顯微鏡成像方法與技術(shù)

顯微鏡成像方法與技術(shù)第1頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五電子顯微鏡

電子顯微鏡，簡(jiǎn)稱(chēng)電鏡，是根據(jù)電子光學(xué)原理，用電子束和電子透鏡代替光束和光學(xué)透鏡，使物質(zhì)的細(xì)微結(jié)構(gòu)在非常高的放大倍數(shù)下成像的儀器。在光學(xué)顯微鏡下無(wú)法看清小于0.2μm的細(xì)微結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)稱(chēng)為亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。要想看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長(zhǎng)更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年Ruska發(fā)明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡，電子束的波長(zhǎng)要比可見(jiàn)光和紫外光短得多，并且電子束的波長(zhǎng)與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說(shuō)電壓越高波長(zhǎng)越短。目前透射電鏡的分辨力可達(dá)0.2nm。第2頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五電鏡的分類(lèi)

電子顯微鏡按結(jié)構(gòu)和用途可分為透射式電子顯微鏡、掃描式電子顯微鏡、反射式電子顯微鏡和發(fā)射式電子顯微鏡等。透射式電子顯微鏡常用于觀察那些用普通顯微鏡所不能分辨的細(xì)微物質(zhì)結(jié)構(gòu)；掃描式電子顯微鏡主要用于觀察固體表面的形貌，也能與X射線衍射儀或電子能譜儀相結(jié)合，構(gòu)成電子微探針，用于物質(zhì)成分分析；發(fā)射式電子顯微鏡用于自發(fā)射電子表面的研究。第3頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五電鏡的分辨本領(lǐng)

在光學(xué)中，分辨率（分辨極限）即指光學(xué)儀器可以分辨的兩個(gè)物點(diǎn)之間的最小距離。由于瑞利斑（愛(ài)里斑）的關(guān)系，顯微鏡物鏡的分辨極限為：

δ＝0.61λ/nsinθ

式中λ為入射光波長(zhǎng)，n是物方介質(zhì)的折射率，2θ為物鏡對(duì)物體的張角（孔徑角），nsinθ為物鏡的數(shù)值孔徑，以N.A.表示。通過(guò)增大數(shù)值孔徑或縮短光源波長(zhǎng)都可以提高物鏡的分辨率。從增大數(shù)值孔徑N.A.來(lái)提高分辨率是很有限和困難的，最有效的方法是縮短光源的波長(zhǎng)，電鏡所采用的電子波長(zhǎng)λ為：

λ＝12.25?/√V

可見(jiàn)，只要提高加速電壓V就可以得到短波長(zhǎng)的電子波，分辨率也就相應(yīng)得到提高。物體物鏡θ第4頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一、透射電鏡

透射式電子顯微鏡（TEM，TransmissionElectronMicroscopy，亦稱(chēng)投射式電子顯微鏡）因電子束穿透樣品后，再用電子透鏡成像放大而得名。它的光路與光學(xué)顯微鏡相仿，可以直接獲得一個(gè)樣本的投影。通過(guò)改變物鏡的透鏡系統(tǒng)人們可以直接放大物鏡的焦點(diǎn)的像。由此人們可以獲得電子衍射像。使用這個(gè)像可以分析樣本的晶體結(jié)構(gòu)。在這種電子顯微鏡中，圖像細(xì)節(jié)的對(duì)比度是由樣品的原子對(duì)電子束的散射形成的。由于電子需要穿過(guò)樣本，因此樣本必須非常薄。組成樣本的原子的原子量、加速電子的電壓和所希望獲得的分辨率決定樣本的厚度。樣本的厚度可以從數(shù)納米到數(shù)微米不等。原子量越高、電壓越低，樣本就必須越薄。樣品較薄或密度較低的部分，電子束散射較少，這樣就有較多的電子通過(guò)物鏡光欄，參與成像，在圖像中顯得較亮。反之，樣品中較厚或較密的部分，在圖像中則顯得較暗。如果樣品太厚或過(guò)密，則像的對(duì)比度就會(huì)惡化，甚至?xí)蛭针娮邮哪芰慷粨p傷或破壞。第5頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五JEM-2010F透射電鏡

第一部實(shí)際工作的TEM，現(xiàn)在在德國(guó)慕尼黑的遺址博物館展出。第6頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五工作原理

透射電鏡的總體工作原理是：由電子槍發(fā)射出來(lái)的電子束，在真空通道中沿著鏡體光軸穿越聚光鏡，通過(guò)聚光鏡將之會(huì)聚成一束尖細(xì)、明亮而又均勻的光斑，照射在樣品室內(nèi)的樣品上；透過(guò)樣品后的電子束攜帶有樣品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息，樣品內(nèi)致密處透過(guò)的電子量少，稀疏處透過(guò)的電子量多；經(jīng)過(guò)物鏡的會(huì)聚調(diào)焦和初級(jí)放大后，電子束進(jìn)入下級(jí)的中間透鏡和第1、第2投影鏡進(jìn)行綜合放大成像，最終被放大了的電子影像投射在觀察室內(nèi)的熒光屏板上；熒光屏將電子影像轉(zhuǎn)化為可見(jiàn)光影像以供使用者觀察?；镜腡EM光學(xué)元件布局圖

