分子生物學(xué)第三次課3162課件

1.真核生物與原核生物染色體的異同真核生物染色體位于核仁內(nèi)，一般在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中在光學(xué)顯微鏡下可見，而在細(xì)胞間期則為染色質(zhì)，間期細(xì)胞經(jīng)低滲處理溶脹破裂放出纖維串珠狀的染色質(zhì)。原核生物的染色體位于擬核區(qū)，染色體環(huán)狀位置和形態(tài)：原核生物染色體外裹著稀疏的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)與DAN的折疊、復(fù)制、重組及轉(zhuǎn)錄有關(guān)。真核生物DNA和蛋白質(zhì)完全融合在一起，蛋白質(zhì)與DNA的質(zhì)量比為2：1，蛋白質(zhì)包括組蛋白和非組蛋白染色體的倍數(shù)：原核生物染色體一般為單倍體，大多只帶有單拷貝基因每個(gè)基因序列幾乎都與它所編碼的蛋白質(zhì)呈線性對(duì)應(yīng)關(guān)系真核生物除性細(xì)胞外染色體都是二倍體，每個(gè)基因都有2個(gè)拷貝DNA與蛋白質(zhì)的關(guān)系2.原核生物基因組原核生物基因組特點(diǎn)：基因連續(xù)，沒有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)練：DNA分子絕大部分用來(lái)編碼蛋白質(zhì)，小部分不轉(zhuǎn)錄DNA序列控制基因表達(dá)存在轉(zhuǎn)錄單元：原核生物DNA序列中功能相關(guān)的RNA和蛋白質(zhì)基因叢集在基因組的一個(gè)或幾個(gè)特定的部位，形成功能轉(zhuǎn)錄單元。并被一起轉(zhuǎn)錄為含多個(gè)mRNA的分子，叫多順反子mRNA.重疊基因：原核生物中的一些細(xì)菌和動(dòng)物病毒中有重疊基因，即同一段DNA能攜帶兩種不同的蛋白質(zhì)信息。如：ФX174是一種單鏈DNA病毒，含有9個(gè)重疊基因，有幾種情況：一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因里，部分重疊，兩個(gè)基因只有一個(gè)堿基重疊。原核生物基因組具有單個(gè)復(fù)制起點(diǎn)3.真核生物染色體中的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4非組蛋白組蛋白的特征：進(jìn)化上極端保守，尤其是H3、H4，沒有組織特異性，僅發(fā)現(xiàn)鳥類兩棲類紅細(xì)胞染色體不含H1而帶有H5,精細(xì)胞染色體的組蛋白是魚精蛋白。肽鏈上氨基酸分布不對(duì)稱，堿性氨基酸分布在N端，疏水基團(tuán)在C段。組蛋白的修飾作用，包括甲基化，乙?；?、磷酸化、及糖基化修飾作用發(fā)生在細(xì)胞周期的特定時(shí)期和組蛋白的特定位點(diǎn)上。MG1G2S組蛋白修飾的生物學(xué)意義：乙?；?、甲基化修飾能為相關(guān)調(diào)控蛋白提供附著位點(diǎn)，一般的乙酰化能選擇性使某些染色質(zhì)區(qū)域的結(jié)構(gòu)從緊密變得松散，開放某些基因轉(zhuǎn)錄，甲基化和可逆磷酸化的調(diào)節(jié)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中有重要的作用，是細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控中心4.真核生物基因組DNA真核生物基因組比較大，包括核基因組和細(xì)胞器基因組含有大量的重復(fù)序列，功能DNA序列大多數(shù)被不編碼非功能DNA隔開使基因組不連續(xù)真核生物的基因?yàn)閱雾樂醋诱婧松锘蚪M有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)DNA-------核小體--------螺線管----------超螺旋--------染色體11nm30nm300nm1400nm7倍6倍40倍5倍200bp約為68nm染色質(zhì)和核小體DNA和組蛋白有怎樣的關(guān)系？幾個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)：染色質(zhì)DNA的Tm值比純DNA高，說(shuō)明染色質(zhì)中的DNA可能與蛋白質(zhì)分子相互作用染色質(zhì)狀態(tài)下DNA聚合酶和RNA聚合酶催化DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄低于自由DNA的反應(yīng)DNA酶1對(duì)染色質(zhì)DNA的消化慢于對(duì)純DNA的消化染色質(zhì)在電子顯微鏡下為核小體組成的念珠狀結(jié)構(gòu)核酸酶處理染色質(zhì)得到片段的長(zhǎng)度均為200bp的倍數(shù)染色體上的非組蛋白：非組蛋白約占組蛋白的60%-70%，種類約有20-100種之間，非組蛋白包括酶類RNA聚合酶及與細(xì)胞分裂有關(guān)的酶，核孔復(fù)合體蛋白、肌動(dòng)蛋白等。特性：具有多樣性和異質(zhì)性，不同組織的細(xì)胞其種類和數(shù)量都不相同對(duì)DNA具有識(shí)別特異性，能識(shí)別特異DNA序列，識(shí)別信息來(lái)源于DNA序列本身，識(shí)別信息促在于雙螺旋的大溝內(nèi)具有多種動(dòng)能，參與表達(dá)調(diào)控，染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成C值矛盾C值指的是生物單倍體基因組所含的DNA總量C值矛盾是指基因數(shù)量與生物體進(jìn)化程度不成正比是人類基因組的200倍是人類基因組的12倍生命的特征是什么？生命的特征就是“活的”。生命現(xiàn)象最本質(zhì)的內(nèi)容就是自復(fù)制（自我繁殖和自我組織）。一個(gè)受精卵為什么變成一朵鮮花或一頭大象？生物的性狀是由什么決定的？又是怎樣代代相傳的呢？人也是從受精卵逐漸發(fā)育成完整的個(gè)體的，而決定一個(gè)人將來(lái)長(zhǎng)成什么樣子的生命藍(lán)圖就儲(chǔ)存在受精卵的DNA中。DNA（或RNA）攜帶著決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的遺傳信息而且代代相傳，這就我們遺傳信息的傳遞（即復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯）要討論的內(nèi)容。為什么要講復(fù)制？就是要了解：子代DNA為什么能真實(shí)獲得親代DNA的遺傳信息；復(fù)制是怎樣進(jìn)行的？

