植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)優(yōu)秀課件

第十八章植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)：又稱基因重組技術(shù)或DNA重組，即將人工分離和修飾過的基因?qū)胫参锘蚪M中，通過導(dǎo)入基因的表達(dá)從而引起植物體性狀的可遺傳的修飾。凡是外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞的過程都可以泛稱為轉(zhuǎn)化，包含以下內(nèi)容：

直接轉(zhuǎn)化；

介導(dǎo)轉(zhuǎn)化；

直接轉(zhuǎn)化

是將裸露的DNA直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法。這種裸露的DNA可以是全部或部分染色體，分離的DNA，也可以是基因工程質(zhì)粒；直接轉(zhuǎn)化與介導(dǎo)轉(zhuǎn)化都涉及以下三方面:1、遺傳物質(zhì)導(dǎo)入植物細(xì)胞；2、外源DNA在植物基因組中的穩(wěn)定整合；3、轉(zhuǎn)基因植株的再生。一、直接轉(zhuǎn)化一)目的基因的獲得：(1)直接從目的生物(即供體生物)的基因組中用機(jī)械(如超聲波)或限制性內(nèi)切酶切斷后分離出來。(2)通過反轉(zhuǎn)錄酶作用,以mRNA為模板,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA(即cDNA)。二）目的基因的修飾，構(gòu)成嵌合基因：嵌合基因中必有啟動(dòng)子（如花椰菜病毒的35s亞基啟動(dòng)子、19s亞基啟動(dòng)子），目的基因及終止子。三）嵌入標(biāo)記基因或報(bào)告基因：應(yīng)用較廣的是GUS基因；綠色熒光蛋白基因?；驑尫ǎ何棡?.2-2.0um的鎢粉或者金粉，用超聲波使外源

DNA液均勻的包裹鎢粉微粒手槍原理射擊。四）直接轉(zhuǎn)化的方法：電穿孔轉(zhuǎn)化法：用短時(shí)高脈沖電處理可導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)可恢復(fù)性孔隙，從而發(fā)生的滲透點(diǎn)3－4nm為外源DNA進(jìn)入細(xì)胞提供通路。

PEG轉(zhuǎn)化法：

PEG轉(zhuǎn)化法和PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合方法相似，同樣需要高鈣、高pH條件從而將外源DNA插入原生質(zhì)體并整合。五）、轉(zhuǎn)化基因材料的分析與鑒定（1）GUS測(cè)定：GUS基因的表達(dá)產(chǎn)物是葡糖苷酸酶，它可分解葡糖苷酸，葡糖苷酸被分解后形成藍(lán)色產(chǎn)物使植物組織成為藍(lán)色。（3）蛋白質(zhì)雜交技術(shù)：蛋白質(zhì)抗原與其相應(yīng)的特異抗體相結(jié)合。（4）PCR反應(yīng)：根據(jù)已知轉(zhuǎn)化基因或標(biāo)記基因順序設(shè)計(jì)引物，（5）遺傳分析：觀察基因是否可以穩(wěn)定遺傳給下一代。（6）鑒定轉(zhuǎn)化基因的功能。實(shí)例小麥的基因槍轉(zhuǎn)化1、試驗(yàn)材料：小麥幼胚（開花后10～12天）2、質(zhì)粒的制備：轉(zhuǎn)化所用質(zhì)粒為pABH9，該質(zhì)粒插入BADH基因（表達(dá)產(chǎn)物是甜菜堿醛脫氫酶，提高植物細(xì)胞的調(diào)滲能力和耐鹽性）和BAR基因（表達(dá)產(chǎn)物是PPT已酰轉(zhuǎn)移酶，抗除草劑PPT，因此可利用PPT作為轉(zhuǎn)化物的選擇劑），由玉米啟動(dòng)子控制，并含有nos中止子。3、幼胚的高滲預(yù)培養(yǎng)：4、微彈的制備與基因槍的轟擊（無菌）：5、抗PPT愈傷組織的選擇：白色生長(zhǎng)快的為外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的愈傷（見圖）。6、抗PPT再生植株的獲得：（見圖）實(shí)例小麥的基因槍轉(zhuǎn)化7、抗PPT轉(zhuǎn)化植株的耐鹽性：含鹽0.7％NaCl條件下轉(zhuǎn)化植株表現(xiàn)較強(qiáng)的耐鹽性。8、轉(zhuǎn)化植株的壯苗、生根、移栽、傳代。9、轉(zhuǎn)BADH基因植株的分子檢測(cè)：根據(jù)已知的BADH結(jié)構(gòu)基因設(shè)計(jì)引物用PCR法鑒定外源BADH基因是否整合到小麥基因組中。也可以進(jìn)一步用Southern雜交驗(yàn)證。實(shí)例小麥的基因槍轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的抑制革蘭氏陰性菌，能在自然條件下趨化性的感染大多數(shù)的雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤（根瘤農(nóng)桿菌）和發(fā)狀根（發(fā)根農(nóng)桿菌）。分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒。二、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（二）、Ti質(zhì)粒：

