細胞凋亡檢測技術(shù)演示文稿

細胞凋亡檢測技術(shù)演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有71頁\編輯于星期三（優(yōu)選）細胞凋亡檢測技術(shù)現(xiàn)在是2頁\一共有71頁\編輯于星期三1972年:Kerr等首次提出了細胞凋亡的概念，從形態(tài)學(xué)角度描述細胞的生理死亡，并認為這是維持組織細胞動力學(xué)平衡的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，可能具有十分重要的生物學(xué)意義。

1977年:人們注意到在生理或病理性刺激條件下，淋巴細胞發(fā)育過程中的凋亡現(xiàn)象。并認為這是維持組織細胞動力學(xué)平衡的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，可能具有十分重要的生物學(xué)意義。

現(xiàn)在是3頁\一共有71頁\編輯于星期三

1980年:Wyllie研究胸腺細胞在糖皮質(zhì)激素作用下引致的細胞凋亡變化，總結(jié)并建立了細胞凋亡的共同形態(tài)學(xué)特征，包括核固縮和DNA降解成寡核苷酸片段等。

1989年:0wen及其研究小組在研究胸腺細胞陰性選擇過程中，發(fā)現(xiàn)T細胞受體(TCR)與自身抗原相互作用與未成熟T細胞的PCD發(fā)生有關(guān)，并在體外證實剌激CD3分子可誘導(dǎo)未成熟T細胞PCD的發(fā)生。證明了信號傳遞物質(zhì)對PCD的調(diào)控作用?，F(xiàn)在是4頁\一共有71頁\編輯于星期三

1991年:Ellis首先發(fā)現(xiàn)了線蟲(C.elegans)體內(nèi)Ced-3、4兩個基因與PCD的發(fā)生密切相關(guān)，隨后逐漸發(fā)現(xiàn)了多種參與PCD的正相調(diào)節(jié)基因和負相調(diào)節(jié)基因，前者包括Ced-2、p53、c‐myc、Fas、糖皮質(zhì)激素受體及白細胞介素1β轉(zhuǎn)化(ICE〉等基因，后者則有Ced-9、bcl-2、p53等基因.現(xiàn)在是5頁\一共有71頁\編輯于星期三三、細胞凋亡的特征細胞凋亡與細胞壞死雖然都是細胞死亡，但細胞凋亡的形態(tài)及生化特征與壞死性細胞死亡的特點則不同現(xiàn)在是6頁\一共有71頁\編輯于星期三（一）細胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變：組織內(nèi)單個細胞或小團細胞的死亡不引發(fā)細胞自溶，也不引起炎癥反應(yīng)電鏡下可見：凋亡細胞固縮胞漿致密，細胞器密集、退變核染色質(zhì)致密，聚集于核膜處胞核裂解，胞漿形成多發(fā)性芽突凋亡小體形成光鏡下：凋亡小體外被以胞膜，圓形或卵圓形，胞漿濃縮，強嗜酸性，可有可無固縮深染的核碎片?，F(xiàn)在是7頁\一共有71頁\編輯于星期三細胞凋亡與細胞壞死在形態(tài)學(xué)上的差別

細胞凋亡

細胞壞死

單細胞丟失細胞膜發(fā)泡但仍完整,細胞膜內(nèi)陷將細胞分割成凋亡小體不發(fā)生炎癥反應(yīng)被臨近正常細胞或吞噬細胞吞噬溶酶體完整染色質(zhì)均一凝集細胞成群丟失細胞膜不完整,細胞腫脹、溶解發(fā)生嚴重炎癥反應(yīng)被巨噬細胞吞噬溶酶體裂解染色質(zhì)凝集成塊、不均一現(xiàn)在是8頁\一共有71頁\編輯于星期三現(xiàn)在是9頁\一共有71頁\編輯于星期三現(xiàn)在是10頁\一共有71頁\編輯于星期三細胞壞死時核的變化現(xiàn)在是11頁\一共有71頁\編輯于星期三細胞壞死時的炎癥反應(yīng)現(xiàn)在是12頁\一共有71頁\編輯于星期三(二)細胞凋亡的生化改變：凋亡過程中出現(xiàn)的生化改變以DNA的片段化及蛋白質(zhì)的降解最為重要。1)DNA的片段化