第7頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五TEM的結(jié)構(gòu)TEM由幾大部分組成：照明系統(tǒng)；成像系統(tǒng)；記錄系統(tǒng)；真空系統(tǒng)；電氣系統(tǒng)。

1.照明系統(tǒng)主要由電子槍和聚光鏡組成。

電子槍是發(fā)射電子的照明源。

聚光鏡是把電子槍發(fā)射出來(lái)的電子束進(jìn)一步會(huì)聚后照射到樣品上。照明系統(tǒng)的作用就是提供一束亮度高、照明孔徑角小、平行度好、束流穩(wěn)定的照明源。電子槍的構(gòu)成第8頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

2.成像系統(tǒng)即電子光學(xué)系統(tǒng)，又稱(chēng)鏡筒，是透射電鏡的主體。成像系統(tǒng)主要由物鏡、中間鏡和投影鏡組成。

物鏡是用來(lái)形成第一幅高分辨率電子顯微圖像或電子衍射花樣的透鏡。透射電子顯微鏡分辨本領(lǐng)的高低主要取決于物鏡。因?yàn)槲镧R的任何缺陷都被成像系統(tǒng)中其它透鏡進(jìn)一步放大。欲獲得物鏡的高分辨率，必須盡可能降低像差。通常采用強(qiáng)激磁，短焦距的物鏡。物鏡是一個(gè)強(qiáng)激磁短焦距的透鏡，它的放大倍數(shù)較高，一般為100-300倍。目前，高質(zhì)量的物鏡其分辨率可達(dá)0.1nm左右。

中間鏡是一個(gè)弱激磁的長(zhǎng)焦距變倍透鏡，可在0-20倍范圍調(diào)節(jié)。當(dāng)M>1時(shí)，用來(lái)進(jìn)一步放大物鏡的像；當(dāng)M<1時(shí)，用來(lái)縮小物鏡的像。在電鏡操作過(guò)程中，主要是利用中間鏡的可變倍率來(lái)控制電鏡的放大倍數(shù)。TEM分裂極靴設(shè)計(jì)透鏡示意圖

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投影鏡的作用是把經(jīng)中間鏡放大（或縮小）的像（電子衍射花樣）進(jìn)一步放大，并投影到熒光屏上，它和物鏡一樣，是一個(gè)短焦距的強(qiáng)磁透鏡。投影鏡的激磁電流是固定的。因?yàn)槌上耠娮邮M(jìn)入投影鏡時(shí)孔鏡角很?。s10-3rad），因此它的景深和像距都非常大。即使改變中間鏡的放大倍數(shù)，使顯微鏡的總放大倍數(shù)有很大的變化，也不會(huì)影響圖像的清晰度。有時(shí)，中間鏡的像平面還會(huì)出現(xiàn)一定的位移，由于這個(gè)位移距離仍處于投影鏡的景深范圍之內(nèi)，因此，在熒光屏上的圖像仍舊是清晰的。

電子圖像的放大倍數(shù)為物鏡、中間鏡和投影鏡的放大倍數(shù)之乘積。第10頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

3.觀察和記錄裝置包括熒光屏和照相機(jī)構(gòu)。在熒光屏下面放置一下可以自動(dòng)換片的照相暗盒，照相時(shí)只要把熒光屏豎起，電子束即可使照相底片曝光。由于透射電子顯微鏡的焦長(zhǎng)很大，雖然熒光屏和底片之間有數(shù)十厘米的間距，仍能得到清晰的圖像。TEM的電子源在頂端，透鏡系統(tǒng)（4、7、8）將電子束聚焦于樣品上，隨后將其投影在顯示屏（10）上?？刂齐娮邮脑O(shè)備位于右方（13和14）。

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4.真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)的作用有兩方面，一方面可以在陰極和地之間加以很高的電壓，而不會(huì)將空氣擊穿產(chǎn)生電弧，另一方面可以將電子和空氣原子的撞擊頻率減小到可以忽略的量級(jí)，這個(gè)效應(yīng)通常使用平均自由程來(lái)描述。標(biāo)準(zhǔn)的TEM需要將電子的通路抽成氣壓很低的真空，通常需要達(dá)到10?4帕。由于TEM的元件如樣品夾具和膠卷盒需要經(jīng)常插入電子束通路，或者需要更換，因此系統(tǒng)需要能夠重新抽成真空。因此，TEM不能采用永久密封的方法來(lái)保持真空，而是需要裝備多個(gè)抽氣系統(tǒng)以及氣閘。第12頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五樣品制備

透射電子顯微鏡在材料科學(xué)、生物學(xué)上應(yīng)用較多。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，樣品的密度、厚度等都會(huì)影響到最后的成像質(zhì)量，必須制備更薄的超薄切片，通常為50～100nm。所以用透射電子顯微鏡觀察時(shí)的樣品需要處理得很薄。常用的方法有：超薄切片法、冷凍超薄切片法、冷凍蝕刻法、冷凍斷裂法等。對(duì)于液體樣品，通常是掛預(yù)處理過(guò)的銅網(wǎng)上進(jìn)行觀察。透射電鏡樣品制備：取材（小于1立方毫米）→固定→脫水→包埋→固化→切片（50-60nm）→雙染色→電鏡觀察萊卡超薄切片機(jī)

TEM樣品支撐網(wǎng)格，其上有一超薄切片。

一個(gè)單軸傾斜樣品夾具，它可以插入TEM的測(cè)角儀。傾斜這個(gè)夾具可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)整個(gè)測(cè)角儀來(lái)實(shí)現(xiàn)。第13頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖（偽彩色）

