮度的像素會(huì)提高閾值水平，在圓內(nèi)的一些強(qiáng)度低的信號(hào)像素也會(huì)被歸類成背景像素。處理噪聲大的片子和弱信號(hào)點(diǎn)時(shí)候，效果不是很好。

第64頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期四修剪（trimmedoff）法

由于信號(hào)點(diǎn)的不規(guī)則，在圓外可能有一些像素是信號(hào)，在圓內(nèi)也有一些像素是背景。污染的像素也是誤差點(diǎn)。為了消除這些誤差點(diǎn)的影響，可以簡(jiǎn)單地修剪掉（trimoff）一部分信號(hào)和背景像素。圓內(nèi)像素強(qiáng)度分布函數(shù)的高端一定百分比的像素，由于這些像素很可能是污染，被修剪了；而低端一定百分比像素，由于這些像素很可能是背景，也被修剪掉了。這個(gè)方法的最大優(yōu)勢(shì)是能去除誤差點(diǎn)的影響，但是準(zhǔn)確度可能會(huì)下降，因?yàn)橛捎谛藜?，喪失了點(diǎn)的集合信息