組成染色質(zhì)的DNA鏈被激活的核酸內(nèi)切酶切割，可形成180—200bp或其整倍數(shù)的片段，電泳中呈特征灶的“梯”狀條帶，這是判斷凋亡發(fā)生的客

觀指標之一。2)蛋白質(zhì)的降解

凋亡蛋白酶激活，水解細胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞解體并形成凋亡小體、水解相關(guān)活性蛋白，從而使該蛋白獲得或喪失某種生物學(xué)功能?，F(xiàn)在是13頁\一共有71頁\編輯于星期三細胞凋亡與細胞壞死在生物化學(xué)上的區(qū)別

細胞凋亡細胞壞死生理因素誘導(dǎo)非生理因素造成的意外損傷受大分子合成和激活過程的嚴格調(diào)控離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)喪失需要能量不需要能量需要大分子合成不需要核酸和蛋白質(zhì)的合成有新基因從頭轉(zhuǎn)錄沒有新基因轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)非隨機降解為DNA“梯帶”染色質(zhì)DNA隨機降解現(xiàn)在是14頁\一共有71頁\編輯于星期三四、細胞凋亡的過程與調(diào)控

凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡基因激活細胞凋亡的執(zhí)行凋亡細胞的清除(一)凋亡的四個階段：

現(xiàn)在是15頁\一共有71頁\編輯于星期三凋亡誘導(dǎo)因素+受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺死亡信號凋亡基因激活DNase激活Caspase激活巨噬細胞吞噬分解凋亡細胞現(xiàn)在是16頁\一共有71頁\編輯于星期三（二）細胞凋亡的調(diào)控1.細胞凋亡的相關(guān)因素（1）誘導(dǎo)性因素激素和生長因子失衡：缺乏（IL-2↓，淋巴細胞凋亡）或過多（糖皮質(zhì)激素↑，淋巴細胞凋亡）