冰凍蝕刻電鏡照片

第14頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

TEM的局限性

上世紀(jì)，TEM的最佳分辨率為1.4?（日本日立制作最新型300萬(wàn)伏超高壓電子顯微鏡）。由于電子透鏡球面像差的限制，也由于生物樣品的反差不足，電鏡分辨率不能達(dá)到理論的極限值1?的水平。電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)雖已遠(yuǎn)勝于光學(xué)顯微鏡，但電子顯微鏡因需在真空條件下工作，所以很難觀察活的生物，而且電子束的照射也會(huì)使生物樣品受到輻照損傷。電鏡對(duì)于電子束通道（即鏡筒內(nèi)腔）的真空度要求很高，鏡筒部分真空的好壞是決定電鏡能否正常工作的關(guān)鍵之一。因?yàn)樵陔婄R中，高速電子與氣體的相互作用，會(huì)使高速電子散射而偏離直線軌道，所以要使鏡筒中的殘余氣體盡量的減少以保證電子的自由行程。電鏡鏡筒中的電子行程約為1m，經(jīng)計(jì)算真空度應(yīng)為1.33X10-1Pa。一般超高壓電鏡的真空度可達(dá)到這個(gè)水平。第15頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

二、掃描電鏡

掃描電子顯微鏡（ScanningElectronMicroscope，SEM）的制造是依據(jù)電子與物質(zhì)的相互作用。當(dāng)一束高能的入射電子轟擊物質(zhì)表面時(shí)，被激發(fā)的區(qū)域?qū)a(chǎn)生二次電子、俄歇電子、特征X射線和連續(xù)譜X射線、背散射電子、透射電子，以及在可見(jiàn)、紫外、紅外光區(qū)域產(chǎn)生的電磁輻射。同時(shí)，也可產(chǎn)生電子-空穴對(duì)、晶格振動(dòng)(聲子)、電子振蕩(等離子體)。原則上講，利用電子和物質(zhì)的相互作用，可以獲取被測(cè)樣品本身的各種物理、化學(xué)性質(zhì)的信息，如形貌、組成、晶體結(jié)構(gòu)、電子結(jié)構(gòu)和內(nèi)部電場(chǎng)或磁場(chǎng)等等。掃描電子顯微鏡正是根據(jù)上述不同信息產(chǎn)生的機(jī)理，采用不同的信息檢測(cè)器，使選擇檢測(cè)得以實(shí)現(xiàn)。如對(duì)二次電子、背散射電子的采集，可得到有關(guān)物質(zhì)微觀形貌的信息；對(duì)x射線的采集，可得到物質(zhì)化學(xué)成分的信息。正因如此，根據(jù)不同需求，可制造出功能配置不同的掃描電子顯微鏡。第16頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

二次電子Secondaryelectron

二次電子是指被入射電子轟擊出來(lái)的核外電子。由于原子核和外層價(jià)電子間的結(jié)合能很小，當(dāng)原子的核外電子從入射電子獲得了大于相應(yīng)的結(jié)合能的能量后，可脫離原子成為自由電子。如果這種散射過(guò)程發(fā)生在比較接近樣品表層處，那些能量大于材料逸出功的自由電子可從樣品表面逸出，變成真空中的自由電子，即二次電子。二次電子來(lái)自表面5-10nm的區(qū)域，能量為0-50eV。它對(duì)試樣表面狀態(tài)非常敏感，能有效地顯示試樣表面的微觀形貌。由于它發(fā)自試樣表層，入射電子還沒(méi)有被多次反射，因此產(chǎn)生二次電子的面積與入射電子的照射面積沒(méi)有多大區(qū)別，所以二次電子的分辨率較高，一般可達(dá)到5-10nm。掃描電鏡的分辨率一般就是二次電子分辨率。二次電子產(chǎn)額隨原子序數(shù)的變化不大，它主要取決于表面形貌。入射電子與樣品核外電子碰撞，使樣品表面的核外電子被激發(fā)出來(lái)，作為SEM的成像信號(hào)，代表樣品表面的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

第17頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五SEM的構(gòu)成

掃描電子顯微鏡由三大部分組成：真空系統(tǒng)，電子束系統(tǒng)以及成像系統(tǒng)。

1.真空系統(tǒng)主要包括真空泵和真空柱兩部分。真空柱是一個(gè)密封的柱形容器。成象系統(tǒng)和電子束系統(tǒng)均內(nèi)置在真空柱中。

2.電子束系統(tǒng)由電子槍和電磁透鏡兩部分組成，主要用于產(chǎn)生一束能量分布極窄的、電子能量確定的電子束用以掃描成象。電子槍用于產(chǎn)生電子，主要有兩大類(lèi)。一類(lèi)是利用場(chǎng)致發(fā)射效應(yīng)產(chǎn)生電子，另一類(lèi)是利用熱發(fā)射效應(yīng)產(chǎn)生電子。電磁透鏡熱發(fā)射電子需要電磁透鏡來(lái)成束，所以在用熱發(fā)射電子槍的SEM上，電磁透鏡必不可少。通常會(huì)裝配兩組，匯聚透鏡和物鏡。匯聚透鏡用于匯聚電子束，裝配在真空柱中，位于電子槍之下。通常不止一個(gè)，并有一組匯聚光圈與之相配。但匯聚透鏡僅僅用于匯聚電子束，與成象會(huì)焦無(wú)關(guān)。物鏡為真空柱中最下方的一個(gè)電磁透鏡，它負(fù)責(zé)將電子束的焦點(diǎn)匯聚到樣品表面。

