熒光定量PCR的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課HCMV課件

熒光定量PCR的原理及臨床應(yīng)用如何做一個(gè)“聰明”的實(shí)習(xí)生實(shí)習(xí)的目的就是對在校所學(xué)的理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能，在臨床的實(shí)際工作中進(jìn)行實(shí)踐、鞏固和提高。如何做到：①實(shí)習(xí)之前要復(fù)習(xí)理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容

“理論先行”②實(shí)習(xí)過程中要“聰明”③做好實(shí)習(xí)筆記，用心思考，實(shí)習(xí)之外下功夫如何做一個(gè)“聰明”的實(shí)習(xí)生聰明耳：認(rèn)真聽老師的說明和講解看：仔細(xì)看老師的操作問：有疑問要多提問，多討論心：要用心去思考日月：要每天每月堅(jiān)持做到PCR的定義PCR是PolymeraseChainReaction的縮寫，中文稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，由變性、退火及延伸幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。由美國PE公司遺傳部的Dr.Mullis發(fā)明，由于PCR技術(shù)的跨時(shí)代意義，Mullis獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

PCR的原理變性：雙鏈DNA在高溫下解開成單鏈的過程

。溫度一般為95℃左右。5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’加熱PCR的原理退火：溫度下降后，兩條配對的單鏈DNA重新結(jié)合為雙鏈的過程。溫度一般為50~60℃。5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT降溫普通PCR的原理普通PCR的原理PCR反應(yīng)成分：1.模板DNA2.引物3.四種脫氧核糖核苷酸4.DNA聚合酶(Taq酶)5.反應(yīng)緩沖液、Mg2+等6.熒光探針（熒光定量PCR）Taq酶的發(fā)現(xiàn)在Taq酶發(fā)現(xiàn)之前，實(shí)驗(yàn)室的PCR反應(yīng)中運(yùn)用的是大腸桿菌DNA聚合酶Ι的Klenow片段。Klenow酶不耐高溫，90℃加熱后會(huì)變性失活，每次循環(huán)結(jié)束都要加入新鮮的酶。而且DNA的延伸是在37℃完成，模板和引物容易錯(cuò)配，造成反應(yīng)的特異性很差。熒光定量PCR概念：在PCR反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積或變化實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)反應(yīng)過程，最后通過特定數(shù)學(xué)模型對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems，ABI公司推出，實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線分析對起始標(biāo)本的模板量進(jìn)行定量分析。與普通PCR的比較普通PCR完成后，一般只對擴(kuò)增的最終產(chǎn)物量進(jìn)行分析，分析結(jié)果多為定性或者半定量結(jié)果。熒光定量PCR通過監(jiān)測熒光值的變化，體現(xiàn)每一個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，分析結(jié)果為定量結(jié)果。常用的名詞概念本底信號(hào)（Baseline）熒光閾值（Threshold）Ct值（Ctvalue）擴(kuò)增曲線前15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)的均值，可手動(dòng)調(diào)節(jié)選擇默認(rèn)是第3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，也可手動(dòng)調(diào)節(jié)擴(kuò)增過程中，產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)常用的名詞概念ThresholdBaselineCtvalue熒光強(qiáng)度Rn擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對數(shù)增長期實(shí)際中的運(yùn)用左圖為5個(gè)數(shù)量級的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增后得到的熒光曲線，右圖以Ct值為縱坐標(biāo)，lgXs為橫坐標(biāo)，可計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)曲線熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）發(fā)生的條件熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)都能發(fā)射熒光熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜和淬滅基團(tuán)的激發(fā)光譜需有效重疊熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)應(yīng)足夠的近（<10nm）波長信號(hào)強(qiáng)度常見的實(shí)時(shí)熒光定量PCRTaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子信標(biāo)探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR雙鏈DNA交聯(lián)熒光染料法實(shí)時(shí)熒光定量PCR雙雜交探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR蝎形探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針的熒光標(biāo)記探針在其5’端標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)，如6-羧基熒光素(FAM)、四氯-6-羧基熒光素(TET)、六氯-6-羧基熒光素(HEX)等探針在其3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)，如6-羧基-四甲基羅丹明(TAMRA)分子信標(biāo)探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)探針熒光染料法實(shí)時(shí)熒光定量PCR最常用的染料就是SYBRGreenΙ，游離時(shí)只發(fā)出微弱熒光，當(dāng)它非特異性與雙鏈DNA小溝結(jié)合后，熒光強(qiáng)度可增大1000倍。所以，反應(yīng)中發(fā)出的熒光信號(hào)與擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA雙鏈的量成正比。熒光定量PCR在臨床的應(yīng)用常見的異常結(jié)果：假陽性、假陰性和“灰區(qū)”如何發(fā)現(xiàn)異常結(jié)果：①設(shè)定陽性對照、陽性質(zhì)控（低值、中值、高值）和陰性對照②加入內(nèi)標(biāo)試劑與標(biāo)本一起擴(kuò)增，幫助判斷假陰性結(jié)果出現(xiàn)熒光定量PCR在臨床的應(yīng)用如何判斷：標(biāo)本結(jié)果為陰性，而內(nèi)標(biāo)熒光不隨著擴(kuò)增而增加，則可判斷為假陰性結(jié)果陽性對照陰性對照陽性低值陽性中值陽性高值判斷結(jié)果+-在控在控在控結(jié)果可靠++/-可能出現(xiàn)假陽性++陽性結(jié)果不可靠+/--偏低/-偏低偏低可能出現(xiàn)假陰性---偏低/-偏低所有結(jié)果不可靠熒光定量PCR在臨床的應(yīng)用出現(xiàn)異常結(jié)果的原因：①試劑和實(shí)驗(yàn)器材的原因：試劑過期失效，耗材中存在DNase、RNase、抑制物等②實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)③標(biāo)本間污染：相臨的測試孔結(jié)果相近★④氣溶膠污染：大范圍的陽性結(jié)果⑤儀器故障熒光定量PCR在臨床的應(yīng)用有效防止和消除氣溶膠污染的方法：①保持實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)，最好有機(jī)械通風(fēng)設(shè)備②10%次氯酸鈉溶液的噴灑和擦拭③1MHCl溶液的浸泡

