蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3優(yōu)秀公開課件

體外折疊研究：如：變性和復(fù)性體內(nèi)折疊研究：新生肽鏈折疊第八節(jié)蛋白折疊一蛋白折疊的機制及途徑:未折疊蛋白（U）快折疊中間體慢成熟蛋白（N）（一）蛋白折疊的起始：自由能降低過程，為自發(fā)性二級結(jié)構(gòu)的形成：首先形成一些忽隱忽現(xiàn)的二級結(jié)構(gòu)。證據(jù)來源于蛋白復(fù)性實驗(二級結(jié)構(gòu)形成<18ms，三級結(jié)構(gòu)形成100~500s)疏水塌縮:蛋白折疊起始緣于疏水力的作用和溶劑擠壓效應(yīng)(hydrophobiccollapse有可能先于二級結(jié)構(gòu))特殊結(jié)構(gòu):二硫鍵等(存在張力)（二）折疊中間態(tài)：

熔球態(tài)(moltenglobulestate):①具有與天然肽一樣的類似緊密程度②二級結(jié)構(gòu)形成，但三級結(jié)構(gòu)未成形③比天然肽具有更多的疏水表面前熔球態(tài)(pro-moltenglobulestate):比熔球態(tài)松散的結(jié)構(gòu)形態(tài)稱為“前熔球態(tài)”用cytc為實驗對象觀察到在低離子強度下分子的緊密程度比熔球態(tài)弱，幾乎所有在天然態(tài)中存在的螺旋區(qū)域仍停留于二級結(jié)構(gòu)狀態(tài)。這種結(jié)構(gòu)形態(tài)即為前熔球態(tài)

熔球態(tài)

二蛋白折疊及裝配過程中的輔助因子（一）分子伴侶(molecularchaperones)：Ellis提出：把一類在細胞中幫助新生肽鏈正確折疊,而本身不是最終功能蛋白分子的組成部分的蛋白分子稱為分子伴侶進化上十分保守的蛋白，在真核及原核細胞中分布廣與酶不同:(1)對靶蛋白不具有高度專一性(2)不具有高效性(3)有時只是阻止肽鏈的錯誤折疊，而不促進折疊nucleoplasmin（二）分子伴侶的種類：目前發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)分子伴侶都是蛋白質(zhì)，并且基本歸屬于四個保守的蛋白質(zhì)家族：(1)nucleoplasmin家族：介導(dǎo)核酸和蛋白的裝配(2)chaperonin家族(Hsp60,heatshockprotein)：在細菌、線粒體、質(zhì)體中發(fā)現(xiàn)的一類序列同源的分子伴侶，分子量為60,000(60kDa)的熱休克蛋白。包括：GroEL/GroES：細菌中Hsp60，和蛋白折疊、分泌有關(guān)RuSBP：葉綠體Rubisco亞基結(jié)合蛋白，幫助Rubisco亞基組裝。Hsp60：線粒體中，直接參與蛋白折疊（3）Stress-70(Hsp70):在所有物種中高度保守；單體Mr=70,000所有成員都有一定的ATP酶活性，幫助從靶蛋白上釋放功能：識別未折疊或錯誤折疊的蛋白并以單體形式與其結(jié)合，在ATP存在下，幫助正確折疊此外，細胞質(zhì)中的Hsp70能與核糖體上正在合成的新生肽鏈結(jié)合，使多肽以完全伸展的狀態(tài)進行跨膜運輸。Stress-70家族成員：Dnak，DnaJ（E.coli）;Bip（動物細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔）；Scs1P（酵母線粒體）(4)Stress-90：

功能不十分清楚，一般只與少數(shù)幾種底物蛋白作用，如：幾種蛋白激酶，鈣調(diào)素等(5)分子內(nèi)伴侶:枯草桿菌的Ser蛋白酶（胞外酶）N信號肽-----前導(dǎo)肽（77aa）------酶蛋白C指導(dǎo)分泌分子內(nèi)伴侶成熟蛋白（四）折疊酶（foldase）:催化與蛋白折疊直接相關(guān)的、對形成功能構(gòu)象所必須的共價鍵變化的酶1PDI(proteindisulfideisomerase，蛋白二硫鍵異構(gòu)酶)：催化-s-s-反應(yīng)的酶，位于細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔中，Mr=58,000PDI是一個最為突出的多功能蛋白:①二硫鍵異構(gòu)酶：巰基氧化、二硫鍵還原和二硫鍵交換②四聚體Pro-4-羥化酶的(2β2)的β亞基（防止

