無(wú)菌檢查與微生物限度檢查

無(wú)菌檢查與微生物限度檢查1第1頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

自2002年微生物專業(yè)委員會(huì)成立至今，我國(guó)藥品微生物檢驗(yàn)有了革命性的進(jìn)步，2005版藥典明確了對(duì)檢測(cè)環(huán)境的要求、對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的制訂原則做了科學(xué)的修訂及引入驗(yàn)證理念等；2010版藥典增加對(duì)培養(yǎng)基適用性檢查、新增了藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則等4個(gè)附錄。從人員、培養(yǎng)基、菌種、實(shí)驗(yàn)室的布局和運(yùn)行、設(shè)備、文件、實(shí)驗(yàn)記錄、結(jié)果的判斷等方面提出了明確的要求。山東省藥品檢驗(yàn)所2第2頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五微生物實(shí)驗(yàn)室建設(shè)問(wèn)題無(wú)菌檢查常見(jiàn)問(wèn)題微生物限度檢查常見(jiàn)問(wèn)題抑菌效力檢查法山東省藥品檢驗(yàn)所3第3頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

微生物實(shí)驗(yàn)室建設(shè)問(wèn)題基本原則防止微生物污染事件的發(fā)生（包括對(duì)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)人員、試驗(yàn)樣品等的）。有利于試驗(yàn)操作的進(jìn)行山東省藥品檢驗(yàn)所4第4頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五USP對(duì)于實(shí)驗(yàn)室布局和運(yùn)作的規(guī)定LayoutofthelabshouldenhanceoperationsPreventcorss-contaminationSeparationofactivitiesPromoteSaftyLabareashouldhaveseparate“clean”and“l(fā)iveculture”areaspoints,barriersWhenasamplehasgrowth,allfurtherworkinthe“l(fā)iveculture”areaSamplingshouldtakeplacecarefullyasepticconditionsEMequipmentshouldbeloadedenviromenttobesampled,andcarefullyhandledIsolatortechnologymaybeuseful山東省藥品檢驗(yàn)所5第5頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五微生物實(shí)驗(yàn)室可單獨(dú)建設(shè)也可共用普通建筑，但應(yīng)自成一區(qū)，單獨(dú)設(shè)立一層，或一層樓的一端。與建筑物其它區(qū)域相通的部分應(yīng)有門(mén)相隔。可按四區(qū)域劃分：核心實(shí)驗(yàn)區(qū)、緩沖輔助區(qū)、PII級(jí)生物安全區(qū)、一般實(shí)驗(yàn)及準(zhǔn)備區(qū)。核心實(shí)驗(yàn)區(qū)可按具體工作需要?jiǎng)澐譃閿?shù)個(gè)試驗(yàn)單元，核心區(qū)各實(shí)驗(yàn)單元最好獨(dú)立運(yùn)行，核心區(qū)與PII級(jí)生物安全區(qū)不得共用一套換風(fēng)系統(tǒng)，嚴(yán)格控制交叉污染的發(fā)生。各房間應(yīng)功能明確，不得混用。藥品檢驗(yàn)、食品檢驗(yàn)、化妝品檢驗(yàn)等不得共用無(wú)菌室和緩沖間，防止交叉污染。準(zhǔn)備室、潔凈室、培養(yǎng)室等布局，應(yīng)方便物品的傳送，設(shè)置可以互鎖的潔凈雙扉傳遞窗，堅(jiān)決避免直接的空氣交換防止交叉污染。