第三節(jié)DNA的復(fù)制DNA復(fù)制可能的幾種方式全保留式半保留式混合式AGAACTTTCTTGAAAGAACTTTCTTGAATCTTGAAAGAACTT母代DNA子代DNA

按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性,是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)。1.半保留復(fù)制的含義及意義

當(dāng)DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開成兩條單鏈，各自作為模板合成與之互補(bǔ)的新鏈。在子代DNA雙鏈中，一條是來(lái)自于親代，另一條完全重新合成。3.DNA復(fù)制的起點(diǎn)方向和速度生物的復(fù)制單位稱為復(fù)制子。DNA復(fù)制由固定起始點(diǎn)開始，從一個(gè)DNA復(fù)制起點(diǎn)開始最終由這個(gè)起點(diǎn)起始的復(fù)制叉完成的片段。一個(gè)復(fù)制子有一個(gè)起點(diǎn)，細(xì)菌、病毒、線粒體DNA分子都為單個(gè)復(fù)制子，而真核生物可以同時(shí)有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)以既是說(shuō)真核生物包含多個(gè)復(fù)制子復(fù)制的起始需要解決兩個(gè)問題：DNA解開成單鏈，提供模板生成引物，提供3-OH末端復(fù)制時(shí)DNA雙鏈解開分成二股單鏈?新鏈沿著張開的二股單鏈生成，復(fù)制中形成的這種Y字形的結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉

雙向等速?gòu)?fù)制為主（2）復(fù)制叉（replicationfork)3553新鏈3535親代DNA復(fù)制方向真核生物的染色體龐大、復(fù)雜，有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，同時(shí)進(jìn)行多個(gè)DNA片段的復(fù)制。兩個(gè)起始點(diǎn)之間的DNA片段，稱為一個(gè)復(fù)制子（replicon）。真核生物也是雙向等速?gòu)?fù)制為主。DNA聚合酶催化游離的脫氧核苷酸結(jié)合到新鏈3’末端，使其不斷延長(zhǎng)5’3’5’DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol(4)復(fù)制延長(zhǎng)的過(guò)程dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP大腸桿菌DNA聚合酶I、II和III的性質(zhì)比較性質(zhì)聚合酶I聚合酶II聚合酶III3’-5‘外切5’-3’外切新生鏈合成相對(duì)分子量/103細(xì)胞內(nèi)分子數(shù)生物學(xué)活性++-1034001+--90？0.05+--90010-20155’AGCTTCAGGATA

