基因工程的基本操作程序四班

基因工程的基本操作程序現(xiàn)在是1頁\一共有52頁\編輯于星期三基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定現(xiàn)在是2頁\一共有52頁\編輯于星期三目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等?；虿僮鞯幕静襟E一、目的基因的獲取——將需要的基因從供體生物

的細(xì)胞內(nèi)提取出來。供體生物細(xì)胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶現(xiàn)在是3頁\一共有52頁\編輯于星期三原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游有啟動子，下游有終止子啟動子現(xiàn)在是4頁\一共有52頁\編輯于星期三真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子現(xiàn)在是5頁\一共有52頁\編輯于星期三原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼現(xiàn)在是6頁\一共有52頁\編輯于星期三1．下列關(guān)于基因結(jié)構(gòu)的認(rèn)識中，正確的是（）A．大豆基因中內(nèi)含子是能夠編碼蛋白質(zhì)的序列B．乳酸菌與酵母菌基因結(jié)構(gòu)中都存在外顯子和內(nèi)含子C．大腸桿菌基因與RNA聚合酶結(jié)合位點位于編碼區(qū)的下游D．水稻細(xì)胞基因的編碼區(qū)中存在非編碼序列2．（多選）原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)的共同特點是（）A．編碼區(qū)都有能編碼蛋白質(zhì)的序列B．編碼區(qū)都是連續(xù)的C．非編碼區(qū)都能調(diào)控遺傳信息的表達(dá)D．非編碼區(qū)都有RNA聚合酶結(jié)合的位點DACD現(xiàn)在是7頁\一共有52頁\編輯于星期三一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是______________________編碼蛋白質(zhì)的基因（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴增3、人工合成閱讀教材P8-11如：與生物抗逆性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、與工業(yè)用酶相關(guān)的基因等也可以是具調(diào)控作用的因子等。現(xiàn)在是8頁\一共有52頁\編輯于星期三(1)從基因文庫中獲取目的基因什么是基因文庫？什么是基因組文庫？什么是部分基因文庫？怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？目的基因的有關(guān)信息與什么相聯(lián)系？現(xiàn)在是9頁\一共有52頁\編輯于星期三概念：基因文庫（genelibrary）基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)現(xiàn)在是10頁\一共有52頁\編輯于星期三基因組文庫:

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.部分基因文庫:

基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.現(xiàn)在是11頁\一共有52頁\編輯于星期三基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系現(xiàn)在是12頁\一共有52頁\編輯于星期三提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接重組載體基因組文庫導(dǎo)入受體菌中儲存（2）.基因文庫的構(gòu)建方法①基因組文庫的構(gòu)建現(xiàn)在是13頁\一共有52頁\編輯于星期三思考：基因文庫如何構(gòu)建？

如果用某種生物發(fā)育的某個時期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補DNA（也叫cDNA）片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，那么，這個受體菌群體就構(gòu)成了這種生物的cDNA文庫。這種方法稱——反轉(zhuǎn)錄法現(xiàn)在是14頁\一共有52頁\編輯于星期三提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶導(dǎo)入受體菌中儲存②

cDNA文庫的構(gòu)建-----逆轉(zhuǎn)錄法：

現(xiàn)在是15頁\一共有52頁\編輯于星期三mRNARNA－DNA雜合雙鏈單鏈DNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄（cDNA）DNA聚合酶現(xiàn)在是16頁\一共有52頁\編輯于星期三真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？有哪些差異？原核生物基因呢？思考？現(xiàn)在是17頁\一共有52頁\編輯于星期三基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較現(xiàn)在是18頁\一共有52頁\編輯于星期三基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較現(xiàn)在是19頁\一共有52頁\編輯于星期三依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性（4）從基因文庫中得到目的基因的方法——直接分離法(鳥槍法)現(xiàn)在是20頁\一共有52頁\編輯于星期三1、構(gòu)建基因組DNA文庫時，首先應(yīng)分離細(xì)胞的A、染色體DNA

B、線粒體DNAC、總mRNA

D、tRNA2、目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關(guān)基因文庫的描述正確的是A、某生物的全套基因就是一個基因文庫B、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導(dǎo)入某個生物體內(nèi)，則這個生物就是一個基因文庫C、含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫AC現(xiàn)在是21頁\一共有52頁\編輯于星期三（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因?，F(xiàn)在是22頁\一共有52頁\編輯于星期三PCR技術(shù)原理：前提：原料方式PCR擴增儀DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；TaqDNA聚合酶；離子現(xiàn)在是23頁\一共有52頁\編輯于星期三

過程變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結(jié)合延伸：加熱至70～75℃以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈變性退火延伸現(xiàn)在是24頁\一共有52頁\編輯于星期三1、在遺傳工程中，若有一個控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTG／TACAC，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術(shù)進(jìn)行人工復(fù)制，復(fù)制時應(yīng)給予的條件是①雙鏈DNA分子為模板②ATGTG或TACAC模板鏈③四種脫氧核苷酸④四種核苷酸⑤DNA聚合酶⑥熱穩(wěn)定DNA聚合酶⑦引物⑧溫度變化⑨恒溫A．①③④⑦⑨B．①④⑥⑦⑧C．②⑤⑥⑦⑨D．①③⑥⑦⑧D2、在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個脫氧核苷酸對，其中腺嘌呤脫氧核苷酸是460個）放入DNA擴增儀中擴增4代，那么，在擴增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數(shù)是A.540個 B.8100個 C.17280個 D.7560個B現(xiàn)在是25頁\一共有52頁\編輯于星期三（3）人工合成——根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成現(xiàn)在是26頁\一共有52頁\編輯于星期三1、在已知序列信息的情況下，獲取目的基因的最方便方法是A、化學(xué)合成法

