第十六章放射性核素在分子生物學(xué)研究中

第十六章放射性核素在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用

第一節(jié)概述

分子生物學(xué)是研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能的一門學(xué)科。自從1953年Watson與Crick提出DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型以來，基因的分子生物學(xué)迅猛發(fā)展，并于20世紀70年代建立了基因工程技術(shù)。這項技術(shù)與DNA序列分析技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，使人們得以在分子水平來揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)，并且促進了工農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展，成為新技術(shù)革命的重要支柱，20世紀被稱為生命科學(xué)的世紀,生命科學(xué)的發(fā)展成果已經(jīng)影響到人們生活的各個方面,并正在改變著社會的未來。隨著人類基因組計劃的完成和其他生物和植物基因組計劃的開展與完成，有關(guān)蛋白功能的研究更加引起人們的關(guān)心。在這方面的研究中，同位素技術(shù)仍然發(fā)揮著巨大的作用。在分子生物學(xué)的發(fā)展過程中，放射性核素示蹤技術(shù)起到了十分重要的作用。早在1952年，Hershey就利用32P標記的磷酸和35S標記的氨基酸作示蹤劑，培養(yǎng)產(chǎn)生含32P標記DNA和35S標記外殼蛋白質(zhì)的噬菌體，然后用這種標記噬菌體感染未標記的大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)在細菌內(nèi)復(fù)制產(chǎn)生的子代病毒中含有大量32P，而不含35S，從而證實，病毒遺傳信息攜帶者是大分子DNA而非蛋白質(zhì)。Meselson和Stahl用15NH4Cl培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，再利用超速離心方法證實，大腸桿菌繁殖過程中，子代細菌中DNA雙螺旋分子的一條鏈是由親代直接而來，另一條鏈是新合成的，DNA復(fù)制具有半保留特性。mRNA的首次分離及mRNA信息來自DNA也是應(yīng)用同位素標記技術(shù)證實的。值得一提的是Nirenberg等的實驗，他們首先人工合成由A、U、G、C中1～3種隨機組成的多種三核苷酸，然后獲得20種14C或3H標記的和非標記的氨酰基-tRNA。這樣，在含有一個核糖體、所需研究的三核苷酸和14C或3H標記的20種氨酰基-tRNA中的某一種及其他19種非標記氨?；?tRNA所組成的反應(yīng)系統(tǒng)中，可以尋找出某種氨基酸與某種三核苷酸之間的對應(yīng)關(guān)系，以三核苷酸代表mRNA上的一個密碼，即可以確定大部分三核苷酸密碼子的意義。核酸序列分析和核酸分子雜交中最常用的示蹤手段是放射性核素示蹤，盡管PCR技術(shù)的發(fā)展，可以用其他標記物作為研究手段，但同位素仍然有其不可替代性。

第二節(jié)核酸標記技術(shù)核酸結(jié)構(gòu)分析研究中，常用放射性核素示蹤技術(shù)；1975年以前，常用的放射性核素是3H和14C，而其后，32P標記物得到了廣泛的應(yīng)用，使得核苷酸順序分析趨于微量化與簡便化。35S也是常用的放射性核素之一，盡管S并非核苷酸中所含核素，但它與氧元素同屬一族，?？捎脕泶嫜踉?。20實世紀90年代開始應(yīng)用新型放射性核素33P。表16-1是幾種核素之間的物理特性比較。32P射線較強，容易檢測；但輻射危害較大，半衰期較短，使用期較短，更主要的是電泳自顯影條帶有一些擴散，影響分辨率。而35S射線較弱，電泳后放射性自顯影條帶細窄而又清晰，分辨率高；但在自顯影前必需先用酸固定凝膠，洗去變性劑尿素，再抽干凝膠。33P有其優(yōu)越性，它的能量和半衰期居中，因而在制備高比活度的標記化合物時，無需特殊保護設(shè)備，使用也安全。由于它的能量比32P弱，相當(dāng)于32P的1／5；盡管半衰期比32P約長一倍，但比35S短，因而在放射性自顯影時，曝光時間適中，并且無需事先抽干凝膠，方便易行。此外125I也是常用的放射性核素。應(yīng)用時可以根據(jù)需要和可能，選用適當(dāng)?shù)姆派湫院怂?。?6-l幾種放射性核素物理性質(zhì)比較32P33P35S射線β—β—β—半衰期（d）142587最大能量（MeV）1.70.250.17條帶分辨率擴散較好清晰操作不需固定不需抽干膠需抽干膠、洗尿素結(jié)論較好最好可以一、高放射性比活度的［γ-32P］ATP與［α－32P］dNTP的制備［γ-32P］ATP與［α-32P］dNTP是32P標記核酸的最重要的化合物，圖16-1是ATP分子結(jié)構(gòu)示意圖。αβαβγγ圖16-1ATP分子結(jié)構(gòu)示意圖標記時是把三磷酸核苷分子中α或γ位置上的P原子用32P替換下來。為了獲得高放射性比活度化合物，常利用酶促反應(yīng)并加上無載體32P來合成［γ-32P］ATP。反應(yīng)式如圖16-2所示。