理化因素：射線、高溫、強酸、強堿、乙醇、抗癌藥物等免疫性因素：如，CTL分泌粒酶→靶細胞凋亡微生物因素：細菌、病毒及毒素。（HIV）

現(xiàn)在是17頁\一共有71頁\編輯于星期三（2）抑制性因素：

細胞因子：IL-2、神經(jīng)營養(yǎng)因子激素：ACTH、睪丸酮、雌激素等二價金屬陽離子：Zn2+藥物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、中性氨基酸病毒：EB病毒、牛痘病毒CrmA現(xiàn)在是18頁\一共有71頁\編輯于星期三2.細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是連接凋亡誘導(dǎo)因素與核DNA片段化斷裂及細胞結(jié)構(gòu)蛋白降解的中間環(huán)節(jié)。凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的特點：①多樣性：不同種類細胞有不同系統(tǒng)②耦聯(lián)性：凋亡與增殖分化系統(tǒng)在某些環(huán)節(jié)交、耦聯(lián)，同一因素既可引起凋亡也可引起增殖③同一性：不同凋亡誘導(dǎo)因素可通過同一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)④多途性：同一凋亡誘導(dǎo)因素可通過不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)現(xiàn)在是19頁\一共有71頁\編輯于星期三研究較多的系統(tǒng)：依據(jù)：①細胞凋亡時胞內(nèi)游離Ca2+濃度顯著上升②用Ca2+載體A23187人為升高B淋巴細胞Ca2+水平，B淋巴細胞凋亡③用Ca2+絡(luò)合劑降低胞內(nèi)Ca2+水平，阻止細胞凋亡激活Ca2+依賴谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶Ca2+↑活化核轉(zhuǎn)錄因子1．胞內(nèi)Ca2+信號系統(tǒng)（Ca2+為第二信使）現(xiàn)在是20頁\一共有71頁\編輯于星期三2．cAMP/PKA信號系統(tǒng)（cAMP為第二信使）依據(jù)：①雙丁酰cAMP可引起培養(yǎng)的髓樣白血病細胞及胸腺細胞凋亡②糖皮質(zhì)激素使cAMP上升cAMP↑→激活PKA→使靶蛋白某些氨基酸（蘇、絲AA）殘基磷酸化→改變蛋白質(zhì)功能現(xiàn)在是21頁\一共有71頁\編輯于星期三3．Fas蛋白/Fas配體信號系統(tǒng)Fas蛋白：細胞膜跨膜蛋白Fas蛋白+Fas配體（抗Fas）→細胞凋亡機制：①Fas蛋白+Fas配體（抗Fas）→神經(jīng)鞘磷脂酶活性↑→產(chǎn)生神酰胺→蛋白激酶激活→細胞凋亡②Fas蛋白+抗Fas、TNF→激活I(lǐng)CE樣caspase→降解H1組蛋白→染色體松馳→DNA暴露內(nèi)切酶位點③通過Ca2+信號系統(tǒng)傳遞死亡信息引起細胞凋亡現(xiàn)在是22頁\一共有71頁\編輯于星期三4．神經(jīng)酰胺信號系統(tǒng)神經(jīng)酰胺：神經(jīng)鞘磷脂（SM）在神經(jīng)鞘磷脂酶的作用下產(chǎn)生的一類新型第二信使物質(zhì)。介導(dǎo)細胞凋亡的依據(jù)：用天然神經(jīng)酰胺處理u937白血病細胞，誘導(dǎo)細胞凋亡神經(jīng)酰胺途徑相關(guān)誘因：電離輻射、TNF-α、Fas抗原、糖皮質(zhì)激素現(xiàn)在是23頁\一共有71頁\編輯于星期三5．二酰甘油/蛋白激酶C（PKC）信號系統(tǒng)二酰甘油：磷脂酰肌醇和磷脂酰膽堿在磷脂酶C催化下產(chǎn)生的一種第二信使物質(zhì)。依據(jù)：①活化的PKCβ1可誘導(dǎo)u937白血病細胞凋亡②抑制PKC活性可抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的小鼠胸腺細胞凋亡③PKC激動劑佛波脂可抑制某些類型細胞凋亡（糖皮質(zhì)激素、T細胞受體激活、IL-2撤除）現(xiàn)在是24頁\一共有71頁\編輯于星期三6．酪氨酸蛋白激酶系統(tǒng)生長因子或細胞因子→激活酪氨酸蛋白激酶→靶蛋白酪氨酸磷酸化→Ras蛋白激活→通過Raf-1、MAPKK、MAPK→蛋白質(zhì)磷酸化→細胞分化生長因子或細胞因子撤除→不能激活酪氨酸蛋白激酶系統(tǒng)→細胞凋亡現(xiàn)在是25頁\一共有71頁\編輯于星期三3.凋亡相關(guān)基因三類：抑制凋亡基因：Bcl-2、EIB、IAP促進凋亡基因：P53、Bax、ICE雙向調(diào)節(jié)基因：c-myc、Bclx現(xiàn)在是26頁\一共有71頁\編輯于星期三(B細胞淋巴瘤/白血病-2[Bcelllymphoma/leukemia-2]基因的縮寫)

