藥物分析第十六章抗生素類藥物分析

Contents概述1β-內(nèi)酰胺類2氨基糖苷類3四環(huán)素類4高分子雜質(zhì)檢查51第一頁，共61頁。第一節(jié)概述在低微濃度下即可對(duì)某些生物（病原微生物）的生命活動(dòng)有特異抑制作用的化學(xué)物質(zhì)的總稱定義2第二頁，共61頁。3第三頁，共61頁?？股厮幬锏姆诸?第四頁，共61頁。5第五頁，共61頁。6第六頁，共61頁?？咕幬锏闹饕饔貌课秽Z酮類林可霉素類氨基糖苷類酮康唑環(huán)絲氨酸利福平紅霉素制霉菌素桿菌肽甲氧芐胺嘧啶四環(huán)素類兩性霉素B萬古霉素磺胺藥氯霉素多粘菌素類β-內(nèi)酰胺類核酸合成細(xì)胞蛋白合成細(xì)胞膜滲透性細(xì)胞壁7第七頁，共61頁。細(xì)菌的耐藥機(jī)制8第八頁，共61頁。細(xì)菌的耐藥機(jī)制產(chǎn)生鈍化酶使抗菌藥物失效藥物作用靶位的結(jié)構(gòu)和數(shù)量改變——抗菌藥不易與細(xì)菌結(jié)合主動(dòng)外排機(jī)制——藥物被泵出菌體外9第九頁，共61頁。產(chǎn)品穩(wěn)定性差分子結(jié)構(gòu)大多不穩(wěn)定，降解后療效下降、失效或增加毒副作用發(fā)酵過程不易控制易受污染生產(chǎn)工藝復(fù)雜發(fā)酵液中雜質(zhì)

無機(jī)鹽、脂肪、各種蛋白質(zhì)、各種降解產(chǎn)物、色素、熱原、毒性物質(zhì)

抗生素質(zhì)量的復(fù)雜性10第十頁，共61頁。

鑒別：理化方法(主要方法)、微生物法官能團(tuán)的顯色反應(yīng)，如：β-內(nèi)酰胺環(huán)的羥肟酸鐵反應(yīng)；鏈霉素的麥芽酚反應(yīng)、坂口反應(yīng)；光譜法：紅外光譜及紫外吸收光譜的鑒別。色譜法：HPLC和TLC法，采用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照品對(duì)照法；生物學(xué)法：比較抑菌能力，現(xiàn)已少用?？股刭|(zhì)量分析11第十一頁，共61頁。

檢查：影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的檢查項(xiàng)目：結(jié)晶性、酸堿度、水分或者干燥失重等控制有機(jī)和無機(jī)雜質(zhì)的項(xiàng)目：溶液澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、熾灼殘?jiān)?、重金屬等；與臨床安全性有關(guān)的檢查項(xiàng)目：異常毒性、熱源或細(xì)菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)、無菌等12第十二頁，共61頁。

效價(jià)：每毫升或每毫克中含有某種抗生素的有效成分的多少。由單位（u）或微克（μg）表示。各種抗生素的效價(jià)基準(zhǔn)是人們?yōu)榱松a(chǎn)科研方便而規(guī)定的。

1mg青霉素鈉定為1670單位；1mg慶大霉素定為590單位。相應(yīng)的鹽可以通過分子量與標(biāo)準(zhǔn)鹽類進(jìn)行換算?？股鼗钚员硎痉椒?3第十三頁，共61頁。含量/效價(jià)測定：

微生物法：與臨床療效吻合,靈敏度高，結(jié)果直觀，適用范圍廣；但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，誤差大

理化方法：準(zhǔn)確度與專屬性較高,且操作簡便；但與臨床療效有偏差14第十四頁，共61頁。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類6-aminopenicillanicacid簡稱6-APA青霉素類7-aminocephalosporanicacid,簡稱7-ACA頭孢菌素類氫化噻唑環(huán)氫化噻嗪環(huán)＊＊＊＊15第十五頁，共61頁。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類青霉素(芐青霉素)(penicillins)氨芐西林阿莫西林16第十六頁，共61頁。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類頭孢氨芐頭孢拉定頭孢羥氨芐頭孢噻吩鈉17第十七頁，共61頁。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類1.酸性（羧基），酸性較強(qiáng)。堿金屬鹽水溶性好，有機(jī)堿鹽難溶于水。2.手性C（旋光性）﹡﹡﹡﹡﹡18第十八頁，共61頁。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類3.UV青霉素類：苯環(huán)取代基頭孢菌素類：母核有共軛結(jié)構(gòu)260nm19第十九頁，共61頁。4.β–內(nèi)酰胺環(huán)(四元環(huán)張力+酰胺鍵)第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類干燥條件較穩(wěn)定，溶液不穩(wěn)定某些氧化劑、金屬離子、溫度20第二十頁，共61頁。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類(一)色譜法HPLC(tR)TLC(Rf)(二)光譜法IRUVNMR21第二十一頁，共61頁。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類22第二十二頁，共61頁。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類(三)呈色反應(yīng)1）羥肟酸鐵反應(yīng)——β–內(nèi)酰胺環(huán)β–內(nèi)酰胺類NH2OH·HClNaOH羥肟酸