圖16-2［γ-32P］ATP合成反應(yīng)式這是利用生物體內(nèi)糖代謝的反應(yīng)來合成所需要的［γ-32P］ATP。其中第1步為不可逆反應(yīng)，而第2步是可逆反應(yīng)，如果在反應(yīng)體系中加入過量ATP，將使反應(yīng)逆轉(zhuǎn)，而得不到所需產(chǎn)物。此反應(yīng)一般在半小時內(nèi)即可完成，用EDTA終止反應(yīng)。為了提高放射性比活度，目前對這一反應(yīng)體系作了一定的修改，即不用氧化染料，而以丙酮酸及乳酸脫氫酶反應(yīng)代替，以便維持較高濃度的NAD+；同時，改用L-α-甘油磷酸為起始底物，并在反應(yīng)體系中加入L-α-甘油磷酸脫氫酶和三糖磷酸異構(gòu)酶，生成中間產(chǎn)物D-甘油醛-3-磷酸，此化合物在水中不易水解，從而提高了［γ-32P］ATP比活度。一般來說，此標記方法在各實驗室中均可進行，因為反應(yīng)試劑較簡單，所用的酶又可從兔肌肉中獲得，而無載體32P也可以商業(yè)供應(yīng)。當(dāng)然,也有商品供應(yīng)的［γ-32P］ATP。［γ-32P］ATP經(jīng)過酶促反應(yīng)，可以用來合成[α-32P]ATP或其他的［α-32P］dNTP。即利用多核苷酸激酶促使［γ-32P］dNTP與NP3或dNP3＇（N為A，G，C，T）反應(yīng)，使dNP3＇在5＇端加上32P而形成32PdNP3＇，再用核酸水解酶P1水解3＇-磷酸，使32PdNP3＇變成32PdN，然后用肌激酶和丙酮酸激酶使之磷酸化，生成PP32PdN即［α-32P］dNTP,見圖16-3。反應(yīng)結(jié)束后用離子交換樹脂純化獲得[α-32P]dNTP。通過上述反應(yīng)，所獲得的［γ-32P］ATP的比活度可達到7.4×1013Bq／mmol，［α-32P］dNTP可達3.7×1013Bq／mmol，符合核酸序列分析和進行探針制備用于核酸分子雜交的要求。[γ-32P]ATP+Np3＇或[γ-32P]ATP+dNP3＇(N:A、G、C、T)↓(多核苷酸激酶)32PNP3＇或32PdNP3＇(5＇端為32P)↓(核酸水解酶P1)32PN或32PdN↓(肌酸激酶，丙酮酸激酶)pp32PN[α-32P-NTP]或pp32PdN[α-32P-dNTP]圖16-3[α-32P-NTP]或[α-32P-dNTP]合成示意圖二、35S標記核苷酸如本節(jié)前所述，35S標記物也有其優(yōu)點，與32P相比，其自顯影圖像清晰，容易分辨。因為硫元素在核苷酸中并不存在，但它與氧元素同屬一族；因此，將核苷酸分子中α位的磷酸上一個氧原子用硫原子代替，就可以得到相應(yīng)的硫代核苷酸類似物，其化學(xué)性質(zhì)和生物活性基本不變。如應(yīng)用［α-35S］dATPαs進行標記的末端終止法測序，效果較好。目前還有商品供應(yīng)的［α-35S］dCTPαs，用來做核酸分子雜交的探針。三、125I標記核酸核酸（包括DNA和RNA）在三氯化鉈（TlCl3）存在下加熱，125I與胞嘧啶環(huán)上5位碳原子形成穩(wěn)定共價鍵，胞嘧啶變成5-125I-胞嘧啶，這個化合物很穩(wěn)定。用SephadexG-50層析柱分離，可以獲得純化的碘標記核酸。因為此法標記核酸較簡便，而不影響核酸生物活性，125I又容易探測，因此作一簡要介紹。四、核酸的酶法標記相對于早期的化學(xué)標記法，核酸的酶標法是一個革命性的進步，它具有以下特點：①操作方便快捷；②酶法標記對核苷酸分子基因沒有任何化學(xué)修飾作用，因而它不會改變核酸分子鏈的化學(xué)組成和生化性質(zhì)；③由于酶的催化反應(yīng)的特異性，決定了其標記位置具有高度特異性，便于人工控制；④標記產(chǎn)物放射性比活度高，因而可以大大提高生物樣品檢測時的靈敏度，這也是它的最大優(yōu)點。核酸的酶標記法很多，可以是DNA或RNA全鏈標記，也可以是DNA或RNA分子的末端標記；末端標記又可分為3＇末端和5＇末端標記法兩種,見表16-2。下面就各種方法的原理、所用的酶、底物及主要步驟作逐個介紹。表16-2核酸的酶法標記標記位置標記方法DNA標記RNA標記全鏈標記切口平移法(DNA聚合酶Ⅰ)SP6RNA聚合酶隨機寡核苷酸引導(dǎo)的cDNA標記(Klenow酶)T7RNA聚合酶通用引物指導(dǎo)的cDNA標記(Klenow酶)大腸桿菌RNA聚合酶與單鏈RNA互補的DNA標記(逆轉(zhuǎn)錄酶)PCR3＇末端標記Klenow酶催化的雙鏈DNA3＇末端標記(Klenow酶)T4RNA連接酶催化的RNA3＇末端標記噬菌體T4DNA聚合酶催化的雙鏈DNA3＇末端標記(噬菌體T4DNA聚合酶)末端轉(zhuǎn)移酶催化的3＇末端標記(末端轉(zhuǎn)移酶)5＇末端標記噬菌體T4多核苷酸激酶催化的DNA5＇末端標記(T4多核苷酸激酶)T4多核苷酸激酶催化的5＇末端標記突變了的無3＇磷酸酶活性的T4多核苷酸激酶催化的5＇末端標記（一）DNA全鏈標記DNA全鏈標記是在整條DNA鏈上都有放射性核素原子摻入，因而放射性比活度高，常用來制備DNA分子探針，根據(jù)所用酶的不同，又分為以下幾種方法：1．切口平移法切口平移法（nicktranslation）的原理是：待標記的DNA分子中的一條鏈在鎂離子存在的情況下，在少量大腸桿菌DNA酶I（DNaseI）的作用下，被切出若干個缺口（nick）從而暴露出3＇-OH端，然后在大腸桿菌DNA聚合酶I的5＇→3＇方向外切功能作用下，這個缺口3＇方向的核苷酸逐個被切下；而同時，反應(yīng)體系中的4種dNTP（其中包括最少1種[α-32P]dNTP）在大腸桿菌DNA聚合酶I的5＇→3＇方向聚合功能作用下，以另一條DNA鏈為模板，按堿基互補原則填補缺口并逐一向3＇方向平移（translation）。因此，放射性標記前體[α-32P]dNTP不斷摻入DNA鏈，且DNA序列沒有改變。最終得到標記上32P的全鏈DNA。本法的關(guān)鍵是大腸桿菌DNA聚合酶I所具有的雙重功能。