微生物的分離和純培養(yǎng)hw

微生物的分離和純培養(yǎng)hw第1頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四微生物:

結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單，個(gè)體多數(shù)十分微小，通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)。2、類群1、特點(diǎn)第2頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四病毒（無細(xì)胞結(jié)構(gòu)、寄生生活）第3頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)菌

電子顯微鏡下的結(jié)核桿菌第4頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四放線菌第5頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四真菌青霉菌酵母菌第6頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四原生生物第7頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動(dòng)物2、類群無細(xì)胞結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞真核細(xì)胞第8頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四微生物的分離和純培養(yǎng)技術(shù)是微生物最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它包括培養(yǎng)基的制備、滅菌和消毒、接種、培養(yǎng)等步驟第9頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四內(nèi)容提要：微生物及其分類培養(yǎng)基與各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無菌技術(shù)菌落大腸桿菌的純化培養(yǎng)微生物數(shù)量的測(cè)定第10頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四1、概念二、培養(yǎng)基

人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。第11頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四按成分不同劃分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基化學(xué)成分不恒定的天然有機(jī)物牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基。用于工業(yè)生產(chǎn)化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基高氏1號(hào)培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基。用于分類和鑒定2、分類第12頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四按物理狀態(tài)不同劃分固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)，瓊脂含量一般為1.5%-2.0%，固體培養(yǎng)基常用來進(jìn)行微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)及菌種保藏

瓊脂含量一般為0.2%-0.7%，觀察微生物的運(yùn)動(dòng)特征、分類鑒定及噬菌體效價(jià)滴定不加任何凝固劑，大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究半固體培養(yǎng)基第13頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四按用途不同劃分基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基含有一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，有利于所需微生物的生長(zhǎng)用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基，微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化選擇培養(yǎng)基第14頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四3、基本營(yíng)養(yǎng)碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、水、無機(jī)鹽⑴碳源無機(jī)碳源：有機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無機(jī)氮源：有機(jī)氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等含CHON的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源(3)能源第15頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四（4）生長(zhǎng)因子：

微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物，如：維生素、氨基酸、堿基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）。

第16頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基

培養(yǎng)基組分作用瓊脂20g牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5gH2O定容至1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方凝固劑提供碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子碳源、氮源、生長(zhǎng)因子無機(jī)鹽水、溶劑第17頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四選擇培養(yǎng)基應(yīng)用加入青霉素加入高濃度食鹽不加氮源不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基加入青霉素等抗生素延伸：分離酵母菌、霉菌等真菌分離金黃色葡萄球菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞第18頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四鑒別培養(yǎng)基:加入伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMS培養(yǎng)基）鑒別大腸桿菌現(xiàn)象：藍(lán)紫色金屬光澤第19頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四4.培養(yǎng)基要滿足微生物對(duì)環(huán)境條件的需求

：真菌微酸性（5.0-6.0）細(xì)菌中性（6.5-7.5）放線菌微堿性（7.5-8.5）大多數(shù)微生物適宜生長(zhǎng)的溫度在25-40℃之間厭氧菌需提供無氧條件pH：溫度：氧氣：第20頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四1.滅菌：

使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。三.無菌技術(shù)：

泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，防止外來雜菌的污染的方法第21頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四灼燒滅菌干熱滅菌箱高壓蒸汽滅菌鍋第22頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四

2、消毒

使用較為溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。煮沸消毒法：100℃5-6min巴氏消毒法：70-75℃30min或80℃15min化學(xué)藥劑消毒法：酒精、氯氣紫外線消毒：實(shí)驗(yàn)前30min超凈臺(tái)第23頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑（70%酒精等）紫外線針對(duì)不耐高溫的液體接種室、超凈工作臺(tái)能耐高溫的，需要保持干燥的物品灼燒法干熱滅菌高壓蒸汽滅菌接種工具（接種環(huán)等）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手培養(yǎng)皿等玻璃器皿培養(yǎng)基消毒方法滅菌方法實(shí)驗(yàn)操作者的衣服第24頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四單個(gè)或少數(shù)菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.功能：1.定義：四、菌落鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細(xì)胞群體第25頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四五、微生物的分離和純培養(yǎng)分散成單個(gè)細(xì)胞,形成單個(gè)菌落1、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（大腸桿菌分離和純培養(yǎng)）計(jì)算、稱量（配制固體培養(yǎng)基要加入瓊脂）溶化調(diào)pH(注意：滅菌前調(diào)PH)分裝、包扎滅菌（高壓蒸汽滅菌）倒平板第26頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四倒平板技術(shù)1234使瓶口迅速通過火焰在火焰旁打開錐形瓶打開一條稍大于瓶口的縫隙，向培養(yǎng)皿中倒入約10-20ml倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上皿蓋。等待平板冷卻凝固后倒置第27頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？