微生物實(shí)驗(yàn)室房門(mén)應(yīng)盡量實(shí)現(xiàn)自動(dòng)關(guān)閉，緩沖區(qū)門(mén)為互鎖。同一區(qū)域內(nèi)各實(shí)驗(yàn)單元房門(mén)應(yīng)朝向同一方向或交錯(cuò)布局，防止直接的空氣交換。山東省藥品檢驗(yàn)所6第6頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五除地面、墻面、頂棚和工作臺(tái)外，傳遞窗、物品臺(tái)、坐凳、門(mén)把手等細(xì)微環(huán)節(jié)，也應(yīng)做到易于清潔，耐腐蝕、不起塵、不開(kāi)裂、光滑防水，便于消毒。潔凈室內(nèi)照明、紫外、超凈工作臺(tái)等儀器設(shè)備開(kāi)關(guān)易設(shè)置在第1緩沖間以外，便于控制。潔凈室內(nèi)各區(qū)域的風(fēng)速、壓差、溫度、濕度顯示等易設(shè)置在第1緩沖間以外或第1緩沖間外可以觀察到的地方，便于觀察紀(jì)錄，實(shí)時(shí)提示屏障系統(tǒng)的有效性。潔凈區(qū)內(nèi)部和外部宜設(shè)置對(duì)講設(shè)備，便于實(shí)驗(yàn)人員的信息交流和協(xié)作。潔凈室內(nèi)不應(yīng)安裝水槽、水管、上下水道等，避免滋生微生物。微生物實(shí)驗(yàn)室空調(diào)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)應(yīng)充分考慮生物安全柜、恒溫水浴、培養(yǎng)箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌器等冷、熱、濕和污染負(fù)荷。無(wú)菌室內(nèi)不宜放置水浴等對(duì)濕度影響較大的儀器，如需要放置應(yīng)加蓋，并經(jīng)常換水，防止微生物滋生由于實(shí)驗(yàn)室建成后，結(jié)構(gòu)布局很難變更，所以應(yīng)對(duì)未來(lái)的人員編制、檢驗(yàn)內(nèi)容、工作量、所需儀器做出規(guī)劃，充分考慮實(shí)驗(yàn)室的承載能力，必要時(shí)預(yù)留部分空間。山東省藥品檢驗(yàn)所7第7頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

山東省藥檢所微生物實(shí)驗(yàn)室平面圖山東省藥品檢驗(yàn)所8第8頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

微生物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境監(jiān)控保證微生物實(shí)驗(yàn)室安全、有效運(yùn)行對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性做出有力支持

微生物實(shí)驗(yàn)室建成后，必須配備相應(yīng)的環(huán)境監(jiān)控設(shè)備：浮游菌采集器、塵埃粒子計(jì)數(shù)器、風(fēng)速儀、壓差計(jì)、照度計(jì)和噪聲計(jì)等等，對(duì)于微生物實(shí)驗(yàn)室環(huán)境保持，以定期監(jiān)控為主要手段。過(guò)多的消毒、熏蒸會(huì)對(duì)無(wú)菌室的通風(fēng)系統(tǒng)管路和試驗(yàn)儀器造成一定的腐蝕，影響使用壽命，不合理的擦拭反而可能會(huì)增加無(wú)菌室污染的機(jī)會(huì)，同一種消毒劑的反復(fù)使用可能會(huì)使微生物對(duì)消毒劑的耐受力增強(qiáng)。因此，應(yīng)根據(jù)監(jiān)測(cè)情況制定相應(yīng)的清潔計(jì)劃。山東省藥品檢驗(yàn)所9第9頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

微生物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境監(jiān)控

——環(huán)境菌庫(kù)的建立

方法定期采集潔凈室沉降菌及浮游菌，采用適宜的方法對(duì)搜集到的菌株進(jìn)行鑒定，包括形態(tài)觀察、生化鑒定、遺傳信息分析（16sRNA測(cè)序、DNA脈沖場(chǎng)電泳分析等）、傅里葉紅外光譜分析等，對(duì)每一株菌建立詳細(xì)檔案。目的

1.分析無(wú)菌室環(huán)境菌種類、數(shù)量、分布隨時(shí)間的變化關(guān)系，制定相應(yīng)的消毒計(jì)劃和工作計(jì)劃。

2.判斷藥品檢出微生物是否是環(huán)境相關(guān)菌，是否與本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境菌相關(guān)。山東省藥品檢驗(yàn)所10第10頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