亞基錯誤折疊)③微粒體內(nèi)甘油三脂轉(zhuǎn)移蛋白復(fù)合物(二亞基)的小亞基④一種糖基化位點結(jié)合蛋白⑤具有分子伴侶的功能

PDI結(jié)構(gòu)：

為二聚體蛋白，每個單體有五個結(jié)構(gòu)域c：低特異性多肽結(jié)合位，分子伴侶功能a、a’：二硫鍵異構(gòu)酶活性部位a、a’：二硫鍵異構(gòu)酶活性部位核磁共振法（NMR）測定的PDI結(jié)構(gòu)域a和結(jié)構(gòu)域b胱氨酸功能基在T細胞中：PPIase起抑制T淋巴細胞功能的生理作用?；咀饔茫菏谴呋鞍踪|(zhì)折疊的起始過程及其Pro順反異構(gòu)化的酶。通過非共價鍵方式穩(wěn)定扭曲的酰胺過渡態(tài)而催化肽?；滨；╔-Pro）間的順式與反式的相互轉(zhuǎn)變。

例如，在碳酸酐酶的折疊中，PPIase一方面在其早期中間體的形成過程中起分子伴侶的作用（阻止不正確的凝聚），另一方面在折疊的較晚時期發(fā)揮以上催化活性三蛋白質(zhì)折疊的研究方法及思路（一）研究思路：1.小肽在水溶液中的構(gòu)象及其轉(zhuǎn)變：天然小肽，蛋白質(zhì)同源片段的溶液構(gòu)象2.變性蛋白的復(fù)性：將蛋白質(zhì)變性，觀察復(fù)性過程中蛋白質(zhì)的折疊3.合成不同長度的新生肽片斷：

在不同的階段終止正在核糖體上合成的蛋白質(zhì)肽鏈，從而得到一系列不同長度的肽片斷（都是以N-端開頭），然后觀察他們的折疊過程。

（二）研究方法：快速動力學(xué)方法與蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)研究方法相結(jié)合，捕捉蛋白質(zhì)折疊的中間狀態(tài)，拼出折疊過程

快速動力學(xué)方法：停流法（stoppedflow）溫度躍遷法（temperaturejump）超快光譜法等

蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)研究方法：熒光譜，圓二色譜，氫同位素交換，核(順)磁共振，激光拉曼譜，付立葉紅外光譜（FTIR）等2.根據(jù)氫鍵類型分類：Kabsh和Sander等1983年提出依據(jù)：若蛋白質(zhì)骨架上第i個殘基與第i+1個殘基之間形成氫鍵，則定義為“n-回折”。如果僅有一個n-回折，則定義為-轉(zhuǎn)角；若有2個n-回折，則定義為-螺旋；若兩個肽片段之間連續(xù)3個氨基酸殘基有至少兩個氫鍵，則定義為-折疊3.根據(jù)微分幾何和模式識別理論將肽鏈骨架看作是一條三維空間曲線，曲線的幾何形狀由撓率和曲率兩個參數(shù)描述。-螺旋的撓率和曲率為不變的正值；而-折疊有零值撓率和曲率。三二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法：（一）Chou-Fasman法：1974年提出，基于統(tǒng)計學(xué)的預(yù)測方法，簡單，較準(zhǔn)確原理：統(tǒng)計了29個已知X-ray晶體結(jié)構(gòu)蛋白中4741aa殘基在-helix、-sheet、-turn和coil中出現(xiàn)的頻率，調(diào)整后得到20種aa形成各種二級結(jié)構(gòu)的傾向因子，分別記作：P、P、Pt、PC。由于每種氨基酸在-turn的四個殘基處傾向性不同，因此還測定了各自的傾向因子：fi、

fi+1、

fi+2、

fi+3

預(yù)測原則：①氨基酸序列中若連續(xù)6個殘基中有4個易于形成-helix，則被看作是螺旋的起始，然后向兩側(cè)擴展到有破壞-helix的4肽為止。任何長于6aa肽片斷，形成-helix的傾向因子