經(jīng)過此法標記的DNA，在經(jīng)過變性與復(fù)性后，DNA單鏈的長度變短。一般而言，加入的DNaseI量過大時，所獲得的探針片段偏小。切口平移法除用32P標記的dNTP外，也可以用3H、14C標記的dNTP或125I標記的dCTP。圖16-4是用切口平移法標記全鏈DNA的示意圖，通過此法獲得的DNA探針的放射性比活度可達4×1O9～4×1O11Bq／μg。圖16-4切口平移法(DNA聚合酶Ⅰ)DNA全鏈標記2.隨機寡核苷酸引導(dǎo)的cDNA標記此法是使用人工合成的各種堿基組合的寡核苷酸（長度一般6～12個核苷酸），將它們與單鏈DNA模板混合，其中必定有可與模板DNA雜交的片段，此片段即可起引物作用；使用[α-32P]dNTP作前體，在DNA聚合酶作用下，合成DNA探針,見圖16-5。合成時一般使用1種標記dNTP和3種非標記dNTP作前體；所使用的酶是大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)過枯草桿菌蛋白酶處理后形成的Klenow片段，它保留有5＇→3＇聚合酶活性和3＇→5＇外切酶活性,見圖16-6。所用的寡核苷酸一般有商品供應(yīng)。用此法獲得的DNA探針的放射性比活度可達3×1O9～4×1O10Bq／μg。圖16-5隨機寡核苷酸引導(dǎo)的cDNA全鏈標記圖16-5Klenow酶生成示意圖3.通用引物指導(dǎo)的cDNA標記噬菌體M13以單鏈環(huán)狀形式存在，在它的DNA序列中有一稱為多克隆位點的片段，在此片段上有一系列限制性內(nèi)切酶切點，外源性的DNA可以插入該區(qū)域，臨近多克隆位點的3＇端存在一個LacZ基因區(qū)，制備與該基因上一小段DNA互補的片段作為引物（即通用引物），在Klenow酶作用下，以插入的外源性DNA（即感興趣序列）為模板，以1種［α-32P］dNTP和3種非標記dNTP為前體，從通用引物的3＇端開始合成cDNA,見圖16-7。合成過程結(jié)束后使用限制性內(nèi)切酶消化，并用凝膠電泳方法分離并獲得標記的DNA片段。圖16-7在M13重組DNA上制備標記DNA4.與單鏈RNA互補的DNA標記合成與mRNA互補的DNA通常使用兩種引物，如果所用mRNA模板3＇端具有PolyA結(jié)構(gòu)，就可以用人工合成的寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸（Oligo-dT）作為引物；如果沒有PolyA結(jié)構(gòu)，則要使用隨機引物。使用前一種引物的缺點是所得到的探針可能含有一段不需要的DNA序列。在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以1種[α-32P]dNTP和3種非標記的dNTP作前體，以mRNA為模板，合成得到標記的cDNA,見圖16-8。圖16-8與單鏈RNA互補的DNA全鏈標記為了獲得對感興趣mRNA的高度放射性比活度的cDNA探針，通常在標記時加大mRNA模板用量，或是富集感興趣的mRNA序列作為模板。如果所得到的探針是用于篩選cDNA文庫，那么感興趣片段所標記到的放射性核素必須大于106Bq。值得注意的是獲得的高比活度探針很容易因為輻射裂解而損傷破壞，因此探針制備后應(yīng)立即使用。（二）RNA全鏈標記合成高放射性比活度的單鏈RNA探針需要經(jīng)過改造的含有多克隆位點的質(zhì)粒載體；所用的酶有兩種：一種是SP6RNA聚合酶，它是SP6編碼的以DNA為模板的RNA聚合酶，具有極強的啟動子特異性，即只能特異性地轉(zhuǎn)錄SP6啟動子下游的DNA；另一種是T7和T3RNA聚合酶，同樣它也有啟動子特異性，只能特異性地轉(zhuǎn)錄噬菌體T7和T3啟動子下游的DNA。如果在質(zhì)粒的多克隆位點插入一條所需檢測的DNA序列片段，此時，將啟動子（如SP6啟動子或T7啟動子）插入質(zhì)粒的多克隆位點的上游，這樣在相應(yīng)的RNA聚合酶作用下，以插入的靶DNA為模板，轉(zhuǎn)錄合成RNA。如果所用的4種rNTP底物中有1種是［α-32P］rNTP，就可以得到與靶DNA片段互補的具有高比活度的標記RNA。用本法制備RNA探針具有其優(yōu)越性：首先，用此法標記RNA的效率遠遠高于單鏈DNA探針制備法，因為合成RNA的DNA模板可以被轉(zhuǎn)錄多次，RNA的產(chǎn)量可以數(shù)倍于模板DNA的量。其次，用此法制備高比活度的RNA探針相對價格便宜，因為RNA聚合酶功能在底物低達l～20μmol時，仍然保持其活性。第三，RNA探針無須經(jīng)過凝膠電泳高度純化。第四，用此法制備的RNA探針在雜交時具有較高的敏感性，一般要比大小和比活度相同的DNA探針敏感2～10倍。RNA的全鏈標記，還可以用大腸桿菌RNA聚合酶非特異性地把靶DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，獲得放射性比活度1010Bq／μg的32P標記RNA。（三）DNA末端標記法DNA分子的末端可以在適當(dāng)?shù)拿缸饔孟?，標記上放射性核素。此法常用于限制性?nèi)切酶圖譜分析、化學(xué)法DNA序列分析。下面作一簡要介紹。1．Klenow酶催化的雙鏈DNA3＇末端標記此法相似于引物指導(dǎo)的cDNA合成，要求待標記的雙鏈DNA-端的5＇末端突出，而相應(yīng)的3＇末端縮進，并含有羥基結(jié)構(gòu)。在反應(yīng)體系中加入Klenow酶，并加入1種［α-32P］dNTP，加入的這種標記dNTP，由5＇突出末端的序列決定（根據(jù)堿基配對原則）。如果沒有這種粘性末端，則經(jīng)過某種限制性內(nèi)切酶切割所需要的末端。如選用EcoRI切割產(chǎn)生粘性末端，就可以在反應(yīng)體系中加入標記的dATP或dTTP，在3＇末端標上32P。見下面兩式：如果我們選用限制性內(nèi)切酶BamHI切割產(chǎn)生相應(yīng)的粘性末端，則可以在反應(yīng)體系中加入[α-32P]dGTP，從而在3＇末端標上32P，見下式。