企業(yè)生產(chǎn)區(qū)域環(huán)境菌庫(kù)的建立

當(dāng)企業(yè)產(chǎn)品的滅菌條件和產(chǎn)品穩(wěn)定性之間產(chǎn)生矛盾時(shí)，該如何處理？山東省藥品檢驗(yàn)所11第11頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五解決方案：建立生產(chǎn)過(guò)程中關(guān)鍵區(qū)域的微生物監(jiān)控體系，通過(guò)長(zhǎng)期監(jiān)控，找出關(guān)鍵區(qū)域常見(jiàn)抗性菌株，并據(jù)此建立新的滅菌條件。否則，如果環(huán)境中監(jiān)測(cè)到更強(qiáng)的耐熱菌株，則應(yīng)立刻停止生產(chǎn)，進(jìn)行徹底消毒。此外建立環(huán)境微生物庫(kù)和實(shí)時(shí)監(jiān)控體系，根據(jù)環(huán)境微生物的變化規(guī)律制定相應(yīng)防范措施和消毒計(jì)劃，并可對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)品污染環(huán)節(jié)進(jìn)行排查堵漏。山東省藥品檢驗(yàn)所12第12頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

FTIR法用于藥品檢出菌與環(huán)境菌關(guān)聯(lián)性分析

定期（月）環(huán)境菌采集FTIR圖譜測(cè)定圖譜累積匯總總體環(huán)境菌譜庫(kù)當(dāng)月環(huán)境菌譜庫(kù)藥品微生物檢查FTIR圖譜測(cè)定D≤0.04D＞0.04非環(huán)境菌疑為內(nèi)源性環(huán)境菌外源性環(huán)境菌D≤0.04D＞0.04環(huán)境菌山東省藥品檢驗(yàn)所13第13頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五將27株藥物分離菌平均光譜分別代入譜庫(kù)分析，11株Hit值＜0.04，占40.7%，懷疑與環(huán)境菌相關(guān)。其中7株分離自六味地黃丸，檢出時(shí)間：06年9月。帶入當(dāng)月譜庫(kù)分析：5株Hit值＜0.04，而當(dāng)月正處于無(wú)菌室改造未完成時(shí)，所以存在本實(shí)驗(yàn)環(huán)境污染的可能性。其中四株檢出于06年12月，代入當(dāng)月譜庫(kù)分析：4株Hit值均＞0.04，說(shuō)明這四株菌可能為外源性環(huán)境相關(guān)菌。山東省藥品檢驗(yàn)所14第14頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2010年版藥典無(wú)菌檢查法的結(jié)果判斷解讀（1）無(wú)菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無(wú)菌檢查法的要求。（2）回顧無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。（3）供試品管中生長(zhǎng)的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無(wú)菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。山東省藥品檢驗(yàn)所15第15頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

微生物鑒定分析工具書(shū)

《伯杰細(xì)菌手冊(cè)》、《真菌鑒定手冊(cè)》形態(tài)學(xué)生物顯微鏡（最好帶成像系統(tǒng)）生化鑒定手工生化鑒定試劑盒（例如：apiwebTM鑒定軟件價(jià)格便宜，國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)作為常規(guī)配備）全自動(dòng)生化分析儀（例如VITKE2，價(jià)格較貴，可實(shí)現(xiàn)大批量檢驗(yàn)）分子生物學(xué)例如16sRNA測(cè)序、熒光定量PCR等，價(jià)格較貴，高速、敏感和特異性，用于微生物追蹤溯源）傅立葉變換紅外光譜法

Tensor27-HTSXT型微生物鑒定紅外光譜儀，快速，用于環(huán)境菌監(jiān)控及微生物鑒定初篩）

山東省藥品檢驗(yàn)所16第16頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

藥品微生物鑒定一般程序

未知微生物（來(lái)源于供試品、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、檢驗(yàn)過(guò)程等等）

