基因工程克隆方案設(shè)計(jì)公開(kāi)課課件

基因工程克隆方案設(shè)計(jì)基因工程實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1、目的基因的序列分析2、載體的選擇和分析3、克隆策略的設(shè)計(jì)4、引物的設(shè)計(jì)載體的選擇和分析1、根據(jù)目的選擇合適的載體質(zhì)粒：克隆、表達(dá)或其它用途。2、MCS(多克隆位點(diǎn)）是否有合適酶切位點(diǎn)（一般是基因上沒(méi)有或1個(gè)的酶切位點(diǎn))3、表達(dá)載體，要注意表達(dá)框架配對(duì)。4、載體的酶切位點(diǎn)，用于重組鑒定?？寺〔呗缘脑O(shè)計(jì)1、平端克隆；2、粘端克隆

（1）

TA克?。?）單酶切不定向克隆（3）雙酶切定向克隆

平端克隆機(jī)械打斷，化學(xué)合成，EcoRV酶切，或其它酶切位點(diǎn)末端改造（klenow酶補(bǔ)平，S1處理）產(chǎn)生平端；克隆效率較低，ligase要加大量；載體需脫磷；方向可正可反。單酶切不定向克隆載體需要脫磷（否則，自連效率極高，外源基因無(wú)法插入）；基因插入可正可反，需要篩選。雙酶切定向克隆類(lèi)型：

（1）粘-粘連接：最有效、最快捷（2）粘-平連接：適用于外源基因僅與載體有一個(gè)相同酶切位點(diǎn)，可將另一末端補(bǔ)平特點(diǎn):(1)基因和載體都用兩種酶切割；(2)連接效率高；(3)外源基因插入方向固定，不用鑒定。引物的設(shè)計(jì)常規(guī)設(shè)計(jì)原則特殊用途設(shè)計(jì)技巧引物常規(guī)設(shè)計(jì)原則1.長(zhǎng)度：１５～３7nt,一般２０nt左右;(僅binding,不含接頭)2.G+C含量４０％～６０％3.避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)；4.引物自身不能互補(bǔ)（<3個(gè)）5.引物之間不能互補(bǔ)（<5

個(gè)）6.引物３端不能錯(cuò)配,不能修飾，盡量不用A,不能超過(guò)３個(gè)連續(xù)的G或C；7.５端可變化修飾，附加酶切位點(diǎn)；8.兩引物的Tm值應(yīng)比較接近；9.正鏈引物：mRNA序列照抄；負(fù)鏈引物：先寫(xiě)出mRNA序列的互補(bǔ)序列，然后翻轉(zhuǎn)重寫(xiě)。１０．解鏈溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)[=<20nt]Tm=81.5+0.41*(GC%)-600/L[>20nt]Tm一般５５℃～８０℃［５５℃～５８℃最佳］PCR反應(yīng)中結(jié)合溫度（anneaningtemperature）T=Tm-5℃5’附加酶切位點(diǎn)(定向克隆)1、不同酶的保護(hù)堿基序列不同；NEBcatalog提供相關(guān)資料。2、有些酶的保護(hù)堿基包含其它酶切位點(diǎn)，注意雙酶切的先后順序:

Nde1EcoR1引入點(diǎn)突變1.一條引物最多引入3個(gè)點(diǎn)突變,可延長(zhǎng)引物長(zhǎng)度.2.突變位點(diǎn)要靠近5’端.3.要注意密碼子的偏好性,簡(jiǎn)并性有不確定序列－－（2種）5’ATGGGC

A

CCATAGCTTCTA(A/C)C3’說(shuō)明：1,表示該位點(diǎn)有兩種可能的序列A或C;2.合成引物時(shí)只要一條引物的money;實(shí)際得到的是兩條引物等比例的混合物：5’ATGGGC

A

CCATAGCTTCTAAC3’5’