而對于鈍性末端的標記，則需要通過在3＇-OH末端進行核苷酸置換反應(yīng)，來標記上32P。見下式。標記反應(yīng)可以在用DNA限制性內(nèi)切酶消化后立即進行，而不必去除限制性內(nèi)切酶，因為Klenow酶工作條件要求低，適應(yīng)性強。當(dāng)標記產(chǎn)物是用于Maxam-Gilbert法進行DNA序列分析時，加入到反應(yīng)體系中的標記dNTP應(yīng)當(dāng)達到最大量，反應(yīng)過后還需加入適量的4種未標記的dNTP，以便使得到的標記DNA分子一樣長。

2.噬菌體T4DNA聚合酶催化的雙鏈DNA3＇末端標記T4DNA聚合酶與Klenow酶一樣，可以用來標記具有3＇粘性末端的DNA分子。但是T4DNA聚合酶具有極強的3＇→5＇外切酶活性，因而常用來標記3＇末端突出的雙鏈DNA分子。見下式:在使用DNA限制性內(nèi)切酶消化DNA分子后，限制性內(nèi)切酶要從反應(yīng)系統(tǒng)中去除，然后再進行末端標記。

3.末端轉(zhuǎn)移酶催化的3＇末端標記

末端轉(zhuǎn)移酶可以催化DNA分子3＇-OH端接上。α-32P標記的同源多聚核苷酸，其中α-32P標記的核苷酸的數(shù)量可以從1個到數(shù)十個。被催化的DNA分子既可以是單鏈，也可以是雙鏈。

4.噬菌體T4多核苷酸激酶催化的DNA5＇末端標記噬菌體T4多核苷酸激酶催化DNA5＇末端的32P標記有兩條途徑，一為正向反應(yīng)（forwardreaction），即DNA5＇末端的磷酸被堿性磷酸激酶催化而失去，形成DNA的5＇－OH末端，然后，經(jīng)過T4多核苷酸激酶作用，將[γ-32P]dATP中的32P連接到DNA5＇－OH末端上形成5＇末端標記的DNA分子。見下式:另一條途徑是交換反應(yīng)（exchangereaction），即DNA5＇末端的磷酸在T4多核苷酸激酶作用下轉(zhuǎn)移到外來的ADP分子上；然后仍在T4多核苷酸激酶作用下，將［γ-32P］dATP中γ-32P轉(zhuǎn)移到DNA5＇末端，形成5＇末端標記的DNA分子。見下式:（四）RNA末端標記1．T4多核苷酸激酶催化的5＇末端標記T4多核苷酸激酶（T4PNK）同樣可以催化ATP分子中γ-P轉(zhuǎn)移到RNA5＇-OH末端。但是因為T4PNK還具有3＇磷酸酶活性，將使3＇末端為磷酸的RNA變性，故標記時選用一種突變了的無3＇磷酸酶活性的T4多核苷酸激酶，催化[γ-32P]ATP中的γ-32P標記到RNA5＇末端，而又不影響RNA活性。2．T4RNA連接酶催化的RNA3＇末端標記T4RNA連接酶可以將放射性前體5＇32PCp連接到RNA3＇-OH末端上；此標記技術(shù)在RNA指紋圖譜實驗和序列分析研究中非常有用。以上逐一介紹了各種放射性核素核酸標記技術(shù)，根據(jù)使用標記核酸的目的不同，可以選用不同的方法。核酸的放射性標記技術(shù)已經(jīng)成為核酸序列分析技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)和基因工程技術(shù)的重要組成部分。放射性核素在分子生物學(xué)發(fā)展中起到了極其重要的作用，并仍然發(fā)揮其特殊的作用；它的高度靈敏性仍然是其他標記示蹤物所無法超越的。但它也有缺陷，如半衰期短，有放射性危害，操作麻煩，時間長。因而，近年來人們發(fā)明了許多非放射性標記物。如用熒光素代替放射性核素；采用夾心法，在核酸上標記生物素，再利用生物素-親和素-酶聯(lián)結(jié)催化底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光來代替放射性核素的自顯影，這種化學(xué)發(fā)光法靈敏度極高，可以快速操作，這是未來發(fā)展的方向之一。

