微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)第1頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四第2頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四一.培養(yǎng)基微生物原核類:真核類非細(xì)胞類：細(xì)菌、藍(lán)藻等酵母菌、霉菌、食用菌等真菌：原生生物：草履蟲、變形蟲等病毒是一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱．關(guān)于微生物的類群第3頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。一、培養(yǎng)基的概念人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)——培養(yǎng)基思考：微生物“吃”什么？第4頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四一、培養(yǎng)基的成分：微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)⑴碳源（提供碳元素的物質(zhì)）無機(jī)碳源：有機(jī)碳源CO2、碳酸鹽自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源（提供氮元素的物質(zhì)）無機(jī)氮源：有機(jī)氮源：：（葡糖糖、蔗糖、淀粉、牛肉膏、蛋白胨等）牛肉膏、蛋白胨等NH4＋、NO3-N2第5頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四(3).不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方

(參考教材附錄內(nèi)容)(5)另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細(xì)菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣等的要求。

(4).不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、氮源、無機(jī)鹽——基本成分第6頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四（1）按培養(yǎng)基的物理形態(tài)分：液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基的種類（2）按培養(yǎng)基的功能分：基礎(chǔ)（通用）培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基（3）按培養(yǎng)基的化學(xué)成分分：·天然培養(yǎng)基·合成培養(yǎng)基第7頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四二、無菌技術(shù)1.概念

無菌技術(shù)又稱無菌操作，泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。因此，獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵第8頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四消毒

使用較為溫和的物理或化學(xué)方法，殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。2.消毒與滅菌滅菌

使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。理化因素的作用強(qiáng)度消滅微生物的數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅(1)定義第9頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。②巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min。③化學(xué)藥劑消毒法：用75%酒精等進(jìn)行皮膚消毒；氯氣消毒水源。④紫外線消毒。⑴.消毒的方法：2.常用的消毒與滅菌的方法第10頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四①灼燒滅菌②干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。③高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.⑵.滅菌的方法：第11頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四二、無菌技術(shù)（1）對實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。（2）將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。（3）為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。（4）實(shí)驗(yàn)操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。無菌技術(shù)圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括以下幾個方面第12頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四思考：1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？思考：2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手

無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。第13頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四練習(xí)細(xì)菌培養(yǎng)過程中分別采用了高壓蒸汽、酒精、火焰灼燒等幾種不同的處理方法，這些方法依次用于殺滅哪些部位的雜菌（）A.接種針、手、培養(yǎng)基B.高壓鍋、手、接種針C.培養(yǎng)基、手、接種針D.培養(yǎng)基、手、高壓鍋C第14頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四變形題培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、實(shí)驗(yàn)操作者的雙手、空氣、牛奶所采用的滅菌、消毒方法依次是（）①化學(xué)消毒②灼燒滅菌③干熱滅菌④紫外線消毒⑤高壓蒸汽滅菌⑥巴氏消毒法A.⑤③②①④⑥B.①②③④⑤⑥C.⑥②③④①⑤D.③④②①⑥⑤A第15頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計(jì)算：（根據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方的比例，計(jì)算配制100ML的培養(yǎng)基時，各種的成分的用量）物質(zhì)牛肉膏蛋白胨NaCl瓊脂水重量5g10g5g20g定溶至1000mL2.稱量

三、實(shí)驗(yàn)操作思考：該培養(yǎng)基從物理性質(zhì)分屬于哪種？原因？含有幾種基本營養(yǎng)成分？牛肉膏提供上述哪幾種成分？準(zhǔn)確稱取各種成分，注意事項(xiàng)：牛肉膏要放在稱量紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后及時蓋上瓶蓋。第16頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四

3.溶化：

4.滅菌：

5.倒平板：待培養(yǎng)基冷卻到50OC左右時，在酒精火焰附近倒平板。注意：溶化后應(yīng)該調(diào)節(jié)PH（在滅菌前）第17頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四?思考3①溶化時為什么要將牛肉膏連同稱量紙一起加熱?

②加瓊脂的目的是什么?可保證粘附在稱量紙上的牛肉膏也能溶于水中,減少誤差作為凝固劑第18頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四思考4

①在滅菌前,用牛皮紙、舊報(bào)紙包緊盛有培養(yǎng)基的錐形瓶的目的是什么？?在滅菌時能避免水蒸汽凝結(jié)時浸濕棉塞；在取出培養(yǎng)基錐形瓶時也能起到隔絕空氣中雜菌污染的作用第19頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四倒平板:第20頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四1).培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？問題討論

答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。2).為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第21頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四3).平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4).在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。第22頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四四、純化大腸桿菌

微生物接種方法常見的有平板劃線法和稀釋涂布平板法。（1）.平板劃線法通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體稱菌落。第23頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四學(xué)科網(wǎng)第24頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)_______在_______旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞將試管口通過火焰.將已______的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃__________條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。.將試管通過火焰，并塞上棉塞火焰冷卻三至五灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的_______開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。末端燒紅將平板_____放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

倒置第25頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四

思考：1、為什么在操作的第一步要灼燒接種環(huán)？

操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；思考：2、每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？

每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。思考：3、在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？

劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第26頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四思考：3、在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？避免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種思考：4、在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。第27頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四平板劃線法的要點(diǎn)接種前，每次劃線前及接種后都要灼燒接種環(huán)接種環(huán)灼燒后等其冷卻后再進(jìn)行劃線第二次及其之后的劃線操作，總是從上一次劃線的末端開始劃線第28頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四固體培養(yǎng)基：菌落（2）稀釋涂布平板法

將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。第29頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中

取少量稀釋液（不要超過0.1ml）滴加到培養(yǎng)基表面

灼燒

待酒精燃盡后冷卻8～10s

涂布將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使菌液涂布均勻第30頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四

思考：1、涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？

應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。稀釋涂布平板法的要點(diǎn)用移液管吸取液體之前先搖勻所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行涂布器從酒精中取出后，要在火焰上將其上的酒精燒掉涂布器要冷卻（5—10s）后再進(jìn)行涂布涂布要均勻，且涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使菌液均勻分布第31頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四五.結(jié)果分析與評價㈠.培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。㈡.接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。㈢.是否進(jìn)行了及時細(xì)致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。第32頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四大腸桿菌的純化培養(yǎng)分為制備培養(yǎng)基和純化大腸桿菌兩個階段；實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組（接種大腸桿菌的培