第18頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

3.成像系統(tǒng)電子經(jīng)過(guò)一系列電磁透鏡成束后，打到樣品上與樣品相互作用，會(huì)產(chǎn)生次級(jí)電子、背散射電子、俄歇電子以及X射線等一系列信號(hào)。所以需要不同的探測(cè)器譬如次級(jí)電子探測(cè)器、X射線能譜分析儀等來(lái)區(qū)分這些信號(hào)以獲得所需要的信息。

第19頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五SEM的工作原理

由最上邊電子槍發(fā)射出來(lái)的電子束，經(jīng)柵極聚焦后，在加速電壓作用下經(jīng)過(guò)二至三個(gè)電磁透鏡所組成的電子光學(xué)系統(tǒng)，電子束會(huì)聚成一個(gè)細(xì)的電子束聚焦在樣品表面。在末級(jí)透鏡上邊裝有掃描線圈，在它的作用下使電子束在樣品表面掃描。由于高能電子束與樣品物質(zhì)的交互作用，結(jié)果產(chǎn)生了各種信息：二次電子、背反射電子、吸收電子、X射線、俄歇電子、陰極發(fā)光和透射電子等。這些信號(hào)被相應(yīng)的接收器接收，經(jīng)放大后送到顯像管的柵極上，調(diào)制顯像管的亮度。由于經(jīng)過(guò)掃描線圈上的電流是與顯像管相應(yīng)的亮度一一對(duì)應(yīng)，也就是說(shuō)，電子束打到樣品上一點(diǎn)時(shí)，在顯像管熒光屏上就出現(xiàn)一個(gè)亮點(diǎn)。掃描電鏡就是這樣采用逐點(diǎn)成像的方法，把樣品表面不同的特征，按順序，成比例地轉(zhuǎn)換為視頻信號(hào)，完成一幀圖像，從而使我們?cè)跓晒馄辽嫌^察到樣品表面的各種特征圖像。掃描電鏡原理示意圖第20頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五SEM基本參數(shù)

1.放大率與普通光學(xué)顯微鏡不同，在SEM中，是通過(guò)控制掃描區(qū)域的大小來(lái)控制放大率的。如果需要更高的放大率，只需要掃描更小的一塊面積就可以了。放大率由屏幕或照片面積除以掃描面積得到。所以，SEM中，透鏡與放大率無(wú)關(guān)。

2.場(chǎng)深（景深）在SEM中，位于焦平面上下的一小層區(qū)域內(nèi)的樣品點(diǎn)都可以得到良好的會(huì)焦而成象。這一小層的厚度稱(chēng)為場(chǎng)深，通常為幾納米厚，所以，SEM可以用于納米級(jí)樣品的三維成像。

3.分辨率在理想情況下，二次電子像分辨率等于電子束斑直徑。

4.作用體積電子束不僅僅與樣品表層原子發(fā)生作用，它實(shí)際上與一定厚度范圍內(nèi)的樣品原子發(fā)生作用，所以存在一個(gè)作用“體積”。作用體積的厚度因信號(hào)的不同而不同。第21頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

5.工作距離指從物鏡到樣品最高點(diǎn)的垂直距離。如果增加工作距離，可以在其他條件不變的情況下獲得更大的場(chǎng)深。如果減少工作距離，則可以在其他條件不變的情況下獲得更高的分辨率。通常使用的工作距離在5毫米到10毫米之間。

6.成像次級(jí)電子和背散射電子可以用于成像，但后者不如前者，所以通常使用次級(jí)電子。

7.表面分析俄歇電子、特征X射線、背散射電子的產(chǎn)生過(guò)程均與樣品原子性質(zhì)有關(guān)，所以可以用于成分分析。但由于電子束只能穿透樣品表面很淺的一層（參見(jiàn)作用體積），所以只能用于表面分析。表面分析以特征X射線分析最常用，所用到的探測(cè)器有兩種：能譜分析儀與波譜分析儀。前者速度快但精度不高，后者非常精確，可以檢測(cè)到“痕跡元素”的存在但耗時(shí)太長(zhǎng)。第22頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五樣品處理

在進(jìn)行掃描電鏡觀察前，要對(duì)樣品作相應(yīng)的處理。掃描電鏡樣品制備的主要要求是：盡可能使樣品的表面結(jié)構(gòu)保存好，沒(méi)有變形和污染，樣品干燥并且有良好導(dǎo)電性能。一、樣品的初步處理取材：面積可達(dá)8mm*8mm，厚度可達(dá)5mm。對(duì)于易卷曲的樣品如血管、胃腸道粘膜等，可固定在濾紙或卡片紙上。清洗：將樣品表面的血液、組織液或粘液等附著物清洗干凈。固定：固定所用的試劑和透射電鏡樣品制備相同，常用戊二醛及鋨酸雙固定。由于樣品體積較大，固定時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)。也可用快速冷凍固定。脫水：樣品經(jīng)漂洗后用逐級(jí)增高濃度的酒精或丙酮脫水，然后浸入中間液，一般用醋酸異戊酯作中間液。第23頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