3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAGCGAC5’35外切酶活性

53外切酶活性?DNA損傷修復(fù)，岡崎片段引物去除能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，校對(duì)作用核酸外切酶活性

前導(dǎo)鏈(leadingstrand)

順著解鏈方向生成的子鏈，其復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，所得到一條連續(xù)片段的子鏈。5’3’3535解鏈方向復(fù)制的半不連續(xù)性3535解鏈方向復(fù)制方向與解鏈方向相反，須等待解開足夠長(zhǎng)度的模板鏈才能繼續(xù)復(fù)制，所得到一條由不連續(xù)片段組成的子鏈。

隨從鏈

(laggingstrand)

岡崎片段（Okazakifragment）

3’5’3’3’5’5`5`5`RNaseHOHP5`DNA聚合酶dNTP5`5`PATPADP+Pi5`5`DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接（5）復(fù)制的終止到達(dá)終止子序列（Ter）時(shí)，Ter-Tue復(fù)合物使DnaB不再將DNA解鏈，阻止復(fù)制叉遷移。相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后停止復(fù)制其間少量未復(fù)制序列由修復(fù)方式填補(bǔ)拓?fù)洚悩?gòu)酶IV作用下復(fù)制叉解體，釋放子鏈。真核生物復(fù)制的特點(diǎn)真核生物的每條染色體上有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，如酵母17號(hào)染色體有400多個(gè)起始點(diǎn)，真核生物的染色體在完成復(fù)制之前各個(gè)起始點(diǎn)的復(fù)制不能再開始真核生物復(fù)制的起始需要起始原點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

引發(fā)和延伸鏈的功能在復(fù)制延長(zhǎng)中起主要作用DNA損傷修復(fù)中起作用在后隨鏈復(fù)制過(guò)程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用DNA-pol

DNA-polDNA-pol

DNA-polDNA的半不連續(xù)復(fù)制

拓?fù)洚悩?gòu)酶DNA解鏈酶單鏈DNA結(jié)合酶引發(fā)酶DNA聚合酶RnaseH降解酶DNA連接酶DAN復(fù)制為半保留復(fù)制DAN復(fù)制為半不連續(xù)復(fù)制DAN復(fù)制在特定的起始位點(diǎn)起始，多為雙向等速進(jìn)行復(fù)制1.首先拓?fù)洚悩?gòu)酶解開超螺旋2.DNA解鏈酶解開DNA雙鏈3.單鏈結(jié)合蛋白與DNA單鏈結(jié)合4.引物酶合成引物提供3-OH5.DNA聚合酶合成新鏈，一條鏈為前導(dǎo)鏈，另一條鏈形成岡崎片段6.RNA酶將RNA引物水解，DNA聚合酶將卻空缺按互補(bǔ)配對(duì)原則合成DNA,DNA連接酶將DNA連接，形成連續(xù)的新鏈解鏈、解旋酶類

解鏈酶（helicase

)

——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。

單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）

SSBDnaBDnaC解鏈方向DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNAtopoiSOmerase）108局部解鏈后引物酶和引發(fā)體引物酶(

primase

)

在模板的復(fù)制起始部位催化NTP的聚合,形成短片段的RNA,這一小段RNA作為復(fù)制的引物（primer），提供3-OH末端,使DNA-pol能夠催化dNTP聚合。依賴DNA的RNA聚合酶引物酶與其他和復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物。

