常用分子生物學技術的原理及應用784

第二十二章常用分子生物學技術的原理及應用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication現(xiàn)在是1頁\一共有52頁\編輯于星期四第一節(jié)

分子雜交與印跡技術

MolecularHybridization&BlottingTechnology現(xiàn)在是2頁\一共有52頁\編輯于星期四核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)

。一、分子雜交與印跡技術的原理現(xiàn)在是3頁\一共有52頁\編輯于星期四復性RNADNA現(xiàn)在是4頁\一共有52頁\編輯于星期四（一）印跡技術（二）探針技術

探針(probe)一小段用同位素、生物素或熒光染料標標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。

現(xiàn)在是5頁\一共有52頁\編輯于星期四二、印跡技術的類別及應用（一）DNA印跡技術

(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析

(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。

現(xiàn)在是6頁\一共有52頁\編輯于星期四

其他斑點印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點陣(DNAarray)DNA芯片技術(DNAchip)現(xiàn)在是7頁\一共有52頁\編輯于星期四三種印跡技術的比較現(xiàn)在是8頁\一共有52頁\編輯于星期四③分子雜交實驗①②目錄現(xiàn)在是9頁\一共有52頁\編輯于星期四放射自顯影照片目錄現(xiàn)在是10頁\一共有52頁\編輯于星期四DNA點陣目錄現(xiàn)在是11頁\一共有52頁\編輯于星期四第二節(jié)

聚合酶鏈反應

PolymeraseChainReaction現(xiàn)在是12頁\一共有52頁\編輯于星期四5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555一、基本工作原理目錄現(xiàn)在是13頁\一共有52頁\編輯于星期四Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。目錄現(xiàn)在是14頁\一共有52頁\編輯于星期四模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

二、PCR體系基本組成成分現(xiàn)在是15頁\一共有52頁\編輯于星期四三、PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C現(xiàn)在是16頁\一共有52頁\編輯于星期四（一）目的基因的克?。ǘ┗虻捏w外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）基因突變分析四、PCR的主要用途現(xiàn)在是17頁\一共有52頁\編輯于星期四三、幾種重要的PCR衍生技術（一）反轉錄PCR技術（二）原位PCR技術（三）實時PCR技術現(xiàn)在是18頁\一共有52頁\編輯于星期四實時PCR技術原理目錄現(xiàn)在是19頁\一共有52頁\編輯于星期四第三節(jié)

核酸序列分析

NucleicAcidSequenceAnalysis現(xiàn)在是20頁\一共有52頁\編輯于星期四核酸序列分析的基本原理化學裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(sanger法)現(xiàn)在是21頁\一共有52頁\編輯于星期四一、化學裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化學試劑可以使DNA鏈在1個或2個堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應強度，使一個斷裂點僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標記DNA的5′末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列?，F(xiàn)在是22頁\一共有52頁\編輯于星期四二、DNA鏈末端合成終止法現(xiàn)在是23頁\一共有52頁\編輯于星期四目錄現(xiàn)在是24頁\一共有52頁\編輯于星期四三、DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎。用不同熒光分子標記四種雙脫氧核苷酸，然后進行Sanger測序反應，反應產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。

現(xiàn)在是25頁\一共有52頁\編輯于星期四DNA自動測序結果舉例目錄現(xiàn)在是26頁\一共有52頁\編輯于星期四基因文庫

GeneLibrary第四節(jié)現(xiàn)在是27頁\一共有52頁\編輯于星期四基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)

基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。現(xiàn)在是28頁\一共有52頁\編輯于星期四目錄現(xiàn)在是29頁\一共有52頁\編輯于星期四第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結果舉例現(xiàn)在是30頁\一共有52頁\編輯于星期四疾病相關基因的克隆與鑒定

CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes第五節(jié)現(xiàn)在是31頁\一共有52頁\編輯于星期四克隆疾病相關基因的策略（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候選基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候選基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)現(xiàn)在是32頁\一共有52頁\編輯于星期四定義從對一種致病基因的功能的了解出發(fā)，克隆該致病基因。（一）功能性克隆應用生化機制已明確、基因表達產(chǎn)物較易得到部分純化的遺傳性疾病。現(xiàn)在是33頁\一共有52頁\編輯于星期四克隆方式

①利用特異性抗體篩選表達型cDNA文庫；②根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探針，篩選cDNA文庫。功能互補試驗(functionalcomplementationassay)利用酵母系統(tǒng)從功能學角度鑒定致病基因。

現(xiàn)在是34頁\一共有52頁\編輯于星期四（二）定位克隆定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。系統(tǒng)的定位克隆工作①遺傳學分析(確定致病基因染色體定位)交換分析、連鎖不平衡分析②分子生物學分析染色體異常(缺失、易位等)分析、基因文庫的篩選與基因克隆現(xiàn)在是35頁\一共有52頁\編輯于星期四（三）非定位候選基因克隆策略由于基因組作圖的完成和分子病理學的發(fā)展，人們可以不依靠染色體定位，直接根據(jù)病理學變化和對各種基因產(chǎn)物功能的了解，預測出候選致病基因?，F(xiàn)在是36頁\一共有52頁\編輯于星期四（四）定位候選基因克隆策略當致病基因的染色體定位確認后，人們可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選致病基因?，F(xiàn)在是37頁\一共有52頁\編輯于星期四第六節(jié)

遺傳修飾動物模型的建立及應用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel現(xiàn)在是38頁\一共有52頁\編輯于星期四轉基因技術采用基因轉移技術使目的基因整合入受精卵細胞或胚胎干細胞，然后將細胞導入動物子宮，使之發(fā)育成個體。

轉基因——被導入的目的基因轉基因動物(transgenicanimal)——目的基因的受體動物一、轉基因技術現(xiàn)在是39頁\一共有52頁\編輯于星期四核轉移技術

即動物整體克隆技術，將動物體細胞核全部導入另一個體的去胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個體，即克隆(clone)。

二、核轉移技術現(xiàn)在是40頁\一共有52頁\編輯于星期四目錄現(xiàn)在是41頁\一共有52頁\編輯于星期四基因剔除技術也稱基因靶向(genetargeting)滅活，有目的去除動物體內(nèi)某種基因的技術。三、基因剔除技術現(xiàn)在是42頁\一共有52頁\編輯于星期四四、基因轉移和基因剔除技術在醫(yī)學中的應用建立動物模型①單基因決定疾病模型

基因剔除獲得性突變(gain-of-functionmutation)②多基因決定疾病模型現(xiàn)在是43頁\一共有52頁\編輯于星期四第七節(jié)

生物芯片技術BiologicalChipTechnology現(xiàn)在是44頁\一共有52頁\編輯于星期四DNA芯片(DNAchip)

cDNA芯片(cDNAchip)是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上

。一、基因芯片(genechip)現(xiàn)在是45頁\一共有52頁\編輯于星期四目錄現(xiàn)在是46頁\一共有52頁\編輯于星期四是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)現(xiàn)在是47頁\一共有52頁\編輯于星期四第八節(jié)蛋白質(zhì)相互作用研究技術

ResearchTechnologyofInteractionofProtein現(xiàn)在是48頁\一共有52頁\編輯于星期四蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復合物是細胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動，包括DNA的復制與轉錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號轉導和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性現(xiàn)在是49頁\一共有5