第三節(jié)放射性核素在核酸序列分析中的應(yīng)用核酸序列分析是分子生物學(xué)研究中最重要的技術(shù)之一。它的目的在于測定出核酸（DNA和RNA）的核苷酸排列順序。它又分為DNA序列分析和RNA序列分析。由于DNA序列分析技術(shù)的建立，人們對DNA的認識深入到了核苷酸水平，對基因結(jié)構(gòu)與功能的研究起著十分重要的作用，也為一些分子病的發(fā)病機制和基因治療研究提供了依據(jù)。目前，DNA序列分析方法有許多種，如化學(xué)切割法、加減法、末端終止法、連續(xù)測定法、M13克隆載體法、熱循環(huán)測序、固相測序等。盡管方法不同，但有兩點是共同的，首先是這些方法都使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，因為它具有極強的分辨率，即使兩分子只相差一個核苷酸，也能在凝膠上形成兩條分開的帶；其次，這些方法都需要經(jīng)過不同的處理，得到一系列長度只相差一個核苷酸的單鏈DNA分子。一般DNA序列分析時，所要分析的DNA分子不能太大，長度在400b左右的分子較理想。目前,由于技術(shù)的進步和分析儀器的發(fā)展與成熟,在分子生物學(xué)實驗室尤其是一些國家實驗室,都可以進行快速和高通量的測序分析，如用基因芯片技術(shù)。下面介紹幾種常用的DNA序列分析技術(shù)：一、化學(xué)切割法DNA序列分析

此法可以對雙鏈DNA進行序列分析，也可以分析單鏈DNA。首先要對待測的DNA片段進行末端標記（3＇或5＇），標記方法如本章第二節(jié)所述；然后用變性拆鏈的方法，將雙鏈DNA在30％二甲基亞砜（DMSO）中熱變性，再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳拆鏈的方法，將DNA雙鏈分開成兩條單鏈；或者用酶切方法將標記過的DNA切成兩段，這樣就得到了只有一端（3＇或5＇端）標記過的樣品。將樣品分別同時進行4種修飾與切割反應(yīng)，它們是G，G十A，C和C十T。一般使用硫酸二甲酯使A和G兩種嘌呤甲基化，用肼使C和T兩種嘧啶變?yōu)殡?，然后使用試劑將修飾過的堿基切掉。例如，在G反應(yīng)中，所有的G都有可能被切割掉，但就某一個（或一些）分子來說，只有某一個或某幾個G被切割掉；因而在G反應(yīng)中存在不同位置上的G被切割的、從標記的一端算起具有各種長度的DNA分子，同理，其他3個反應(yīng)也如此。將經(jīng)化學(xué)切斷的樣品變性，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，樣品在凝膠上的遷移率按片段所含核苷酸的多少自下而上排列。電泳后作放射自顯影，同樣自下而上讀每一條帶，得到DNA序列。應(yīng)當(dāng)注意在C和C＋T兩個反應(yīng)中，同時出現(xiàn)的帶應(yīng)讀為C，只在C＋T中出現(xiàn)的帶讀作T，同樣，在G和G十A反應(yīng)中，同時出現(xiàn)的帶讀作G，只在G＋A中出現(xiàn)的帶讀為A。本法實驗要求不高，試劑容易購得，但目前尚無特異性較高的切斷A或T的反應(yīng)，所以這兩個堿基不易直觀顯示出來。二、雙脫氧核苷酸鏈終止法作DNA序列分析

它的基本原理是：在引物存在下，利用Klenow酶5＇→3＇的聚合酶活性在單鏈DNA模板上合成互補鏈，如果反應(yīng)體系中加入ddNTP（即2＇，3＇-雙脫氧核糖核苷三磷酸），它同樣可在酶作用下?lián)饺胄潞铣傻逆?，但因為ddNTP3＇位置上沒有羥基，這條鏈合成到此終止。實驗時，首先將欲檢測的單鏈DNA模板接上引物，然后將樣品分成4組，每組中含Klenow酶，4種dNTP（其中1種是［α-32P］dNTP），4種ddNTP中的一種。以加ddATP為例，當(dāng)遇到模板堿基為T時，反應(yīng)系統(tǒng)中ddATP和dATP都可摻入新鏈，前者摻入時則鏈合成終止，后者摻入時，則繼續(xù)進行鏈的合成。ddATP摻入是隨機的，因此可以得到一系列不同長度的以ddATP為末端的DNA片段。其余3組反應(yīng)以此類推。把4組反應(yīng)綜合起來，我們就可以得到長度只相差一個核苷酸的一整套DNA分子，將反應(yīng)得到的DNA變性后電泳，并用凝膠直接作放射自顯影，就可以得到自顯影帶，而每一條帶都代表一定長度的單鏈DNA分子，由低向高逐條解讀就可以得到DNA序列。值得注意的是這個解讀出來的序列不是所需分析的那條DNA鏈的序列，而是其互補鏈的序列。三、M13載體-鏈終止法作DNA序列分析

當(dāng)要分析某一較長的DNA序列時，必須要作出詳細的酶切圖譜，并把DNA切成長度為300b左右的短片段，再克隆到M13載體中去，經(jīng)過轉(zhuǎn)化得到重組克隆，將這些克隆進行懸液培養(yǎng)，從菌體中提取RF型DNA，通過酶切和電泳，確定各個克隆中所含的外源DNA片段，從上清液中提取單鏈DNA用于序列分析。這一過程稱為單鏈DNA制備。在M13克隆載體中，在克隆部位的3＇端有一長度為17b的特殊序列，使用人工合成的一段互補寡核苷酸與之退火，即成為Klenow酶合成反應(yīng)的引物。然后用鏈末端終止法測序，獲得插入DNA的核苷酸順序。四、固相法DNA序列分析該方法特點是將DNA模板固相化后，在載體上直接進行測序反應(yīng)。其原理是先將雙鏈DNA模板分子的一條鏈與生物素聯(lián)接。如用PCR擴增，擴增時在一個引物上連著生物素，這樣形成的雙鏈中有一條5＇端帶有生物素，然后DNA-生物素與親和素——碳鐵磁粉結(jié)合（即固相化），經(jīng)過堿變性，可將不含生物素的互補鏈分開。并用磁鐵將其與固相化DNA-生物素鏈分開。再以這條固相化的DNA鏈為模板，進行雙脫氧法測序反應(yīng)，生成互補的不同長度的DNA片段，再經(jīng)過解鏈、電泳和放射性自顯影，即可確定模板DNA序列。該方法也適用于非同位素標記的DNA測序（如以生物素引物為標記）。目前固相化的技術(shù)有多種，并發(fā)展成適于自動化分析。五、RNA序列分析的特點