二、樣品的干燥掃描電鏡觀察樣品要求在高真空中進(jìn)行。無(wú)論是水或脫水溶液，在高真空中都會(huì)產(chǎn)生劇烈地汽化，不僅影響真空度、污染樣品，還會(huì)破壞樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。因此，樣品在用電鏡觀察之前必須進(jìn)行干燥。干燥的方法有以下幾種：

(一)空氣干燥法空氣干燥法又稱(chēng)自然干燥法，就是將經(jīng)過(guò)脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥。這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行和節(jié)省時(shí)間；它的主要缺點(diǎn)是在干燥過(guò)程中，組織會(huì)由于脫水劑揮發(fā)時(shí)表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此，該方法一般只適用于表面較為堅(jiān)硬的樣品。

(二)臨界點(diǎn)干燥法臨界點(diǎn)干燥法是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)時(shí)，其表面張力等于零的特性，使樣品的液體完全汽化，并以氣體方式排掉，來(lái)達(dá)到完全干燥的目的。這樣就可以避免表面張力的影響，較好地保存樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。此法操作較為方便，所用的時(shí)間也不算長(zhǎng)，一般約2～3小時(shí)即可完成，所以是最為常用的干燥方法。

(三)冷凍干燥法冷凍干燥法是將經(jīng)過(guò)冷凍的樣品置于高真空中，通過(guò)升華除去樣品中的水分或脫水劑的過(guò)程。冷凍干燥的基礎(chǔ)是冰從樣品中升華，即水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，不經(jīng)過(guò)中間的液態(tài)，不存在氣相和液相之間的表面張力對(duì)樣品的作用，從而減輕在干燥過(guò)程中對(duì)樣品的損傷。第24頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

三、樣品的導(dǎo)電處理生物樣品經(jīng)過(guò)脫水、干燥處理后，其表面不帶電，導(dǎo)電性能也差。用掃描電鏡觀察時(shí)，當(dāng)入射電子束打到樣品上，會(huì)在樣品表面產(chǎn)生電荷的積累，形成充電和放電效應(yīng)，影響對(duì)圖象的觀察和拍照記錄。因此在觀察之前要進(jìn)行導(dǎo)電處理，使樣品表面導(dǎo)電。常用的導(dǎo)電方法有以下幾種：

(一)金屬鍍膜法金屬鍍膜法是采用特殊裝置將電阻率小的金屬，如金、鉑、鈀等蒸發(fā)后覆蓋在樣品表面的方法。樣品鍍以金屬膜后，不僅可以防止充電、放電效應(yīng)，還可以減少電子束對(duì)樣品的損傷作用，增加二次電子的產(chǎn)生率，獲得良好的圖象。

(二)組織導(dǎo)電法用金屬鍍膜法使樣品表面導(dǎo)電，需要特殊的設(shè)備，操作比較復(fù)雜，同時(shí)對(duì)樣品有一定程度的損傷。為了克服這些不足，有人采用組織導(dǎo)電法(又稱(chēng)導(dǎo)電染色法)，即利用某些金屬溶液對(duì)生物樣品中的蛋白質(zhì)脂類(lèi)和醣類(lèi)等成分的結(jié)合作用，使樣品表面離子化或產(chǎn)生導(dǎo)電性能好的金屬鹽類(lèi)化合物，從而提高樣品耐受電子束轟擊的能力和導(dǎo)電率。第25頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五JEOL掃描電子顯微鏡

人類(lèi)血細(xì)胞SEM照片第26頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第四講、掃描探針顯微鏡

第27頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五掃描探針顯微鏡

掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope，SPM）是掃描隧道顯微鏡及在掃描隧道顯微鏡的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的各種新型探針顯微鏡的統(tǒng)稱(chēng)，是國(guó)際上近年發(fā)展起來(lái)的表面分析儀器，是綜合運(yùn)用光電子技術(shù)、激光技術(shù)、微弱信號(hào)檢測(cè)技術(shù)、精密機(jī)械設(shè)計(jì)和加工、自動(dòng)控制技術(shù)、數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)、應(yīng)用光學(xué)技術(shù)、計(jì)算機(jī)高速采集和控制及高分辨圖形處理技術(shù)等現(xiàn)代科技成果的光、機(jī)、電一體化的高科技產(chǎn)品。

第28頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五掃描探針顯微鏡的分類(lèi)

一、掃描隧道顯微鏡STM；二、掃描力顯微鏡SFM：包括原子力顯微鏡AFM、摩擦力顯微鏡LFM、磁力顯微鏡MFM、靜電力顯微鏡EFM和和化學(xué)力顯微鏡CFM。第29頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一、掃描隧道顯微鏡

不用任何電子光學(xué)系統(tǒng)，僅用一個(gè)微小的針尖在離樣品10?的地方進(jìn)行掃描，測(cè)定其隧道電流就可得到顯微圖像，這種在結(jié)構(gòu)上比電鏡筒簡(jiǎn)單得多但得到很高的放大率而且沒(méi)有像差的設(shè)備，就叫做掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope，STM）。

STM作為一種掃描探針顯微術(shù)工具，可以觀察和定位單個(gè)原子，它具有比它的同類(lèi)原子力顯微鏡更加高的分辨率。此外，掃描隧道顯微鏡在低溫下（4K，開(kāi)氏度=攝氏度+273.15）可以利用探針尖端精確操縱原子，因此它在納米科技既是重要的測(cè)量工具又是加工工具。

