免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)原理及方法

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)原理及方法免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白間相互作用的經(jīng)典方法，屬于免疫沉淀技術(shù)的一類，常被用于鑒定特定蛋白復(fù)合物的中未知蛋白組分。免疫共沉淀的設(shè)計(jì)理念是，假設(shè)一種已知蛋白是某個(gè)大的蛋白復(fù)合物的組成成員，那么利用這種蛋白的特異性抗體，就可能將整個(gè)蛋白復(fù)合物從溶液中“拉”下來(lái)（常說(shuō)的“pull-down”），進(jìn)而可以用于鑒定這個(gè)蛋白復(fù)合物中的其他未知成員。免疫共沉淀的特點(diǎn)可以概括為兩點(diǎn)，第一是天然狀態(tài)，第二是蛋白復(fù)合物。

免疫共沉淀的優(yōu)勢(shì)：與其他研究蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)（如GST-Pulldown、酵母雙雜交等）相比，免疫共沉淀鑒定的相互作用蛋白是在細(xì)胞內(nèi)與目的蛋白發(fā)生的天然結(jié)合，避免了人為的影響，因此符合體內(nèi)實(shí)際情況，得到的蛋白可信度更高。

免疫共沉淀的局限性和注意事項(xiàng)：1.免疫共沉淀是建立在蛋白復(fù)合物成員間彼此緊密結(jié)合的基礎(chǔ)上，意味著松散結(jié)合的蛋白組分很可能檢測(cè)不到；2.由于蛋白質(zhì)形成復(fù)合物以后，某些表位就會(huì)被掩蓋，因此可能導(dǎo)致使用某一種pull-down抗體，無(wú)論怎么增加抗體濃度，也極少能將不到一半的目標(biāo)蛋白復(fù)合物沉淀出來(lái)，如有必要最好使用多種不同抗體分別進(jìn)行CoIP；3.由于檢測(cè)的是天然狀態(tài)，因此在不同的時(shí)間和不同的處理下，CoIP拉下來(lái)的蛋白復(fù)合物都可能是不同的，當(dāng)然隨著實(shí)驗(yàn)次數(shù)的增加，得到的蛋白復(fù)合物成員也會(huì)越來(lái)越龐大；4.如果使用WesternBlot的方法檢測(cè)的蛋白復(fù)合物中的目標(biāo)蛋白，則需要在試驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)測(cè)，具有一定的冒險(xiǎn)性；當(dāng)然如果將蛋白復(fù)合物直接進(jìn)行質(zhì)譜分析就不存在上述問(wèn)題，但需要得到較高純度和濃度的蛋白復(fù)合物樣品也非易事，并且成本較高；5.CoIP鑒定得到的蛋白間相互作用可能是直接作用也可能是間接作用，進(jìn)一步區(qū)分還需要進(jìn)行GST-Pulldown等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)；6.為了保證CoIP實(shí)驗(yàn)的可靠性和嚴(yán)謹(jǐn)性，需要使用復(fù)合物的不同成員分別獨(dú)立進(jìn)行CoIP實(shí)驗(yàn)，并且結(jié)果應(yīng)該能夠彼此驗(yàn)證，因?yàn)樵瓌t上使用復(fù)合物的任一成員進(jìn)行CoIP都會(huì)得到其他所有成員\o"Immunoprecipitation-wikipedia"[1]

免疫共沉淀的一般操作流程（中英文對(duì)照）：

高純度的目的蛋白，而不考慮非特異性結(jié)合的話，你可以將抗體和蛋白樣品在加入ProteinA/G-argarose微球之前進(jìn)行混合，這樣最后抗體也會(huì)和目的蛋白一同被洗脫下來(lái)，從而可能會(huì)對(duì)westernblot檢測(cè)造成干擾。

Note:ThisCo-IPprotocolistobindantibodytotheProteinA/G-argarosebeadsandthenmixwiththeantigen.Itgiveslesseryieldthantheotheroneandavoidstheproblemofco-elutionofantibodies.Ifyouwanttoyieldhighpurityoftargetproteinregardlessofnon-specificbinding,youcanmixantibodywithproteinsamplepriortoadditionofProteinA/G-agarosebeads,thusintheendtheantibodiesarealsoco-elutedwithtargetproteinandinterferencemightoccursinwesternblotdetection.\o"Co-Immunoprecipitation(Co-IP)Background&Protocol"[2]參考資料：1.

Immunoprecipitation-wik