引發(fā)體（primosome）DNA復(fù)制的特點(diǎn)：1.DNA半保留復(fù)制2.半不連續(xù)復(fù)制3.需要引物4.雙向復(fù)制5.有一定的復(fù)制起始點(diǎn)6.DNA復(fù)制的保真性與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)1.四種脫氧核苷三磷酸2.模板親代DNA解鏈后分別作為模板進(jìn)行復(fù)制3.引物合成酶4.DNA聚合酶5.DNA連接酶6.DNA解旋酶7.單鏈結(jié)合蛋白2.DNA復(fù)制的幾種方式(1).線性DNA復(fù)制的方式多數(shù)為雙向復(fù)制，多個(gè)起始位點(diǎn)，復(fù)制叉處有眼狀結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制眼。(2).環(huán)狀DNA復(fù)制方式A.θ復(fù)制B.D-環(huán)復(fù)制單向復(fù)制線粒體，葉綠體C.滾環(huán)復(fù)制也叫σ復(fù)制

DNA復(fù)制的調(diào)控原核生物的調(diào)控，DNA鏈的延伸速度恒定，復(fù)制叉的數(shù)量決定細(xì)胞生長(zhǎng)和增值速度。ColEI質(zhì)粒DNA的復(fù)制調(diào)控DNA編碼兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子，Rop蛋白和反義RNADNA復(fù)制方向起始點(diǎn)RNA前體100200300400500600-500-400-300-200-100RNA1Rop基因Rop蛋白63個(gè)aaRnaseH真核細(xì)胞DNA的復(fù)制調(diào)控真核細(xì)胞的生活周期分為4個(gè)時(shí)期G1復(fù)制預(yù)備期S、復(fù)制期G2、有絲分裂準(zhǔn)備期、M有絲分裂期真核生物復(fù)制有3個(gè)水平的調(diào)控細(xì)胞生活周期水平調(diào)控，決定細(xì)胞停留在G1期還是進(jìn)入S期染色體水平，決定不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定順序起始復(fù)制復(fù)制子水平調(diào)控，決定復(fù)制的起始與否真核細(xì)胞DNA的復(fù)制調(diào)控真核細(xì)胞的生活周期分為4個(gè)時(shí)期G1復(fù)制預(yù)備期、S復(fù)制期、G2有絲分裂準(zhǔn)備期、M有絲分裂期真核生物復(fù)制有3個(gè)水平的調(diào)控細(xì)胞生活周期水平調(diào)控，決定細(xì)胞停留在G1期還是進(jìn)入S期染色體水平，決定不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定順序起始復(fù)制復(fù)制子水平調(diào)控，決定復(fù)制的起始與否MG1G2S聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)典型的PCR由（1）高溫變性（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過(guò)多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下（通常為93℃-94℃）使其變性解成單鏈；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合，兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短；耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因?yàn)槟０鍙?’→3’方向延伸

PCR能在（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增達(dá)到納克、微克、毫克級(jí)的特異性DNA片段。因此，PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建。課后復(fù)習(xí)題：DNA半保留復(fù)制DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制子復(fù)制叉如果細(xì)菌環(huán)狀染色體的復(fù)制是雙向的，并且從固定的復(fù)制起點(diǎn)開始，每個(gè)復(fù)制差以16um/min的速度移動(dòng)，細(xì)菌染色體長(zhǎng)1280um,完成整個(gè)染色體復(fù)制需要多少時(shí)間？當(dāng)細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基每20min分裂一次，也就是說(shuō)第一輪復(fù)制尚未完成就開始第二輪復(fù)制，此時(shí)染色體有幾個(gè)復(fù)制叉？課后復(fù)習(xí)題：DNA半保留復(fù)制DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制子復(fù)制叉如果細(xì)菌環(huán)狀染色體的復(fù)制是雙向的，并且從固定的復(fù)制起點(diǎn)開始，每個(gè)復(fù)制叉以16um/min的速度移動(dòng)，細(xì)菌染色體長(zhǎng)1280um,完成整個(gè)染色體復(fù)制需要多少時(shí)間？當(dāng)細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基每20min分裂一次，也就是說(shuō)第一輪復(fù)制尚未完成就開始第二輪復(fù)制，此時(shí)染色體有幾個(gè)復(fù)制叉？DNA損傷的原因及后果電離輻射可見光氧自由基H+烷化劑8-oxoGP/P復(fù)制錯(cuò)誤核苷類似物mCUDNA損傷的后果信號(hào)傳導(dǎo)異常長(zhǎng)時(shí)辰效應(yīng)老化腫瘤