RNA序列分析的建立比DNA序列分析早十年，但其發(fā)展速度卻遠不如后者，主要原因在于缺乏像DNA限制性內(nèi)切酶那樣能識別4～6個堿基的工程酶。RNA序列分析常用兩種方法，一種是核酸酶法，應(yīng)用前面所述方法進行待測的RNA片段3＇或5＇末端32P標記，然后將樣品分成數(shù)份，分別用一些堿基特異性酶酶解，再進行電泳和放射自顯影，而在感光膠片上讀出RNA堿基順序。另一種方法是化學(xué)切割法，此法與DNA化學(xué)測序十分相似，但只對3＇末端標記的RNA片段分析效果較好。有人提出將RNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄合成與之互補的DNA片段，再應(yīng)用DNA序列分析法快速分析，并反推測出RNA序列。RNA序列分析目前可以選擇一些新方法如大型生物質(zhì)譜解析和基因芯片技術(shù)等。六、核酸序列分析的應(yīng)用

DNA序列分析的快速與自動化，使得人們可以對任何欲知其堿基順序的DNA進行分析檢測?？茖W(xué)家已經(jīng)完成了一項浩大的工程，即將人類全部基因組進行序列分析，建立完整的基因DNA圖譜，并研究基因的調(diào)控機制，以揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)。人類遺傳性疾病大部分是由于基因的點突變所致，通過對其DNA序列進行分析，就可以找出其突變點，從而可以對這些遺傳性疾病進行產(chǎn)前診斷，甚至進行基因治療。

DNA序列分析技術(shù)在癌癥的發(fā)生學(xué)研究中起著重要作用，通過對癌基因的分析，使人們逐漸認識了癌基因的來源與本質(zhì)，以及它對細胞生長和分化的作用，進而認識到原癌基因在細胞惡變過程中所起的作用。DNA序列分析技術(shù)還可用于傳染性疾病如愛滋病、傷寒病的定性診斷，通過此分析技術(shù)可以制備相關(guān)疾病的診斷用DNA探針。DNA序列分析技術(shù)也用于一些生物學(xué)活性制品如rlL、γ-IF的制備，將這些大分子的基因進行序列分析后，才能進行重組和生產(chǎn)?？傊瓺NA序列分析技術(shù)是分子生物學(xué)中一項重要的技術(shù)手段，分析的方法仍在不斷改進之中，以便更加迅速、簡便。

第四節(jié)核酸分子雜交技術(shù)及應(yīng)用核酸的分子雜交是探測某種特異DNA或者RNA片段的一種常用方法，也可以進行半定量分析。分子雜交既可以發(fā)生在DNA與DNA之間，也可以發(fā)生在DNA與RNA之間。一、分子雜交的原理DNA分子是一雙螺旋結(jié)構(gòu)，其兩條互補鏈通過配對堿基之間的氫鍵和疏水鍵聯(lián)結(jié)在一起，當(dāng)受到熱、酸、堿等作用時，氫鍵和疏水鍵受到破壞，雙鏈的DNA分子解聚變成兩條無定形的單鏈，稱之為DNA變性（denaturation）。

變性的DNA在適當(dāng)條件下，兩條單鏈又可以重新結(jié)合在一起，并形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)性（renaturation）。如果在反應(yīng)溶液中的兩條單鏈核酸分子來自不同物種或品系，只要它們的堿基序列是同源或部分同源，即一條核苷酸單鏈的堿基順序全部或部分與另外一條核苷酸單鏈上的堿基依次相互配對，則在一定條件下即可以復(fù)性，形成復(fù)合物，這就是核酸的分子雜交。二、探針的制備及要求