Ti質(zhì)粒的大小約200kb左右，為雙鏈環(huán)狀DNA分子。含有T-DNA區(qū)、毒性區(qū)、質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)、質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移位點(diǎn)和冠癭堿分解位點(diǎn).

其中以T-DNA區(qū)和毒性區(qū)（vir-region）在植物轉(zhuǎn)化中最為重要。T-DNA區(qū)：能夠轉(zhuǎn)移整合入植物受體基因組，并能在植物細(xì)胞中表達(dá)，從而導(dǎo)致冠癭瘤發(fā)生。Vir區(qū)：由多個(gè)毒性基因組成，其編碼蛋白對(duì)T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合必不可少。T-DNA從農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，接著T-DNA整合到細(xì)胞核基因組中進(jìn)行表達(dá)，對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。在Ti質(zhì)粒的兩端，T-DNA有兩個(gè)幾乎完全相同的25bp的重復(fù)。右端重復(fù)對(duì)于T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合是必需的。T-DNA與植物基因組中的右接口拼接相當(dāng)精確，右邊接口保留有1-2bp的右端重復(fù)，但左邊接口處序列變化較大，有大約100bp以內(nèi)的序列來自左邊界。2.Ti質(zhì)粒適用于植物基因轉(zhuǎn)化的重要特性（或轉(zhuǎn)化原理）：第一,保留T-DNA兩端的末端序列,然后用一段外源DNA插人或直接取代野生型T-DNA的部分基因組,這段外源DNA仍然可以進(jìn)入植物細(xì)胞,整合到植物的染色體組上（卸甲載體：disarmedvector）。其次，T-DNA的末端序列由25個(gè)核苷酸序列組成，它們的左右端序列都具有高度的同源性，并且末端序列對(duì)T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)具有重要意義。第三,毒性區(qū)是控制T-DNA轉(zhuǎn)移的，而且毒性區(qū)對(duì)T-DNA的作用既可以以順式(incis)方式進(jìn)行,又可以以反式(intrans)方式進(jìn)行。3、Ti質(zhì)粒上的毒性區(qū)：

Ti質(zhì)粒的毒性區(qū)約有30kb大小,由7個(gè)互補(bǔ)群組成,分別命名為VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirF和VirH。

毒性區(qū)的大多數(shù)基因產(chǎn)物都控制T-DNA的轉(zhuǎn)移。在這個(gè)區(qū)域內(nèi)的突變往往導(dǎo)致土壤農(nóng)桿菌感染植物的能力下降。Ti質(zhì)粒衍生的載體系統(tǒng)刪除生長(zhǎng)素基因，細(xì)胞分裂素基因和冠癭堿基因，使質(zhì)粒大大減小。插入E.coli復(fù)制原點(diǎn)，使Ti質(zhì)粒能在大腸桿菌中繁殖。3具有選擇型標(biāo)記基因，便于轉(zhuǎn)化體的篩選。4含有多克隆位點(diǎn)，便于目的基因的克隆。二）、轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)：Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)一般分為兩類：一類叫共整合載體系統(tǒng)；一類叫雙元載體系統(tǒng)。（一）、共整合載體質(zhì)粒：

X：目的基因BL：左端重復(fù)序列BR：左端重復(fù)序列vir：毒性區(qū)1.pGV3850系統(tǒng):