Bcl-2蛋白：229個氨基酸（人）、236個氨基酸（小鼠）分布：線粒體內(nèi)膜、細胞膜內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜作用：Bcl-2高表達能阻抑多種凋亡誘導(dǎo)因素所引起的細胞凋亡依據(jù)：①導(dǎo)入Bcl-2基因質(zhì)粒可防止神經(jīng)細胞因撤除神經(jīng)生長因子所誘導(dǎo)的凋亡②淋巴細胞有20%呈Bcl-2陽性時，預(yù)后不佳（耐受放射線、抗癌藥物）1.Bcl-2現(xiàn)在是27頁\一共有71頁\編輯于星期三①直接的抗氧化作用②抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質(zhì)（細胞色素C、AIF）③抑制促凋亡性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)Bax、Bak的細胞毒作用④抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活⑤維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)Bcl-2抗凋亡作用機制：現(xiàn)在是28頁\一共有71頁\編輯于星期三作用：野生型（wtP53）：DNA結(jié)合蛋白，誘導(dǎo)細胞凋亡（“分子警察”）突變型：抑制細胞凋亡野生型P53的作用機制：P53蛋白→細胞周期G1期檢查染色體DNA損傷（檢查點功能）→發(fā)現(xiàn)DNA損傷→剌激CIP的表達→阻止細胞進入下一周期，啟動DNA修復(fù)機制→修復(fù)失敗→啟動細胞凋亡機制→細胞凋亡2.P53現(xiàn)在是29頁\一共有71頁\編輯于星期三c-myc:一種癌基因，它能誘導(dǎo)增殖，也能誘導(dǎo)細胞凋亡，具有雙向調(diào)節(jié)作用。作用機制：c-myc蛋白為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，既可介導(dǎo)細胞增殖的基因，也可激活介導(dǎo)細胞凋亡的基因，其作用取決于細胞接受何種信號及細胞的生長環(huán)境（有生長因子→增殖，無生長因子→凋亡）。Bcl-x：能翻譯Bcl-XL和Bcl-Xs兩種蛋白，Bcl-XL蛋白抑制細胞凋亡，Bcl-Xs蛋白促進細胞凋亡（合成以誰為主）

3.c-myc,Bcl-x現(xiàn)在是30頁\一共有71頁\編輯于星期三五、細胞凋亡的發(fā)生機制（一）氧化損傷氧化損傷的后果之一：細胞凋亡依據(jù)：①各種氧化劑（H2O2）可直接誘導(dǎo)細胞凋亡②抑制超氧化物歧化酶（SOD）活性可誘導(dǎo)細胞凋亡③抗氧化劑（VitE、胡蘿卜素等）可阻斷有氧化應(yīng)激背景的各種凋亡誘導(dǎo)因素（TNF-а、電離輻射）引起的細胞凋亡現(xiàn)在是31頁\一共有71頁\編輯于星期三①引起DNA損傷，激活P53基因②引起DNA損傷，活化多聚ADP核糖合成酶，耗竭NAD，消耗大量ATP③攻擊細胞膜不飽和脂肪酸，脂質(zhì)過氧化，細胞膜損傷或產(chǎn)生過氧羥基24碳四烯酸④激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶⑤細胞膜損傷，Ca2+內(nèi)流增多及損傷線粒體，通透性增加膜電位改變⑥活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB、AP-1，加速凋亡相關(guān)基因表達氧化損傷引起細胞凋亡的可能機制：現(xiàn)在是32頁\一共有71頁\編輯于星期三（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡細胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡是細胞凋亡的重要機機制之一依據(jù)：①各種凋亡刺激所引起的凋亡是鈣依賴過程②凋亡發(fā)生時胞漿Ca2+濃度顯著上升，并在隨后的一系列凋亡改變中起關(guān)鍵性作用（核酸內(nèi)切酶激活、需鈣蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的激活，細胞膜的空泡化）③鈣穩(wěn)態(tài)失衡參與多種凋亡相關(guān)疾病的發(fā)?。ㄉ窠?jīng)退行性疾病）現(xiàn)在是33頁\一共有71頁\編輯于星期三①激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶，降解DNA鏈②激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化肽鏈間的?；D(zhuǎn)移酶，肽鏈間形成共價鍵，使細胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體形成③激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速凋亡相關(guān)基因表達④Ca2+在ATP的配合下使DNA鏈舒展，暴露核小體之間的連接區(qū)內(nèi)的酶切位點，有利于DNA內(nèi)切酶切割DNA鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細胞凋亡的可能機制：現(xiàn)在是34頁\一共有71頁\編輯于星期三（三）線粒體損傷線粒體的改變：線粒體內(nèi)膜通透性增大，線粒體內(nèi)膜跨膜電位（△ψm）下降，能量代謝水平顯著降低線粒體改變在細胞凋亡發(fā)生中起關(guān)鍵作用依據(jù)：①抑制線粒體的三羧酸循環(huán)或呼吸鏈功能可誘導(dǎo)細胞凋亡②在細胞核出現(xiàn)凋亡改變之前，常先有線粒體內(nèi)膜跨膜電位（△ψm）下降③阻止線粒體通透性的改變，可防止細胞凋亡（Bcl-2）現(xiàn)在是35頁\一共有71頁\編輯于星期三線粒體改變引起細胞凋亡的機制：