STM使人類(lèi)第一次能夠?qū)崟r(shí)地觀察單個(gè)原子在物質(zhì)表面的排列狀態(tài)和與表面電子行為有關(guān)的物化性質(zhì)，在表面科學(xué)、材料科學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域的研究中有著重大的意義和廣泛的應(yīng)用前景，被國(guó)際科學(xué)界公認(rèn)為20世紀(jì)80年代世界十大科技成就之一。第30頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

STM成像原理

隧道貫穿：經(jīng)典物理學(xué)認(rèn)為樣品表面是分明的，發(fā)生在表面的反射會(huì)限囿住電子，因此不存在電子云。量子力學(xué)認(rèn)為，電子的行為就像是波，其位置是“彌散”的，物質(zhì)表面之外也有電子存在。在物質(zhì)表面之外的空間里發(fā)現(xiàn)電子的幾率，隨著與表面距離的增大而呈指數(shù)式的衰減。電子就像是在表面邊界上穿挖隧道而出。這一效應(yīng)叫做隧道貫穿。Z<1nmIT∝V·e-k0ZZ：間距

V：偏壓用一針尖只有原子線度的極細(xì)探針貼著樣品的表面輪廓進(jìn)行掃描，由于電子云的密度隨距離指數(shù)式的發(fā)生變化，故隧道電流對(duì)探針尖端和樣品表面的距離極其敏感，距離即使改變一個(gè)原子的直徑大小，隧道電流會(huì)變化一千倍。第31頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五STM工作原理

利用隧道電流的這種靈敏性，可對(duì)樣品表面上的一個(gè)個(gè)原子在豎直方向上的位置進(jìn)行極為精確的測(cè)量。探針在表面上方掃動(dòng)時(shí)，利用壓電陶瓷材料隨加入電壓不同可伸縮的壓電效應(yīng)來(lái)控制針尖距離從而對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)平行線方式的掃描，并用電子反饋線路控制隧道電流恒定記錄高度的變化，或以高度恒定的方式記錄隧道電流的變化，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后，在熒光屏上或繪圖機(jī)上顯示出來(lái)，便可得到樣品表面原子級(jí)分辨的三維圖像。第32頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五工作模式

恒電流模式利用一套電子反饋線路控制隧道電流I，使其保持恒定。再通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)控制針尖在樣品表面掃描，使針尖沿x、y兩個(gè)方向作二維運(yùn)動(dòng)。由于要控制隧道電流I不變，針尖與樣品表面之間的局域距離也會(huì)保持不變，因而針尖就會(huì)隨著樣品表面的高低起伏而作相同的起伏運(yùn)動(dòng)，高度的信息也就由此反映出來(lái)。這就是說(shuō)，STM得到了樣品表面的三維立體信息。這種工作方式獲取圖象信息全面，顯微圖象質(zhì)量高，應(yīng)用廣泛。STM恒電流工作方式觀測(cè)超細(xì)金屬微粒恒電流工作模式示意圖第33頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

恒高度模式在對(duì)樣品進(jìn)行掃描過(guò)程中保持針尖的絕對(duì)高度不變；于是針尖與樣品表面的局域距離將發(fā)生變化，隧道電流I的大小也隨著發(fā)生變化；通過(guò)計(jì)算機(jī)記錄隧道電流的變化，并轉(zhuǎn)換成圖像信號(hào)顯示出來(lái)，即得到了STM顯微圖像。這種工作方式僅適用于樣品表面較平坦、且組成成分單一(如由同一種原子組成)的情形。恒高度工作模式示意圖第34頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五STM基本結(jié)構(gòu)

隧道針尖三維掃描控制器減震系統(tǒng)電子學(xué)控制系統(tǒng)在線掃描控制系統(tǒng)離線數(shù)據(jù)分析軟件第35頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五隧道針尖

隧道針尖的結(jié)構(gòu)是掃描隧道顯微技術(shù)要解決的主要問(wèn)題之一。針尖的大小、形狀和化學(xué)同一性不僅影響著STM圖像的分辨率和圖像的形狀，而且也影響著測(cè)定的電子態(tài)。針尖要求只有一個(gè)穩(wěn)定的原子，針尖的化學(xué)純度要高。針尖表面往往覆蓋著一層氧化層，或吸附一定的雜質(zhì)，這經(jīng)常是造成隧道電流不穩(wěn)、噪音大和STM圖像的不可預(yù)期性的原因。因此，每次實(shí)驗(yàn)前，都要對(duì)針尖進(jìn)行處理，一般用化學(xué)法清洗，去除表面的氧化層及雜質(zhì)，保證針尖具有良好的導(dǎo)電性。第36頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五三維掃描控制器