所謂探針就是一個與我們所要鑒別的核酸分子（如DNA或RNA）具有同源性序列、能互補結(jié)合、并用放射性核素或其他標記物標記過的DNA或RNA片段。探針的放射性核素標記方法在本章第二節(jié)有詳細介紹，而所用的DNA用以下方式獲得：①已知某簡單基因序列所表達的產(chǎn)物的氨基酸序列，利用三聯(lián)密碼合成相應(yīng)的DNA片段；②如果已知基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，則通過反轉(zhuǎn)錄酶合成DNA；③如果已知基因中一小段DNA的序列，則可利用此片段DNA為探針，在基因庫中找到有關(guān)基因（大分子DNA）并用來制作基因探針；④已知一些大分子蛋白質(zhì)的氨基酸序列，利用三聯(lián)密碼，以相應(yīng)的核苷酸順序合成一小段DNA作探針，然后從基因庫中篩選出所需要的基因克隆，用來制作基因探針；⑤通過PCR擴增獲得所需DNA片段。一般來說，探針用量并不大，為了避免無關(guān)的雜交反應(yīng)，探針用的DNA或RNA必須先經(jīng)過純化。分子克隆技術(shù)對探針純化非常有益。探針必須具有高放射性比活度，只有這樣才有可能靈敏地探測出未知核酸分子中的特異片段。值得注意的是在利用探針進行臨床診斷時，其靈敏度最多只能檢測到103～104拷貝的靶分子，且技術(shù)復(fù)雜，遠遠不能達到要求。因此，目前已發(fā)展了幾種擴增系統(tǒng)，將靶序列和探針分子，增加106或更多倍，并常與非放射性檢測系統(tǒng)相結(jié)合，可檢測出1～10個靶分子的存在。常見的靶序列擴增方法有：聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、轉(zhuǎn)錄依賴的擴增系統(tǒng)（TAS）、自主序列復(fù)制系統(tǒng)（3SR）和連接酶鏈反應(yīng)（LCR）；探針擴增方法有Qβ復(fù)制酶系統(tǒng)；此外為了提高靈敏度，發(fā)展了探針網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)信號放大系統(tǒng)。所謂PCR就是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的方法。它擴增DNA片段的特異性由兩個人工合成的寡核苷酸引物的順序決定，這種引物與待擴增片段兩條鏈的兩端DNA序列互補，在適當(dāng)溫度下，耐高溫的TaqDNA聚合酶催化引物引導(dǎo)的以待擴增片段為模板的DNA合成。經(jīng)過反復(fù)的熱變性-復(fù)性-延伸的過程，DNA片段量以指數(shù)增加，達到2n。PCR技術(shù)不僅可以進行定性分析，還可以進行定量分析，并有相應(yīng)的實時定量PCR儀和試劑盒的商品供應(yīng)。目前PCR技術(shù)已廣泛用于檢測核苷酸變異和染色體重排，高效克隆某一基因片段，線粒體和基因組DNA的直接測序，細菌、病毒和寄生蟲所致疾病的診斷，以及分子考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)分子生物學(xué)的研究。三、分子雜交法分子雜交概括起來通常有4個步驟：①制備探針；②使待測樣品變性，易于雜交；③將探針與樣品進行雜交反應(yīng)并漂洗；④作放射自顯影或放射測量。

分子雜交可以分為三大類，即液相雜交、固相雜交和原位雜交。固相與原位雜交更加常用。下面分別介紹：

（一）液相雜交

液相雜交是雜交反應(yīng)在溶液中進行；探針可以是DNA，也可以是RNA；而被檢測的核酸也可是DNA或RNA。雜交反應(yīng)產(chǎn)物是DNA-DNA或者是DNA-RNA。利用羥基磷灰石特異吸附雙鏈核酸而不吸附單鏈核酸的特性，洗去單鏈成分，而獲得雙鏈核酸，達到分離目的。另外也可以采用水解單鏈核酸的酶將單鏈水解掉，而獲得雙鏈核酸，達到分離目的。核醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究中，反義核酸的顯像與治療就是一種發(fā)生在機體內(nèi)的液相雜交。（二）固相雜交將變性DNA（即待測DNA）固定在固體基質(zhì)上，再與探針反應(yīng)，稱為固相雜交。常用的固體基質(zhì)為硝酸纖維膜，它對變性DNA具有高度吸附性，在80℃下烘烤約2h，即可使單鏈DNA牢固地固定在膜上，當(dāng)探針與變性DNA雜交后，結(jié)合的探針也就固定在膜上，而未結(jié)合的探針則被洗去。1．點雜交（dothybridization）待測DNA樣品分別點加在硝酸纖維膜的不同部位，吹干后浸入堿性溶液中，使DNA變性形成單鏈；經(jīng)過中和、預(yù)雜交后干燥；再將此膜轉(zhuǎn)移到雜交液中，此雜交液中含106cpm／mL雜交用探針，65℃保溫約16～24h；雜交后漂洗吸干并將纖維膜和核乳膠片或X片夾在塑料薄膜中進行放射自顯影，然后根據(jù)顯影的斑點判斷出雜交陽性的DNA樣品。該法只能定性而不能定量測定，常用于臨床血液樣品的檢測。2.菌落雜交菌落雜交（insituhybridizationofbacterialcolonies）是將在平皿中培養(yǎng)形成的細菌集落，用吸附法轉(zhuǎn)移到處理過的硝酸纖維膜上，經(jīng)過裂菌和堿變性，使細菌中所有的雙鏈DNA變成單鏈，然后再干燥，進行預(yù)雜交和雜交反應(yīng)；同樣經(jīng)過漂洗\吸干和放射自顯影，陽性雜交反應(yīng)的菌落在膠片上呈黑色。在整個操作過程中，注意必須保持位置不變，以便挑選出陽性反應(yīng)的菌落。本法常用于重組DNA克隆時含某種特定基因片段的細菌集落或菌體空斑的篩選。3.凝膠電泳印跡雜交凝膠電泳印跡雜交（Southernblothybridization）是分子生物學(xué)研究中重要的實驗技術(shù)之一。其基本過程是：待測DNA先經(jīng)限制內(nèi)切酶處理，然后作瓊脂糖凝膠電泳，將大小不同的DNA片段分開，然后用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡凝膠lh，使DNA變性，再用pH7.5的1mol/LTris－HCl緩沖液浸泡lh，以中和堿性。將此膠置于一層濾紙上（濾紙兩端與緩沖液相連），然后在膠的上面蓋上硝酸纖維濾膜，濾膜的上面再加吸水紙。這樣緩沖液便由下層的濾紙吸上來，通過凝膠、硝酸纖維濾膜而進入上面的吸水紙中。凝膠中的DNA就按原樣轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上了，DNA片段位置不變。硝酸纖維素濾膜在80℃下烘烤2h，使DNA牢固地結(jié)合在膜上。以后的步驟與菌落雜交完全一樣，最后獲得放射自顯影膠片。通過放射自顯影帶的分析，即可對待測DNA片段定性，如在電泳時于樣品邊上同時加點已知核酸片段作標準，就可以根據(jù)標準電泳帶的位置求出待測DNA片段分子大小。由本法衍生出類似的RNA和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，分別稱之為Northernblot和Westernblot。在此基礎(chǔ)上，發(fā)展了基因芯片技術(shù)，也是一種固相雜交。（三）原位雜交原位雜交（insituhybridization）是用特定探針在細胞、胞核或者染色體上進行雜交反應(yīng)，然后用放射自顯影或其他方法對雜交結(jié)果進行檢測的技術(shù)。它可以確定與探針互補序列在細胞內(nèi)或染色體上的空間位置。一般應(yīng)用的原位雜交有兩種類型,即與胞內(nèi)DNA的雜交和與胞內(nèi)RNA的雜交。并且可以在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。原位雜交最大的特點是組織細胞經(jīng)過人工處理后，胞膜通透性增加使得探針可以透過膜進入細胞而與胞內(nèi)核酸雜交。因此探針的選擇是很重要的，盡管DNA和RNA的雙鏈或單鏈探針均已成功地用于細胞標本的DNA和RNA原位雜交，但各種探針的效率目前尚不清楚。16～21個核苷酸長的人工合成的寡核苷酸探針可以自由出入厚壁革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、酵母孢子和真核細胞并為靶序列所接受；而幾百個核苷酸的長探針在相同條件下則不能自由出入。因此，短探針在原位雜交中有較大優(yōu)勢。探針的標記物可以是放射性核素，也可以是非放射性化合物，根據(jù)用途不同選擇。3H和35S是最常用的放射性核素。3H半衰期長，使用期長，分辨率高，便于定位；但活性低，只能檢測大基因或多拷貝基因。35S探針的分辨率也高，且活性強，可用于檢測小的基因片段。32P不常用，因為產(chǎn)生的影像相對模糊，分辨率低。目前也有用非放射性化合物半抗原標記的探針用于原位雜交。原位雜交主要用于組織學(xué)、細胞學(xué)的研究，如細胞群內(nèi)很小亞型（subset）中的RNA的檢測，也可用于臨床標本中病毒的檢測，此方面它比膜雜交法更優(yōu)越，因為它只檢測大量細胞中被感染細胞內(nèi)的病毒序列，在光鏡下可以發(fā)現(xiàn)較弱的雜交信號局限在一個很小范圍內(nèi)?？傊?，原位雜交作為新技術(shù)，仍在不斷完善與提高之中。四、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用核酸的分子雜交技術(shù)已經(jīng)廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)與基因工程及腫瘤的基礎(chǔ)理論研究。下面主要介紹幾個用于傳染病與遺傳病的例子：