↓選擇適宜的培養(yǎng)方式進(jìn)行純化培養(yǎng)（培養(yǎng)基的選擇，需、厭氧條件，培↓養(yǎng)溫度，是否選擇振蕩培養(yǎng)等等）觀察、描述菌落形態(tài)↓革蘭染色及氧化酶試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)等（根據(jù)染色結(jié)果、細(xì)菌形態(tài)、初步的↓↓生化試驗(yàn)信息和鑒定目的等等選擇適宜的鑒定方法）↓↓↓生化鑒定分子生物學(xué)FTIR（或幾種方法聯(lián)合使用）

↓結(jié)果分析（綜合整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的所有信息，分析鑒定結(jié)果）↓結(jié)論

山東省藥品檢驗(yàn)所17第17頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

微生物鑒定分析的意義檢驗(yàn)過(guò)程中，不能對(duì)所檢出的微生物進(jìn)行鑒定分析或做出一定的說(shuō)明，就不能算是一次完整的微生物檢查試驗(yàn)。無(wú)菌檢查法中，增加檢出菌檢定規(guī)定是藥典發(fā)展的必然趨勢(shì)。控制菌判斷：由“應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗(yàn)”改為“應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗(yàn)”

注重微生物鑒定能力的提高非常重要！山東省藥品檢驗(yàn)所18第18頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

無(wú)菌檢查前言說(shuō)明防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出日常檢驗(yàn)還需要對(duì)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控?zé)o菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過(guò)無(wú)菌技術(shù)的培訓(xùn)。

新增的三點(diǎn)說(shuō)明，使得本版藥典對(duì)藥品檢測(cè)機(jī)構(gòu)微生物檢驗(yàn)的綜合能力及軟、硬件配制上，都有了更高的要求。山東省藥品檢驗(yàn)所19第19頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

對(duì)照品培養(yǎng)基經(jīng)適用性檢查合格的培養(yǎng)基是否可以作為對(duì)照培養(yǎng)基使用？山東省藥品檢驗(yàn)所20第20頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

對(duì)照培養(yǎng)基系指按培養(yǎng)基處方特別制備、質(zhì)量?jī)?yōu)良的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)基適用性檢查。由中國(guó)藥品生物制品檢定所研制及分發(fā)。山東省藥品檢驗(yàn)所21第21頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

稀釋液、沖洗液的問(wèn)題如何選擇稀釋液和沖洗液？薄膜過(guò)濾法中規(guī)定總的沖洗量不得超過(guò)1000ml，而對(duì)稀釋液沒(méi)有作出具體規(guī)定，稀釋液的用量多少為易？山東省藥品檢驗(yàn)所22第22頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁的判斷問(wèn)題新版藥典規(guī)定：“取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌?！睘楹尾辉龠M(jìn)行直接劃線培養(yǎng)？如果使用液體培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色，培養(yǎng)基成分是否會(huì)對(duì)鏡檢觀察造成影響？如何解決？山東省藥品檢驗(yàn)所23第23頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

驗(yàn)證用菌種的問(wèn)題驗(yàn)證試驗(yàn)用菌種及菌液制備在培養(yǎng)基靈敏度所用菌種的基礎(chǔ)上，刪除了銅綠假單胞菌，增訂了大腸埃希菌。

在驗(yàn)證試驗(yàn)的實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)作為革蘭氏陰性桿菌代表的銅綠假單胞菌在驗(yàn)證試驗(yàn)中對(duì)大部分抗生素不敏感，而大腸埃希菌對(duì)抗革蘭氏陰性桿菌為主的抗生素敏感性較好。山東省藥品檢驗(yàn)所24第24頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

黑曲霉菌的相關(guān)試驗(yàn)污染及防護(hù)問(wèn)題2005版中國(guó)藥典開(kāi)始使用黑曲霉菌作為試驗(yàn)用菌種，但試驗(yàn)過(guò)程中，針對(duì)該菌種的安全防護(hù)問(wèn)題仍未得到明確而有效的解決方案，因此，時(shí)至今日許多藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)和制藥企業(yè)仍未開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。山東省藥品檢驗(yàn)所25第25頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