④紫外線的照射：>500bp片段敏感⑤75%或無水乙醇溶液噴霧熒光定量PCR在臨床的應(yīng)用在反應(yīng)體系中使用dUTP和UNG酶消除以往實(shí)驗(yàn)的污染影響UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）：選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈和單鏈中的尿嘧啶糖苷鍵，在堿性介質(zhì)和高溫下會(huì)進(jìn)一步水解斷裂，酶的最佳活性溫度是50℃，在95℃失活。熒光定量PCR在臨床的應(yīng)用氣溶膠污染物50℃2min，95℃滅活加入U(xiǎn)NG酶熒光定量PCR在臨床的應(yīng)用5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’擴(kuò)增加入dUTP5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’潛在氣溶膠污染物50℃2min加入U(xiǎn)NG酶5’…斷裂的核苷酸片段…3’5’…斷裂的核苷酸片段…3’5’…斷裂的核苷酸片段…3’5’…斷裂的核苷酸片段…3’5’…斷裂的核苷酸片段…3’5’…斷裂的核苷酸片段…3’5’…斷裂的核苷酸片段…3’5’…斷裂的核苷酸片段…3’5’…斷裂的核苷酸片段…3’5’…斷裂的核苷酸片段…3’熒光定量PCR在臨床的應(yīng)用乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)EB病毒DNA(EBV-DNA)人巨細(xì)胞病毒DNA(HCMV-DNA)肺炎支原體DNA(MP-DNA)肺炎衣原體DNA(CP-DNA)臨床標(biāo)本的采集檢測項(xiàng)目標(biāo)本類型及要求HBV-DNA血清或者血漿100μl(不可用肝素抗凝)EBV-DNA血清100μl或抗凝全血1ml(不可用肝素抗凝)HCMV-DNA血清100μl或抗凝全血1ml(不可用肝素抗凝)MP-DNACP-DNA咽拭子、痰液或肺支氣管灌洗液1ml人巨細(xì)胞病毒DNA檢測試劑盒用于器官移植、骨髓移植及HIV陽性/AIDS患者人巨細(xì)胞病毒感染的輔助診斷和療效監(jiān)控。臨床上可以采用的標(biāo)本類型：尿液、乳汁、血清、血漿或淋巴細(xì)胞樣本中人巨細(xì)胞病毒DNA。人巨細(xì)胞病毒DNA檢測試劑盒巨細(xì)胞病毒DNA的提?。ㄑ寤蜓獫{）100μl血清或血漿100μl