Fe3+H+顯色（紅、棕、褐）2）類似肽鍵（-CONH-）a.茚三酮反應(yīng)——α-氨基23第二十三頁，共61頁。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類b.雙縮脲反應(yīng)——β–內(nèi)酰胺類堿性酒石酸銅紫色24第二十四頁，共61頁。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類3）其他呈色反應(yīng)（偶合）青霉素鉀和青霉素鈉呈紅棕色(四)各種鹽的反應(yīng)焰色反應(yīng)——K+、Na+25第二十五頁，共61頁。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類(聚合物、有關(guān)物質(zhì)、異構(gòu)體等)1.聚合物頭孢他啶中聚合物測定—分子排阻色譜凝膠色譜分子篩機(jī)制主成分自身對(duì)照法面積歸一化法限量法自身對(duì)照外標(biāo)法

萄聚糖凝膠立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖26第二十六頁，共61頁。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類2.有關(guān)物質(zhì)與異構(gòu)體頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查

取本品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成約含0.25mg/ml的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動(dòng)相制成2.5g/ml的溶液，作為對(duì)照溶液。取對(duì)照溶液20l注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10%，再取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的3.5倍，供試品溶液如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和，其中E異構(gòu)體峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積之和(1.0%)，△3-異構(gòu)體峰面積不得大于1.5倍(1.5%)，其余單個(gè)雜質(zhì)峰面積的和不得大于3倍(3.0%)。(供試品溶液中任何小于對(duì)照品溶液主峰面積之和0.05倍的峰可忽略不計(jì))27第二十七頁，共61頁。青霉素鈉(鉀)的吸光度檢查：本品加水制成每1mL含有1.80mg的溶液，照UV-Vis法，在280nm波長處測定吸光度，不得大于0.10；在264nm波長處有最大吸收，吸光度應(yīng)為0.80-0.88.該法264nm處吸收值用來控制青霉素鈉(鉀)的含量，280nm處吸收值用來控制雜質(zhì)的含量。3.UV第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類28第二十八頁，共61頁。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類4.有機(jī)溶劑：用GC法或者HPLC法5.結(jié)晶性第一法(偏光顯微鏡法)第二法(X射線粉末衍射法)29第二十九頁，共61頁。碘量法汞量法酸堿滴定法羥肟酸比色法

HPLC法第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類30第三十頁，共61頁。阿莫西林克拉維酸鉀片色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉7.8g，加水900ml溶解，用磷酸或10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.4±0.1，加水稀釋至1000ml)-甲醇(95:5)為流動(dòng)相；流速為0.7ml/min；檢測波長為220nm。阿莫西林峰與克拉維酸峰的分離度應(yīng)大于3.5