P1.03,PP——預(yù)測為-helix②若連續(xù)3個，或5個中有3個殘基利于形成-sheet，則被看作是折疊片的起始，然后向兩側(cè)擴展到有破壞-sheet的4肽為止。任何長于6aa肽片斷，

P1.05，PP

——預(yù)測為-sheet③轉(zhuǎn)角形成的概率:Pf=fi

fi+1

fi+2

fi+30.7510-4且：形成轉(zhuǎn)角的平均傾向因子Pt

1.00，P

<PP——預(yù)測為-turn

若y較復(fù)雜，分成若干個相關(guān)聯(lián)或獨立的事件，則其信息分解方程擴展為：I(x;y1,y2,···yn)=I(x;y1)+I(x;y2/y1))+I(x;y3/y1,y2)+

···+I(x;yn/y1,y2,···yn-1)若y1，···yn都是獨立事件，則上式為各事件引起信息的簡單加和；若y1，···yn是相互關(guān)聯(lián)的復(fù)雜事件，如代表肽鏈的序列，則各個aa殘基之間是相互影響的。X同樣可以分解為多種相關(guān)聯(lián)的事件，將得到極為復(fù)雜的信息方程從76個蛋白中統(tǒng)計了12,757個aa殘基，根據(jù)微分幾何二級結(jié)構(gòu)分類法，將各種二級結(jié)構(gòu)描述為4種（螺旋H、折疊E、轉(zhuǎn)角T、無規(guī)卷曲C)，對未知序列肽鏈預(yù)測的結(jié)果可達60~63%準(zhǔn)確率。（三）其它預(yù)測方法：基于蛋白質(zhì)同源性比較物理化學(xué)性質(zhì)：如殘基疏水性等能量計算(氨基酸在極性和非極性溶液中的轉(zhuǎn)移能）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法等準(zhǔn)確率：一般：50~60%高：70~80%二.四級結(jié)構(gòu)的特性四級結(jié)構(gòu)研究內(nèi)容：亞基的種類、數(shù)量及在寡聚蛋白中的空間排布及相互作用。（不包括三級及其以下結(jié)構(gòu)描述）（一）亞基數(shù)目及種類：以偶數(shù)居多；種類可相同或不同（二）亞基排布與對稱性：

1旋轉(zhuǎn)軸與對稱表示法：基轉(zhuǎn)角（）：能使物體復(fù)原的最小旋轉(zhuǎn)角旋轉(zhuǎn)軸軸次（n）：n=2/

2不對稱結(jié)構(gòu)：每個亞基與其相鄰亞基相互作用的方式在寡聚蛋白中只出現(xiàn)一次。或，只有旋轉(zhuǎn)360才能復(fù)原的物體。如：核小體中的組蛋白八聚體；核糖體等

3對稱結(jié)構(gòu):

(1)點群對稱(pointgroupsymmetry)：

①循環(huán)對稱（Cn，cyclicsymmetry）：亞基排布在圓圈上，呈平面幾何圖形二聚體：有C2對稱。每個亞基沿軸旋轉(zhuǎn)180（360/2）可與另一個亞基重合，例如固氮酶二組分的鐵蛋白，兩個亞基成對排列三聚體：有C3對稱。每個亞基沿軸旋轉(zhuǎn)120（360/3）可與另一個亞基重合，例如細菌葉綠素蛋白四聚體：有C4對稱。每個亞基沿軸旋轉(zhuǎn)90（360/4）可與另一個亞基重合，例如固氮酶的鐵鉬蛋白C4對稱：C6對稱：四聚體：有D2對稱。即四個亞基按正四面體排布。例如血紅蛋白、乳酸脫氫酶等六聚體：有D3對稱。正三角形（如ATCase的6個催化亞基）或正八面體排布八聚體：有D4對稱。分D4正四面體和D4反四角形十二聚體：有D6對稱。如Gln合成酶②