Ca2+NO缺血原卟啉Ⅸ活性氧線粒體△ψm下降Bcl-2(-)PTP開放Apaf+Cyt.CCaspase-9酶原Caspase-9(+)Caspase-3酶原Caspase-3(+)Caspase抑制劑AIF(-)蛋白質(zhì)水解細胞凋亡DNA斷裂無活性核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶激活(+)(+)現(xiàn)在是36頁\一共有71頁\編輯于星期三第二節(jié)細胞凋亡的檢測方法

細胞凋亡檢測方法：歸納起來，可分三方面，即根據(jù)凋亡的形態(tài)學(xué)特征、細胞凋亡的生化特征以及細胞凋亡的流式細胞儀檢測。本節(jié)主要介紹細胞凋亡的常用病理學(xué)檢測方法?，F(xiàn)在是37頁\一共有71頁\編輯于星期三一、蘇木精-伊紅染色方法(HE染色)1．石蠟組織切片HE染色（略）2．細胞爬片或細胞涂片的HE染色現(xiàn)在是38頁\一共有71頁\編輯于星期三（1）細胞爬片或細胞涂片的制備：貼壁生長細胞(包括腫瘤細胞)：讓細胞生長在蓋玻片使其在上面爬行生長。取出蓋玻片，經(jīng)PBS輕輕漂洗后，用4%的甲醛或多聚甲醛在常溫下固定5－10min，即可染色。懸浮生長細胞(包括腫瘤細胞)或貼壁生長的細胞經(jīng)消化脫壁成單細胞懸液后，可經(jīng)細胞涂片后染色。（2）染色方法:同石蠟組織切片HE染色，免去第1和第2步。

現(xiàn)在是39頁\一共有71頁\編輯于星期三【結(jié)果判斷】

1.光學(xué)顯微鏡下細胞核呈藍黑色，胞漿呈淡紅色。凋亡細胞在組織中單個散在分布，表現(xiàn)為核染色質(zhì)致密濃縮，核碎裂等。2.在細胞爬片上，凋亡的細胞變圓、變小，可見細胞核固縮、碎裂，染色體被染成深藍色或藍黑色；可見細胞膜皺折、卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小體(apoptoticbodies〉。而正常細胞經(jīng)染色后仍保持細胞原有的生長形狀(如梭形或多角形)，細胞核規(guī)整，染成均一藍色。細胞涂片時可見凋亡細胞核固縮、碎裂，染色變深；正常細胞染色體顯均勻淡藍色或藍色，而壞死細胞細胞腫脹，可見細胞膜的連續(xù)性破壞，核染色體染成很淡的藍色甚至消失?，F(xiàn)在是40頁\一共有71頁\編輯于星期三現(xiàn)在是41頁\一共有71頁\編輯于星期三