DNA濃縮液去除上清液，保留沉淀12000rpm，10min人巨細(xì)胞病毒DNA檢測試劑盒巨細(xì)胞病毒DNA的提?。ㄑ寤蜓獫{）加入50μlDNA提取液劇烈振蕩混勻5-10s100℃加熱10min人巨細(xì)胞病毒DNA檢測試劑盒巨細(xì)胞病毒DNA的提?。ㄑ寤蜓獫{）4℃放置或用于PCR振蕩混勻5~10s12000rpm，5min人巨細(xì)胞病毒DNA檢測試劑盒巨細(xì)胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）1ml尿液或乳汁去除上清液，保留沉淀12000rpm，5min人巨細(xì)胞病毒DNA檢測試劑盒巨細(xì)胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）加入50μlDNA提取液劇烈振蕩混勻5-10s100℃加熱10min人巨細(xì)胞病毒DNA檢測試劑盒巨細(xì)胞病毒DNA的提?。蛞汉腿橹?℃放置或用于PCR振蕩混勻5~10s12000rpm，5min人巨細(xì)胞病毒DNA檢測試劑盒人巨細(xì)胞病毒DNA的提取（淋巴細(xì)胞的提?。?/p>

1ml抗凝全血1ml生理鹽水0.3ml淋巴細(xì)胞分離液人巨細(xì)胞病毒DNA檢測試劑盒人巨細(xì)胞病毒DNA的提?。馨图?xì)胞的提?。┧诫x心機(jī)2500rpm，15min淋巴細(xì)胞層吸取淋巴細(xì)胞懸液人巨細(xì)胞病毒DNA檢測試劑盒人巨細(xì)胞病毒DNA的提?。馨图?xì)胞的提取）淋巴細(xì)胞懸液去除上清液，保留沉淀12000rpm，5min人巨細(xì)胞病毒DNA定量檢測試劑盒人巨細(xì)胞病毒DNA的提取（淋巴細(xì)胞的提?。┘尤?0μlDNA提取液劇烈振蕩混勻5-10s100℃加熱10min人巨細(xì)胞病毒DNA檢測試劑盒人巨細(xì)胞病毒DNA的提?。馨图?xì)胞的提取）4℃放置或用于PCR振蕩混勻5~10s12000rpm，5min熒光定量PCR擴(kuò)增過程50℃94℃2min5min93℃15s57℃30sStage1Stage2Stage345

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125℃1minStage4

1DNA濃縮液的作用DNA濃縮液的成分：PEG6000、NaClPEG（聚乙二醇）的作用：PEG與自由水分子結(jié)合，同時(shí)蛋白質(zhì)表面的水化膜被奪走，與水分子結(jié)合的極性集團(tuán)轉(zhuǎn)而與多聚物的氧原子或者氫氧根結(jié)合，形成蛋白質(zhì)與多聚物的復(fù)合體，從溶液中沉淀析出。提高低濃度標(biāo)本的檢出率。PEG的濃度與沉淀出的DNA片段大小成反比。

DNA濃縮液的作用NaCl的作用：在細(xì)胞內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成脫氧核糖核蛋白DNP，而RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成為核糖核蛋白R(shí)NP,在不同鹽濃度中二者溶解度不一樣。DNP在純水或者1~2M的Nacl溶解度較大，在0.14M溶解度較低，而0.14M中RNP溶解度較大，因此利用0.14M可分離RNP和DNP。

DNA提取液的作用DNA提取液的主要成分：NP-40TritonX-100Chelex-100EDTA(pH8.0)Tris-HCl(pH8.0)