可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。問題討論第28頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四

2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第29頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。第30頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四

4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。第31頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四2、接種⑴平板劃線法交叉劃線法連續(xù)劃線法第32頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四1、將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)_______2、在_______旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞3、將試管口通過火焰4、將已______的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液6、左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃__________條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。5、將試管通過火焰，并塞上棉塞火焰冷卻三至五7、灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的_______開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。末端燒紅8、將平板_____放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

倒置第33頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四問題討論

為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物。殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時(shí)，菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第34頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法a.梯度稀釋菌液：菌液第35頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四b.涂布平板：滴灼試涂取0.1ml菌懸液微量移液器第36頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四Pourplate(3)稀釋混合平板法（課本P14)第37頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四

將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基，放入37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)12h-24h,直到長(zhǎng)出菌落為止。3、培養(yǎng)第38頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察第39頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四5、菌株的保存方法（1）臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4℃冰箱保存。（2）長(zhǎng)期保存：甘油冷凍管藏法擱置斜面第40頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四六、微生物數(shù)量的計(jì)算直接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法第41頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四（一）直接計(jì)數(shù)法

——顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

將待測(cè)樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計(jì)算出體積內(nèi)的微生物總數(shù)。一般適用于純培養(yǎng)液懸浮液中單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。優(yōu)點(diǎn)：直觀、快速、操作簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌，所得為總數(shù)，結(jié)果往往偏高不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察第42頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四1、血球計(jì)數(shù)板

計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚玻璃片，玻片上有四個(gè)槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)，中央平臺(tái)又由一短槽隔成兩半，其上各刻有一小方格網(wǎng)。

每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大格，中央的一大格作為計(jì)數(shù)用，稱為計(jì)數(shù)室。第43頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四****#####血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室有兩種刻度1大格=16中格25×16=400小格1大格=25中格16×25=400小格第44頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四

計(jì)數(shù)室邊長(zhǎng)為1mm，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為l×1＝1mm2，蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室高度為0.1mm，所以一個(gè)計(jì)數(shù)室的體積為l×0.1＝0.1mm3。(注意：1ml＝1000mm3)計(jì)數(shù)室容積第45頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四1、稀釋用無菌生理鹽水將待測(cè)菌稀釋成適當(dāng)濃度的菌懸液。2、鏡檢計(jì)數(shù)室加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢，若有污物，則用自來水沖洗，95%乙醇棉球輕輕擦洗，然后用吸水紙吸干或電吹風(fēng)吹干。3、加樣取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，蓋上蓋玻片。將菌懸液搖勻，用無菌滴管吸取少許，沿蓋玻片邊緣滴入一小滴，讓菌液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū)，靜置5min。注：取樣時(shí)先要搖勻菌液，加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生2、操作步驟第46頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四4、顯微鏡計(jì)數(shù)（以16小格×25中格的規(guī)格為例）在高倍下(40X)計(jì)數(shù)對(duì)兩個(gè)計(jì)數(shù)室記數(shù)，方法：每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格(4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)，求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25即為大方格中的總菌數(shù)，最后換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。注：依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右“的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)不時(shí)調(diào)節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5—10個(gè)菌體為宜計(jì)數(shù)的結(jié)果是兩個(gè)計(jì)數(shù)室所記菌數(shù)的平均值5、清洗血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)完畢，將血球計(jì)數(shù)板在水龍頭下流水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后電吹風(fēng)吹干，鏡檢確認(rèn)計(jì)數(shù)區(qū)無殘留菌體或其它沉淀。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。第47頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四3、計(jì)數(shù)方法所統(tǒng)計(jì)的中格的總菌數(shù)A，菌液的稀釋倍數(shù)為B，則1ml菌液中：

(1)25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板計(jì)算公式(2)16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板計(jì)算公式第48頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四（二）間接計(jì)數(shù)法

——稀釋平板計(jì)數(shù)法

將待測(cè)樣品按比例做一系列稀釋后，將其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定稀釋度、一定量的稀釋樣液接種到平板上，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)；或是將一定量的稀釋液，與溶化后冷卻至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，傾入無菌培養(yǎng)皿中，搖勻、靜置待凝。經(jīng)過培養(yǎng)，由單個(gè)微生物生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可