嗜酸性小體(凋亡)嗜酸性變及嗜酸性小體肝細胞體積縮小，胞漿濃縮紅染，呈嗜酸性變；或胞漿進一步濃縮，細胞變圓，核碎裂、溶解消失，呈嗜酸性小體狀現(xiàn)在是42頁\一共有71頁\編輯于星期三二、甲基綠-派諾寧染色法現(xiàn)在是43頁\一共有71頁\編輯于星期三【染色原理】

細胞凋亡和細胞壞死均可表現(xiàn)為細胞核固縮等細胞死亡形態(tài)，但兩者發(fā)生機制不同。細胞凋亡是一種細胞主動死亡過程，需要有細胞內(nèi)蛋白酶的激活，細胞質(zhì)內(nèi)常有mRNA表達的增強。而細胞壞死則是一種被動的細胞死亡過程，細胞質(zhì)內(nèi)常有RNA的損失。根據(jù)這一特點，可應(yīng)用試劑甲基綠對DNA染色的特異性和派諾寧對RNA的親和性，使甲基綠對固縮細胞核內(nèi)的脫氧核糖核酸著染，如果細胞質(zhì)內(nèi)核糖核酸呈派諾寧陽性染色者為凋亡細胞，呈陰性染色者為壞死細胞?，F(xiàn)在是44頁\一共有71頁\編輯于星期三【試劑及配制】1.組織固定液無水乙醇600ml氯仿300ml冰乙酸100ml

現(xiàn)在是45頁\一共有71頁\編輯于星期三2.甲基綠純化

新購買的甲基綠(methylgreen)需用氯仿進行純化處理以去除甲基紫。方法是將2%甲基綠水溶液20ml傾入潔凈分液漏斗，加入氯仿20ml充分混勻，使其內(nèi)的甲基紫溶于氯仿中而呈紫紅色。旋動分液漏斗下部的砂塞，慢慢把下沉帶紫紅色的氯仿移去，再加入新的氯仿10ml，如此反復(fù)更換氯仿，直到無紫紅色為止。該液作為貯存液，4℃保存?，F(xiàn)在是46頁\一共有71頁\編輯于星期三3.染色液甲基綠貯存液5m15%派諾寧水溶液lm1蒸餾水12m12mol/L乙酸鈉(pH4.8)18ml(臨用前配制，濾紙過濾)現(xiàn)在是47頁\一共有71頁\編輯于星期三【操作方法】1.新鮮取材組織置組織固定液中4℃固定3－6h；2.直接轉(zhuǎn)入95%乙醇脫水和無水乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋；3.切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化至蒸餾水；4.置染色液中室溫下染片約lh；5.取出切片，不經(jīng)水洗，用濾紙吸干多余染液；6.插入丙酮中迅速分化；7.轉(zhuǎn)入丙酮二甲苯(1:1)稍洗；8．二甲苯透明2－3次；9．中性樹膠封固

現(xiàn)在是48頁\一共有71頁\編輯于星期三【結(jié)果判斷】

凋亡細胞：光學(xué)顯微鏡下凋亡細胞細胞核固縮呈綠色或綠藍色著染，胞質(zhì)呈紅紫色著染。觀察時可用凋亡指數(shù)進行計數(shù)，即隨機選擇約10－20個視野(每張切片約1000－2500個細胞〉，計數(shù)凋亡細胞百分率。細胞壞死：只有固縮細胞核呈綠色著染。

現(xiàn)在是49頁\一共有71頁\編輯于星期三現(xiàn)在是50頁\一共有71頁\編輯于星期三三、吖啶橙染色法【染色原理】吖啶橙的熒光隨pH而變，其正色為綠色，隨pH下降可變到橙紅色。吖啶橙與DNA和RNA通過兩個部位結(jié)合，連接堿基對和磷酸鹽基團，吖啶橙與堿基對結(jié)合，形成第一復(fù)合物。第二復(fù)合物在多核苷酸表面，由吖啶橙與磷酸鹽基團連接而成。pH6.0時，DNA結(jié)合染料的聚合加速，pH低于3.8時，聚合受抑制，而RNA在pH6.0和3.8都能聚合而使顏色變紅。