（一）致病微生物的檢測通過分子雜交技術(shù)，可以檢測一些不能培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的致病菌和病毒，而用于疾病的診斷及致病微生物的流行病學(xué)調(diào)查。如用乙型肝炎病毒HBVDNA探針與患者血清作點雜交，可以知道人體內(nèi)HBV是否仍在繁殖，這比免疫學(xué)檢測技術(shù)更加靈敏，更加準確。新近發(fā)展了許多致病微生物DNA探針，目前有多種試劑盒供應(yīng)。相信這方面的研究應(yīng)用將更加廣泛。

（二）遺傳性疾病的診斷分子雜交技術(shù)為遺傳病診斷提供了強有力的手段，應(yīng)用DNA探針在妊娠早期對一些單基因遺傳病進行早期診斷，成為分子生物學(xué)技術(shù)與臨床醫(yī)療實踐相結(jié)合的典范。1．DNA分子雜交直接診斷此法是將32P標記的探針與從胎兒羊水細胞中提取的DNA直接進行分子雜交，根據(jù)這種雜交能否進行，進行的程度如何，可以確定某種基因的缺失。例如，地中海貧血由α-珠蛋白基因缺失所致，用珠蛋白互補DNA探針診斷就可以判斷胎兒是否患此貧血癥。2．限制性內(nèi)切酶技術(shù)此方法分兩步，先用特定的限制性內(nèi)切酶切割DNA樣品進行凝膠電泳，然后進行分子雜交。如限制性內(nèi)切酶EcoRI，切在G↓AATC部位，可將正常人和α-地中海貧血患者的基因切成不同大小的片段，正常人產(chǎn)生23kb片段，而缺失一個以上堿基時產(chǎn)生19kb片段。據(jù)此可以診斷此病。一般本法只能用于基因缺失型遺傳病的產(chǎn)前診斷，對基因突變的遺傳病則不適用，除非突變點正好在酶切點上，如用限制性內(nèi)切酶Mst↓診斷β-地中海貧血時，它的切點恰是貧血者基因的突變點，從而產(chǎn)生不同的片段。3．限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)許多點突變所致遺傳性疾病，因找不到適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶，因而采用遺傳學(xué)上連鎖的RFLP進行產(chǎn)前診斷。RFLP是指在基因組DNA中限制性內(nèi)切酶識別點所限定的在不同個體中不一致的單拷貝順序，它廣泛存在于人類基因組中，并以顯性方式遺傳。診斷時要先發(fā)現(xiàn)一個特殊的多態(tài)現(xiàn)象與致病基因相連鎖，然后以多態(tài)現(xiàn)象的限制性片段作為遺傳學(xué)標記，利用其與疾病的連鎖關(guān)系，檢出患者或雜合子。4．用克隆的DNA片段間接檢測連鎖的多態(tài)性遺傳病有些遺傳性疾病尚未查明其遺傳基因缺陷，不知其基因底物，這樣就可以根據(jù)某些多態(tài)性DNA片段與遺傳病基因的連鎖關(guān)系，克隆這多態(tài)性片段并制備DNA探針，間接診斷此種遺傳性疾病。例如人們發(fā)現(xiàn)G8DNA片段與Huntington舞蹈病的發(fā)生有某種連鎖關(guān)系，利用G8作探針就以在4號染色體上檢出兩個緊密連鎖的片段。利用此技術(shù)可以在癥狀發(fā)生前診斷此病。（三）足跡法研究DNA與蛋白質(zhì)的相互作用DNaseⅠ足跡