B、基因組文庫法C、cDNA文庫法

D、聚合酶鏈反應(yīng)2、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是①從基因文庫中獲取目的基因②利用PCR技術(shù)擴增目的基因③反轉(zhuǎn)錄法④通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③AD現(xiàn)在是27頁\一共有52頁\編輯于星期三3、目的基因主要是指_______________的結(jié)構(gòu)基因。獲得目的基因的常見方法有三種：（1）從基因文庫中獲取目的基因，根據(jù)基因的_________序列，基因在________上的位置，基因的________產(chǎn)物mRNA，基因的_______產(chǎn)物蛋白質(zhì)等獲取目的基因。（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因，該技術(shù)是一項在________完成的核酸合成技術(shù)，前提條件是有一段已知目的基因的________序列，以便于合成_________。（3）如果基因較小且核苷酸序列已知，可以通過____________方法。編碼蛋白質(zhì)核苷酸染色體轉(zhuǎn)錄表達(dá)體外核苷酸引物人工合成現(xiàn)在是28頁\一共有52頁\編輯于星期三二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。（2）用___________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1.過程:現(xiàn)在是29頁\一共有52頁\編輯于星期三質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶表達(dá)載體同種1.過程:現(xiàn)在是30頁\一共有52頁\編輯于星期三2、基因表達(dá)載體的作用a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代b、同時使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？現(xiàn)在是31頁\一共有52頁\編輯于星期三不可以。因為目的基因在表達(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強子等；（5）有時需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。現(xiàn)在是32頁\一共有52頁\編輯于星期三3.基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標(biāo)記基因位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞現(xiàn)在是33頁\一共有52頁\編輯于星期三1、（多選）一個基因表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)包括A．目的基因B．啟動子C．終止子D．標(biāo)記基因ABCD2、下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述不正確的是A．啟動子是與RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，是起始密碼B．啟動子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C．標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否有目的基因從而便于篩選D．基因表達(dá)載體的構(gòu)建視受體細(xì)胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別A3、目前轉(zhuǎn)基因工程可以A.打破地理隔離但不能突破生殖隔離B.打破生殖隔離但不能突破地理隔離C.完全突破地理隔離和生殖隔離D.部分突破地理隔離和生殖隔離C現(xiàn)在是34頁\一共有52頁\編輯于星期三常用的受體細(xì)胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞吸附、注入、合成、裝配、釋放現(xiàn)在是35頁\一共有52頁\編輯于星期三1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點:能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌現(xiàn)在是36頁\一共有52頁\編輯于星期三（2）基因槍法

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。現(xiàn)在是37頁\一共有52頁\編輯于星期三（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。現(xiàn)在是38頁\一共有52頁\編輯于星期三2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞方法:顯微注射技術(shù)操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動物現(xiàn)在是39頁\一共有52頁\編輯于星期三3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA現(xiàn)在是40頁\一共有52頁\編輯于星期三1、基因工程中科學(xué)家常用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，原因是A．結(jié)構(gòu)簡單、操作方便B．繁殖速度快C．遺傳物質(zhì)含量少、簡單D．性狀穩(wěn)定、變異少2、基因工程常用的受體細(xì)胞有①大腸桿菌②枯草桿菌③支原體④動植物細(xì)胞A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④BD3、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計施工的，在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補配對的步驟是A.人工合成基因B.目的基因與運載體結(jié)合C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D.目的基因的檢測和表達(dá)C現(xiàn)在是41頁\一共有52頁\編輯于星期三4.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是①將毒素蛋白質(zhì)注射到棉受精卵中②將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中③將編碼毒素蛋白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵中④將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)A．①②B．②③C．③④D．①④C5.下列屬于基因工程中導(dǎo)入目的基因方法的是①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法②基因槍法③花粉管道法④顯微注射法⑤胚胎移植⑥D(zhuǎn)NA分子雜交法A．①②③④⑤⑥B．①②③④⑤C．①②③④D．①③④⑤⑥C現(xiàn)在是42頁\一共有52頁\編輯于星期三(四)目的基因的檢測與鑒定檢測①導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞方法——DNA分子雜交②表達(dá)檢測轉(zhuǎn)錄檢測——分子雜交翻譯檢測——抗原抗體雜交分子檢測法鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等個體水平的鑒定現(xiàn)在是43頁\一共有52頁\編輯于星期三知識延伸——DNA分子雜交技術(shù)該方法是根據(jù)堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測的DNA中的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因?，F(xiàn)在是44頁\一共有52頁\編輯于星期三返回現(xiàn)在是45頁\一共有52頁\編輯于星期三1、用β-珠蛋白的DNA探針可以檢測出的遺傳病是A．鐮刀狀細(xì)胞貧血癥B．白血病C．壞血病D．苯丙酮尿癥A2、應(yīng)用基因工程技術(shù)診斷疾病的過程中必須使用基因探針才能達(dá)到檢測疾病的目的。這里的基因探針是A．用于檢測疾病的醫(yī)療器械B．用放射性同位素或熒光分子等標(biāo)記的DNA分子C．合成β-珠蛋白的DNAD．合成苯丙羥化酶的DNA片段BA現(xiàn)在是46頁\一共有52頁\編輯于星期三思考與探究：2.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機理,你能分析出不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做?①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。3.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的?，F(xiàn)在是47頁\一共有52頁\編輯于星期三4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的β-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計？（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA)。（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達(dá)載體。（3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。（4）培養(yǎng)進(jìn)入了β-