現(xiàn)在是51頁\一共有71頁\編輯于星期三【試劑及配制】

吖啶橙貯存液:10mg吖啶橙溶解于100mlPBS中，pH4.8－6.0濾過，40C避光保存【操作方法】1.制備活細胞懸液，濃度約為107/ml2.取95μl細胞懸液，加5μl吖啶橙貯存液混勻3.吸一滴混合液滴于潔凈玻片上，直接用蓋玻片封片4.熒光顯微鏡選用激發(fā)濾片BG12，BV等，阻斷濾片用515nm或SP3

現(xiàn)在是52頁\一共有71頁\編輯于星期三【結(jié)果判斷】正常細胞：在熒光顯微鏡下，細胞核DNA為黃色或黃綠色均勻熒光，細胞質(zhì)和核仁的RNA為桔黃或桔紅色熒光凋亡細胞：細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的黃綠色染色，甚或見黃綠色碎片壞死細胞：細胞質(zhì)內(nèi)黃綠色或桔黃色熒光均可減弱或消失

現(xiàn)在是53頁\一共有71頁\編輯于星期三現(xiàn)在是54頁\一共有71頁\編輯于星期三四、原位末端標記

原位末端標記（ISEL)是將滲入到凋亡細胞中的外源性核苷酸在酶〔末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）和DNA聚合酶I或KIenow大片段〕的催化下與凋亡細胞因內(nèi)源性核酸酶的激活而產(chǎn)生的單股或雙股斷鏈相結(jié)合，再通過一定的顯示系統(tǒng)使之顯示出來。通常有兩種方法:①末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記(簡稱TUNEL)；②DNA聚合酶I或Klenow大片段介導(dǎo)的原位缺口平移(簡稱INST)。在不考慮所使用的催化酶時，統(tǒng)稱為原位末端標記?，F(xiàn)在是55頁\一共有71頁\編輯于星期三

TUNEL鑒定的原理基于細胞凋亡時產(chǎn)生DNA斷鏈，所介導(dǎo)的酶是TdT，該酶能將外源性的生物素或地高辛標記的dUTP無需DNA模板連接到凋亡細胞核的DNA斷鏈的3-羥基(3'-0H〉末端，DNA斷鏈可是單股斷鏈也可是雙股斷鏈，兩種斷鏈都有游離的3'-羥基末端，因此，TUNEL鑒定可以檢測凋亡細胞核中的單股和雙股DNA斷鏈?，F(xiàn)在是56頁\一共有71頁\編輯于星期三【試劑準備和配制】1.0.15mol/L的PBS:0.15mol/LNaCl，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液；2．蛋白酶K20μg/ml，0.15mol/L的PBS配制；3．組織預(yù)處理液(2×SSC溶液):先配制20×SSC溶液作為儲存液，用時10倍稀釋(1×SSC溶液含0.3mol/LNaCl，30mmol/L枸橡酸納)；4．內(nèi)源酶阻斷劑:3%H202-甲醇溶液（或PBS）現(xiàn)在是57頁\一共有71頁\編輯于星期三5．緩沖液A(bufferA〉250mmol/LTris-HCl，5mmol/LMgC12，10mmol/Lβ-巰基乙醇，0.005%BSA，pH7.56．鏈卵白素標記的辣根過氧化物酶；7．DAB-H202顯色液:DAB用0.1mol/LTris-Cl(pH7.6)配成0.4%，分裝一20℃避光保存；8．TdT緩沖液(pH6.8)二甲胂酸納(Na-Cacodylate〉100mmol/L二琉基蘇糖醇(dithiothrenol〉0.1mmol/L氯化鉆(C00)5mmol/L9．TdT反應(yīng)液在TdT緩沖液中加入TdT酶100U/ml，0.001mmol/Lbiotin-11-dUTP現(xiàn)在是58頁\一共有71頁\編輯于星期三【染色步驟】1.切片常規(guī)脫蠟，復(fù)水，后續(xù)過程在濕盒內(nèi)進行；2.3%的H202阻斷內(nèi)源性過氧化物酶30min；3.0.15mol/L的PBS洗3次，每次5min；4.切片浸泡在2×SSC80℃20min；5.0.15mol/L的PBS洗3次，每次5min；6.蛋白酶K消化0－20min；7.0.15mol/L的PBS洗3次，每次5min；8.TdT緩沖液孵育10min現(xiàn)在是59頁\一共有71頁\編輯于星期三9.