這是第一個(gè)非致癌的Ti質(zhì)粒衍生載體,來自胭脂堿型質(zhì)粒pTiC58Trac,包括25bp末端序列和胭脂堿合成酶基因,T-DNA上的其它基因則為pBR322序列取代。

2.pGV2260系統(tǒng):

來自章魚堿型Ti質(zhì)粒pTiB63,整個(gè)T-DNA序列連同25bp未端序列均被一段pBR322所取代。

X：目的基因BL：左端重復(fù)序列BR：左端重復(fù)序列vir：毒性區(qū)大腸桿菌pBR衍生物

這種系統(tǒng)需要兩個(gè)彼此分離的質(zhì)粒：

一個(gè)是多功能克隆載體質(zhì)粒，在大腸桿菌和土壤農(nóng)桿菌中都能夠復(fù)制；

另一個(gè)是Ti衍生質(zhì)粒,如pGV2260,可以提供反式的毒性區(qū)功能,以便T－DNA轉(zhuǎn)移到植物中去。

（二）、雙元載體系統(tǒng)：

X：目的基因BL：左端重復(fù)序列BR：左端重復(fù)序列vir：毒性區(qū)大腸桿菌pBR衍生物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程：對(duì)植物表面部位的識(shí)別和附著：植物傷口分泌的酚類小分子物質(zhì)可以誘導(dǎo)Vir基因活化并表達(dá)。T-DNA進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)移：Vir產(chǎn)物能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒復(fù)制產(chǎn)生一新的單鏈T-DNA分子，并使其轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。T-DNA的整合：在Vir產(chǎn)物作用下，T-DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，并整合到植物染色體上。1原生質(zhì)體或懸浮細(xì)胞與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)2葉盤轉(zhuǎn)化法其它外植體轉(zhuǎn)化法：如桃的莖斷胚胎愈傷組織、核桃的體細(xì)胞胚、草莓的下胚軸等。4整株感染法。實(shí)例：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻基因轉(zhuǎn)化1、水稻愈傷組織誘導(dǎo)：以水稻成熟胚的盾片愈傷組織為轉(zhuǎn)基因受體。2、菌株和質(zhì)粒。3、轉(zhuǎn)化程序。轉(zhuǎn)化后的GUS的瞬間表達(dá)轉(zhuǎn)化后3周產(chǎn)生的抗性愈傷組織抗性愈傷的GUS反應(yīng)再生的轉(zhuǎn)化植株轉(zhuǎn)化植株葉片的GUS表達(dá)抗性植株后代的抗性檢測(cè)第二節(jié)轉(zhuǎn)基因植物

自1983年人類首次獲得轉(zhuǎn)基因植物后，已有大量的抗病、抗逆及品質(zhì)改良的轉(zhuǎn)基因植物獲得成功，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上已經(jīng)發(fā)揮了重要的作用。在轉(zhuǎn)基因技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的植物生物反應(yīng)器展現(xiàn)了誘人的發(fā)展前景。1.植物抗蟲基因工程

我國(guó)科學(xué)家成功地人工合成和改造的Bt基因轉(zhuǎn)入花，獲得了高抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)基因棉花品種和品系。2.植物抗病基因工程中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所成功將抗菌肽基因?qū)腭R鈴薯，獲得抗青枯病的轉(zhuǎn)基因株系；北京大學(xué)克隆了煙草花葉病毒TMV，黃瓜花葉病毒CMV等基因。3.植物抗逆基因工程我國(guó)在抗鹽基因工程上已取得了一些進(jìn)展，先后克隆了脯氨酸合成酶、山菠菜堿脫氫酶、磷酸甘露醇脫氫酶等耐鹽相關(guān)基因，并獲得了抗鹽的轉(zhuǎn)基因植物。4.植物品質(zhì)改良的基因工程將編碼必需氨基酸的基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，獲得含高必需氨基酸的馬鈴薯品系；將高賴氨酸基因?qū)胗衩撰@得含高賴氨酸的轉(zhuǎn)基因玉米；獲得儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因番茄。5.植物葉綠體基因工程進(jìn)行葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化研究，建立了煙草葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化體系。并將一些基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體。6.