由于儀器中要控制針尖在樣品表面進(jìn)行高精度的掃描，用普通機(jī)械的控制是很難達(dá)到這一要求的。目前普遍使用壓電陶瓷材料作為x-y-z掃描控制器件。壓電陶瓷利用了壓電現(xiàn)象。所謂的壓電現(xiàn)象是指某種類(lèi)型的晶體在受到機(jī)械力發(fā)生形變時(shí)會(huì)產(chǎn)生電場(chǎng)，或給晶體加一電場(chǎng)時(shí)晶體會(huì)產(chǎn)生物理形變的現(xiàn)象。許多化合物的單晶，如石英等都具有壓電性質(zhì)，但目前廣泛采用的是多晶陶瓷材料，例如鈦酸鋯酸鉛[Pb(Ti,Zr)O3](簡(jiǎn)稱(chēng)PZT)和鈦酸鋇等。壓電陶瓷材料能以簡(jiǎn)單的方式將1mV-1000V的電壓信號(hào)轉(zhuǎn)換成十幾分之一納米到幾微米的位移。第37頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五減震系統(tǒng)和電子學(xué)控制系統(tǒng)

減震系統(tǒng)由于儀器工作時(shí)針尖與樣品的間距一般小于1nm，同時(shí)隧道電流與隧道間隙成指數(shù)關(guān)系，因此任何微小的震動(dòng)都會(huì)對(duì)儀器的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。必須隔絕的兩種類(lèi)型的擾動(dòng)是震動(dòng)和沖擊，其中震動(dòng)隔絕是最主要的。隔絕震動(dòng)主要從考慮外界震動(dòng)的頻率與儀器的固有頻率入手。電子學(xué)控制系統(tǒng)STM是一個(gè)納米級(jí)的隨動(dòng)系統(tǒng)，因此，電子學(xué)控制系統(tǒng)也是一個(gè)重要的部分。STM要用計(jì)算機(jī)控制步進(jìn)電機(jī)的驅(qū)動(dòng)，使探針逼近樣品，進(jìn)入隧道區(qū)，而后要不斷采集隧道電流，在恒電流模式中還要將隧道電流與設(shè)定值相比較，再通過(guò)反饋系統(tǒng)控制探針的進(jìn)與退，從而保持隧道電流的穩(wěn)定。所有這些功能，都是通過(guò)電子學(xué)控制系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。第38頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五STM的優(yōu)勢(shì)和局限性

電鏡EM：要求高真空（容易使大分子脫水）和外源高壓電子束（輻照損傷）。掃描隧道顯微鏡STM：原子級(jí)空間分辨率（橫向分辨率0.1nm，縱向分辨率優(yōu)于0.01nm），不使用自由粒子，無(wú)需有透鏡和專(zhuān)門(mén)的電子源，能在近天然的條件下對(duì)單個(gè)生物大分子進(jìn)行直接觀察。

STM及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展導(dǎo)致了納米科學(xué)技術(shù)（研究和應(yīng)用0.1nm到100nm尺度上的原子、分子現(xiàn)象）的產(chǎn)生。而納生物學(xué)是納米科學(xué)技術(shù)與分子生物學(xué)結(jié)合的產(chǎn)物，其核心技術(shù)是STM。但是，由于STM工作時(shí)監(jiān)測(cè)的是針尖和樣品之間隧道電流的變化，因此它只能直接觀察導(dǎo)體和半導(dǎo)體的表面結(jié)構(gòu)，這使STM在應(yīng)用上有很大的局限性。第39頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五硅111面77原子重構(gòu)象為了得到表面清潔的硅片單質(zhì)材料，要對(duì)硅片進(jìn)行高溫加熱和退火處理，在加熱和退火處理的過(guò)程中硅表面的原子進(jìn)行重新組合，結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，這就是所謂的重構(gòu)。

第40頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五這是中國(guó)科學(xué)院化學(xué)所的科技人員利用納米加工技術(shù)在石墨表面通過(guò)搬遷碳原子而繪制出的世界上最小的中國(guó)地圖。

第41頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五掃描隧道顯微鏡拍攝下的細(xì)胞第42頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五二、原子力顯微鏡

原子力顯微鏡（AtomicForceMicroscope，AFM），一種可用來(lái)研究包括絕緣體在內(nèi)的材料表面結(jié)構(gòu)的分析儀器。它通過(guò)檢測(cè)待測(cè)樣品表面和一個(gè)微型力敏感元件之間的極微弱的原子間相互作用力來(lái)研究物質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)及性質(zhì)。將一對(duì)微弱力極端敏感的微懸臂一端固定，另一端的微小針尖接近樣品，這時(shí)它將與其相互作用，作用力將使得微懸臂發(fā)生形變或運(yùn)動(dòng)狀態(tài)發(fā)生變化。掃描樣品時(shí)，利用傳感器檢測(cè)這些變化，就可獲得作用力分布信息，從而以納米級(jí)分辨率獲得表面結(jié)構(gòu)信息。第43頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五AFM的原理AFM是一種利用原子分子間的相互作用力來(lái)觀察物體表面微觀形貌的新型實(shí)驗(yàn)技術(shù)。它有一根納米級(jí)的探針，被固定在可靈敏操控的微米級(jí)彈性懸臂上。當(dāng)探針很靠近樣品時(shí)，其頂端的原子與樣品表面原子間的作用力會(huì)使懸臂彎曲，偏離原來(lái)的位置。根據(jù)掃描樣品時(shí)探針的偏離量或振動(dòng)頻率重建三維圖像，就能間接獲得樣品表面的形貌或原子成分。第44頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