測定法

取本品10片，置1000ml量瓶中，加水適量，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取阿莫西林對(duì)照品與克拉維酸對(duì)照品各適量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉維酸0.25mg的混合溶液，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積分別計(jì)算供試品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類31第三十一頁，共61頁。第三節(jié)氨基糖苷類堿性環(huán)己多元醇+氨基糖→苷鏈霉素(Streptomycin)32第三十二頁，共61頁。巴龍霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺脫氧鏈霉胺巴龍胺D－核糖巴龍霉糖巴龍二糖胺第三節(jié)氨基糖苷類33第三十三頁，共61頁。慶大霉素(Gentamycin)34第三十四頁，共61頁。1）溶解度（氨基、羥基）：水溶性2）堿性（氨基）：臨床應(yīng)用其硫酸鹽；溶于水，但不溶于有機(jī)溶劑；3）旋光性（糖）：多個(gè)手性碳4）穩(wěn)定性（苷）：強(qiáng)酸、堿條件均可水解；臨床使用時(shí)對(duì)pH值有很高的要求；5）紫外吸收光譜第三節(jié)氨基糖苷類35第三十五頁，共61頁。1.茚三酮反應(yīng)——羥基胺類,α-氨基酸△第三節(jié)氨基糖苷類36第三十六頁，共61頁。2.Molisch試驗(yàn)——五碳糖或六碳糖結(jié)構(gòu)紅紫色羥甲基糠醛(含六碳糖結(jié)構(gòu)氨基糖苷類酸性水解產(chǎn)物)a.α-萘酚b.萘酮藍(lán)紫色第三節(jié)氨基糖苷類37第三十七頁，共61頁。3.N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)（Elson-Morgan反應(yīng)）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對(duì)二甲氨基苯甲醛H+紅色第三節(jié)氨基糖苷類38第三十八頁，共61頁。4.麥芽酚反應(yīng)——鏈霉糖特有反應(yīng)H+第三節(jié)氨基糖苷類39第三十九頁，共61頁。紫紅麥芽酚40第四十頁，共61頁。5.坂口反應(yīng)——鏈霉胍特有反應(yīng)（或α-萘酚）41第四十一頁，共61頁。坂口反應(yīng)麥芽酚反應(yīng)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)第三節(jié)氨基糖苷類42第四十二頁，共61頁。6.硫酸鹽反應(yīng)7.色譜法：TLC和HPLC法8.光譜法：IR、UV第三節(jié)氨基糖苷類43第四十三頁，共61頁。1.鏈霉素中鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）的檢查來源：發(fā)酵中產(chǎn)生方法：TLC中的對(duì)照品法2.硫酸奈替米星中西索米星的檢查(TLC)3.慶大霉素C組分的測定第三節(jié)氨基糖苷類44第四十四頁，共61頁。微生物檢定法平行反應(yīng)，檢測同等量下供試品和對(duì)照品對(duì)微生物的抑制作用；管碟法：利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品對(duì)菌群產(chǎn)生的抑菌圈大小；濁度法：通過抗生素在液體培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)菌生長的抑制作用，通過測定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品抑菌程度，測定供試品效價(jià)；--該法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、量少、直觀；與臨床要求一直；使用范圍廣；是效價(jià)測定的最基本方法；目前分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多組分抗生素，首選該法測效價(jià)。--該法缺陷：操作步驟多，時(shí)間長，誤差大。第三節(jié)氨基糖苷類45第四十五頁，共61頁。HPLC法有紫外吸收—紫外、熒光檢測器無紫外吸收—衍生化；電化學(xué)檢測器或蒸發(fā)光散射法第三節(jié)氨基糖苷類46第四十六頁，共61頁。第四節(jié)四環(huán)素類ABCD123456789101112四個(gè)并苯或萘并萘47第四十七頁，共61頁。1）兩性：

-OH→酸性N(CH3)2→堿性

Ca2+、Mg2+生成不溶性鹽；Fe3+形成紅色配合物；Al3+形成黃色配合物；pH3~7.5多價(jià)陽離子與酚二酮→熒光

與酸、堿均可成鹽；臨床多用鹽酸鹽；強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中溶解度↑

2）旋光性3）與金屬離子絡(luò)合(酚羥基、烯醇基)第四節(jié)四環(huán)素類48第四十八頁，共61頁。4）UV和熒光鹽酸土霉素經(jīng)酸或堿降解，呈綠色熒光，加熱轉(zhuǎn)為藍(lán)色；鹽酸金霉素經(jīng)堿降解，呈藍(lán)色熒光；鹽酸四環(huán)素經(jīng)堿降解，呈黃色熒光?？蓞^(qū)別不同四環(huán)素類抗生素49第四十九頁，共61頁。弱酸性（pH2-6）A環(huán)C-4異構(gòu)化差向四環(huán)素酸性（pH<2）C環(huán)脫水脫水四環(huán)素堿性C環(huán)開環(huán)，形成內(nèi)酯異四環(huán)素5）不穩(wěn)定性A.差向異構(gòu)化藍(lán)色熒光淡黃→黑第四節(jié)四環(huán)素類50第五十頁，共61頁。AApH2.0~6.0（氫鍵，土霉素、多西環(huán)素不易差向異構(gòu)化）第四節(jié)四環(huán)素類51第五十一頁，共61頁。B.酸性脫水降解λmax=445nmλmax=435nmDDDCBBCBC第四節(jié)四環(huán)素類52第五十二頁，共61頁。C.堿性脫水降解OH-第四節(jié)四環(huán)素類53第五十三頁，共61頁。1、HPLC2、TLC(正相分配薄層色譜)薄層板中加入EDTA→克服痕量金屬造成的拖尾現(xiàn)象3、IR4、UV：最大吸收波長和制定濃度下的吸光度；5、顯色法濃硫酸三氯化鐵第四節(jié)四環(huán)素類54第五十四頁，共61頁。55第五十五頁，共61頁。1.有關(guān)物質(zhì)——HPLC2.雜質(zhì)吸光度——UV淡黃色→黑色脫水四環(huán)素橙