黑曲霉菌特性生長(zhǎng)速度快，胞子易通過(guò)空氣擴(kuò)散。在普通環(huán)境中生命力較強(qiáng)，傳統(tǒng)的紫外線、循環(huán)風(fēng)凈化和中低效消毒劑對(duì)其作用效果較差，需高效消毒劑方可將其殺滅，例如：苯酚酸類、苯酚堿類等等不耐熱，70℃左右即可被殺滅。能分泌有機(jī)酸和毒素，但關(guān)于黑曲霉對(duì)人體治病的案例并不多見(jiàn)。山東省藥品檢驗(yàn)所26第26頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行黑曲霉試驗(yàn)的通常做法：采用傳統(tǒng)的超凈工作臺(tái)，關(guān)閉風(fēng)機(jī)，靠近火焰。采用生物安全柜采用負(fù)壓隔離器山東省藥品檢驗(yàn)所27第27頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第一種由于凈化臺(tái)本身屬非密閉性操作臺(tái)，與外界環(huán)境的氣流交換無(wú)法避免，因此，無(wú)論是對(duì)實(shí)驗(yàn)人員、供試品或?qū)嶒?yàn)環(huán)境都存在嚴(yán)重污染隱患；第二種方法較第一種方法在一定程度上可以保證供試品和實(shí)驗(yàn)人員免受污染，但實(shí)驗(yàn)后工作臺(tái)面的消毒問(wèn)題，特別是富集于生物安全柜HEPA上的黑曲霉胞子較難殺滅、清除，成為潛在污染源。第三種方法，全封閉的負(fù)壓隔離系統(tǒng)有效防止了微生物污染問(wèn)題，且有利于高效消毒劑發(fā)揮作用。山東省藥品檢驗(yàn)所28第28頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

實(shí)驗(yàn)室根據(jù)黑曲霉菌特性和自身實(shí)際，制定一套合理的解決方案。山東省藥品檢驗(yàn)所29第29頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

微生物限度檢查方法選擇的原則供試液制備方法、抑菌成分的消除方法及細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法應(yīng)盡量選擇微生物限度檢查法中操作簡(jiǎn)便、快速的方法，且應(yīng)避免損傷供試品中污染的微生物。對(duì)于抑菌作用較強(qiáng)的供試品，在供試品溶液性狀允許的情況下，應(yīng)盡量選用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行試驗(yàn)。山東省藥品檢驗(yàn)所30第30頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證過(guò)程中供試品稀釋級(jí)選擇問(wèn)題沒(méi)有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用而導(dǎo)致微生物回收的失敗，可采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。低稀釋劑菌落計(jì)數(shù)過(guò)多，影響方法驗(yàn)證的結(jié)果計(jì)算，可采用適于方法驗(yàn)證的稀釋級(jí)供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。此時(shí)更高稀釋級(jí)供試液的確認(rèn)要從低往高的稀釋級(jí)進(jìn)行，但最高稀釋級(jí)供試液選擇應(yīng)根據(jù)供試品應(yīng)符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，如供試品應(yīng)符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是1克細(xì)菌數(shù)不得過(guò)1000cfu，那么最高稀釋級(jí)是1：10-3。山東省藥品檢驗(yàn)所31第31頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的相關(guān)問(wèn)題何種情況下，可選擇更高一級(jí)的供試品稀釋液進(jìn)行方法驗(yàn)證和檢驗(yàn)？山東省藥品檢驗(yàn)所32第32頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五供試品采用常規(guī)方法檢驗(yàn)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果不符合規(guī)定，是否還要進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)？計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí)，如不能尋找到各驗(yàn)證用菌回收率均能達(dá)到要求的有效方法時(shí)，該如何進(jìn)行檢查？山東省藥品檢驗(yàn)所33第33頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

控制菌檢查新版藥典增加了“控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查”檢驗(yàn)項(xiàng)目包括促生長(zhǎng)能力、抑制能力及指示能力的檢查刪除“控制菌驗(yàn)證時(shí)的陰性菌對(duì)照組”控制菌判斷：由“應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗(yàn)”修訂為“應(yīng)進(jìn)行分離、純