二極管激光器（LaserDiode）發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)光學(xué)系統(tǒng)聚焦在微懸臂（Cantilever）背面，并從微懸臂背面反射到由光電二極管構(gòu)成的光斑位置檢測(cè)器（Detector）。在樣品掃描時(shí)，由于樣品表面的原子與微懸臂探針尖端的原子間的相互作用力，微懸臂將隨樣品表面形貌而彎曲起伏，反射光束也將隨之偏移，因而，通過(guò)光電二極管檢測(cè)光斑位置的變化，就能獲得被測(cè)樣品表面形貌的信息。反饋回路(Feedback)的作用就是在工作過(guò)程中，由探針得到探針-樣品相互作用的強(qiáng)度，來(lái)改變加在樣品掃描器垂直方向的電壓，從而使樣品掃描器伸縮，調(diào)節(jié)探針和被測(cè)樣品間的距離，反過(guò)來(lái)控制探針-樣品相互作用的強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)反饋控制。第45頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五原子力顯微鏡的優(yōu)缺點(diǎn)

相對(duì)于SEM，AFM具有許多優(yōu)點(diǎn)。不同于EM只能提供二維圖像，AFM提供真正的三維表面圖。同時(shí)，AFM不需要對(duì)樣品的任何特殊處理，如鍍銅或碳，這種處理對(duì)樣品會(huì)造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害。第三，EM需要運(yùn)行在高真空條件下，AFM在常壓下甚至在液體環(huán)境下都可以良好工作。這樣可以用來(lái)研究生物宏觀分子，甚至活的生物組織。和SEM相比，AFM的缺點(diǎn)在于成像范圍太小，速度慢，受探頭的影響太大。AFM是繼STM（掃描隧道顯微鏡）之后發(fā)明的一種具有原子級(jí)高分辨的新型儀器，可以在大氣和液體環(huán)境下對(duì)各種材料和樣品進(jìn)行納米區(qū)域的物理性質(zhì)包括形貌進(jìn)行探測(cè)，或者直接進(jìn)行納米操縱；現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于半導(dǎo)體、納米功能材料、生物、化工、食品、醫(yī)藥研究和科研院所各種納米相關(guān)學(xué)科的研究實(shí)驗(yàn)等領(lǐng)域中，成為納米科學(xué)研究的基本工具。AFM與STM相比，由于能觀測(cè)非導(dǎo)電樣品，因此具有更為廣泛的適用性。當(dāng)前在科學(xué)研究和工業(yè)界廣泛使用的掃描力顯微鏡（ScanningForceMicroscope），其基礎(chǔ)就是原子力顯微鏡。第46頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五AFM構(gòu)成

主要由帶針尖的微懸臂、微懸臂運(yùn)動(dòng)檢測(cè)裝置、監(jiān)控其運(yùn)動(dòng)的反饋回路、使樣品進(jìn)行掃描的壓電陶瓷掃描器件、計(jì)算機(jī)控制的圖像采集顯示及處理系統(tǒng)組成。在AFM的系統(tǒng)中，所要檢測(cè)的力是原子與原子之間的范德華力。所以在本系統(tǒng)中是使用微小懸臂（cantilever）來(lái)檢測(cè)原子之間力的變化量。微懸臂通常由一個(gè)一般100~500μm長(zhǎng)和大約500nm~5μm厚的硅片或氮化硅片制成。微懸臂頂端有一個(gè)尖銳針尖，用來(lái)檢測(cè)樣品－針尖間的相互作用力。這微小懸臂有一定的規(guī)格，例如：長(zhǎng)度、寬度、彈性系數(shù)以及針尖的形狀，而這些規(guī)格的選擇是依照樣品的特性，以及操作模式的不同，而選擇不同類(lèi)型的探針。

第47頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

當(dāng)針尖與樣品之間有了相互作用之后，會(huì)使得懸臂cantilever擺動(dòng)，所以當(dāng)激光照射在微懸臂的末端時(shí)，其反射光的位置也會(huì)因?yàn)閼冶蹟[動(dòng)而有所改變，這就造成偏移量的產(chǎn)生。在整個(gè)系統(tǒng)中是依靠激光光斑位置檢測(cè)器將偏移量記錄下并轉(zhuǎn)換成電的信號(hào)，以供SPM控制器作信號(hào)處理。將信號(hào)經(jīng)由激光檢測(cè)器取入之后，在反饋系統(tǒng)中會(huì)將此信號(hào)當(dāng)作反饋信號(hào)，作為內(nèi)部的調(diào)整信號(hào)，并驅(qū)使通常由壓電陶瓷管制作的掃描器做適當(dāng)?shù)囊苿?dòng)，以保持樣品與針尖保持一定的作用力。

第48頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

AFM系統(tǒng)使用壓電陶瓷管制作的掃描器精確控制微小的掃描移動(dòng)。壓電陶瓷是一種性能奇特的材料，當(dāng)在壓電陶瓷對(duì)稱(chēng)的兩個(gè)端面加上電壓時(shí)，壓電陶瓷會(huì)按特定的方向伸長(zhǎng)或縮短。而伸長(zhǎng)或縮短的尺寸與所加的電壓的大小成線性關(guān)系。也就是說(shuō)，可以通過(guò)改變電壓來(lái)控制壓電陶瓷的微小伸縮。通常把三個(gè)分別代表X，Y，Z方向的壓電陶瓷塊組成三角架的形狀，通過(guò)控制X，Y方向伸縮達(dá)到驅(qū)動(dòng)探針在樣品表面掃描的目的；通過(guò)控制Z方向壓電陶瓷