TdT反應(yīng)液37℃孵育1h；10.切片浸泡在2×SSC溶液10min，以終止反應(yīng)；11.

0.15mol/L的PBS洗3次5min；12.

鏈卵臼素標記的辣根過氧化物酶孵育30min（POD）；13.

0.15mol/L的PBS洗3次，每次5min；14.0.04%的DAB顯色5－10min，鏡下控制時間；15.蘇木精對比染色10-30sec，常規(guī)復(fù)水、透明和封固。

現(xiàn)在是60頁\一共有71頁\編輯于星期三【結(jié)果判斷】

凋亡細胞的核呈棕色或棕褐色著染，細胞核形態(tài)呈碎點狀，不規(guī)整，大小不一致。而正常非凋亡細胞和陰性對照片核被蘇木素復(fù)染呈藍色，核相對較大，形態(tài)大小較為一致現(xiàn)在是61頁\一共有71頁\編輯于星期三現(xiàn)在是62頁\一共有71頁\編輯于星期三第三節(jié)細胞凋亡的應(yīng)用一．細胞凋亡與機體發(fā)育

細胞凋亡是多細胞動物生命活動過程中不可缺少的組成內(nèi)容，是動物借以存活的需要，因而貫穿于動物全部壽命周期中。無論是低等動物還是高等動物，都是如此。在哺乳動物胚胎發(fā)生、發(fā)育和成熟過程中，構(gòu)成組織的細胞生死交替，細胞凋亡是保證個體發(fā)育成熟所必需的。

現(xiàn)在是63頁\一共有71頁\編輯于星期三二．細胞凋亡與機體穩(wěn)態(tài)

組成機體的細胞不但需要不斷地與環(huán)境進行物質(zhì)、信息和能量的交換，而且這些細胞本身也處在不斷的更新中。這種更新是以細胞數(shù)量上的恒定為前提的，因此是一種動態(tài)平衡狀態(tài)，顯然，各種細胞數(shù)量上穩(wěn)定，不但保證了機體各組織器官具有形態(tài)學(xué)上的穩(wěn)定性，同時也是機體生理功能或內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的必要條件。沒有這種細胞生理性死亡，細胞更新就不可能發(fā)生，因此，細胞產(chǎn)生與細胞凋亡之間的平衡是機體穩(wěn)態(tài)的基本條件，它們的平衡一旦破壞，就會導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生

現(xiàn)在是64頁\一共有71頁\編輯于星期三三、細胞凋亡與疾?。ㄒ唬┘毎蛲霾蛔?.腫瘤發(fā)生機制：目前認為：細胞增殖過度是腫瘤發(fā)病的一個途徑，凋亡受抑、細胞死亡不足是腫瘤發(fā)病的另一途徑，結(jié)果導(dǎo)致病變組織內(nèi)腫瘤細胞存活延長，存活大于死亡，腫瘤細胞數(shù)目凈增長加大，形成新生物。凋亡受抑的依據(jù)：①多種腫瘤組織中Bcl-2表達顯著高于周圍組織②許多腫瘤P53發(fā)生突變，突變型P53抑制細胞凋亡（肺小細胞癌等）