(1.26)-10-2囊泡運輸調(diào)控生理學(xué)課件

囊泡運輸調(diào)控機制的發(fā)現(xiàn)2013年10月7日，瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎評審委員會將本年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎聯(lián)合授予美國耶魯大學(xué)細胞生物學(xué)系主任JamesE.Ｒothman、加利福尼亞大學(xué)伯克利分校細胞生物學(xué)家ＲandyW．Schekman和德國生物學(xué)學(xué)家斯坦福大學(xué)教授ThomasC.Südhof，以表彰他們在細胞內(nèi)主要運輸系統(tǒng)方面所作的杰出貢獻。囊泡運輸是一個生命活動的基本過程，又是一個極其復(fù)雜的動態(tài)過程，包括出芽、錨定和融合等過程，即囊泡的形成、傳遞和融合過程。這一過程需要蛋白質(zhì)分子、運輸復(fù)合體、動力蛋白和微管以及調(diào)控因子等的參與，才能使細胞有條不紊的進行正常的生命活動。1、問題的提出早在20世紀(jì)70年代，帕拉德（GeorgePalade，1974年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者）等結(jié)合形態(tài)學(xué)和細胞組分分離方法觀察到細胞內(nèi)不同的細胞器間存在蛋白運輸，如分泌蛋白需要首先進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后通過高爾基體加工后分泌到細胞外，顯微鏡下觀察到該過程由一種被稱為囊泡的結(jié)構(gòu)介導(dǎo)完成。借助顯微鏡，研究人員對囊泡運輸進行了觀察，發(fā)現(xiàn)囊泡可從一個膜上出芽或剪切，然后運輸?shù)搅硪荒ぬ幣c其結(jié)合或融合，多種類型的囊泡有序往返，將所包含的蛋白“貨物”精確運輸?shù)秸_位置。但當(dāng)時的研究僅停留在形態(tài)描述上，對分子機制涉及較少，許多重要問題并未解決，如囊泡如何從膜上出芽、囊泡如何確定“貨物”去處，以及如何實現(xiàn)與靶膜（而不是其他膜）的特異性融合等。這些問題引起了許多科學(xué)家的關(guān)注包括謝克曼和羅斯曼，他們決定首先鑒別出囊泡運輸?shù)南嚓P(guān)分子。2、囊泡運輸基因鑒定1975年，謝克曼從斯坦福大學(xué)獲得博士學(xué)位，導(dǎo)師是科恩伯格（ArthurKornberg，1959年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者），謝克曼重點研究細菌DNA復(fù)制機制，并掌握了低等生物實驗操作方法。畢業(yè)后，謝克曼進入加州大學(xué)圣地亞哥分校跟隨辛格（SeymourJonathanSinger，生物膜流體鑲嵌模型提出者）研究膜結(jié)構(gòu)，不久謝克曼發(fā)現(xiàn)哺乳動物細胞過于復(fù)雜，因此決定尋找新的模式細胞進行研究。當(dāng)時，哈特韋爾（LelandHarrisonHartwell，2001年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者）以酵母為材料研究細胞周期取得了重大突破，這給予謝克曼極大信心，他決定選擇大多數(shù)科學(xué)家都認為不適合研究分泌機制的酵母細胞作為材料。1976年，謝克曼成為加州大學(xué)伯克利分校助理教授，他開始運用遺傳學(xué)方法尋找酵母細胞內(nèi)的囊泡運輸相關(guān)分子。謝克曼和助手首先利用顯微鏡和細胞化學(xué)染色方法，觀察到酵母內(nèi)存在與哺乳動物細胞類似的囊泡結(jié)構(gòu)，并推測這些囊泡對于酵母細胞內(nèi)酶的運輸具有重要意義，因此運輸受阻將影響酵母生存。謝克曼和他的學(xué)生諾維克（PeterNovick）篩選到大量溫度敏感型酵母突變體，這些突變體在低溫下可正常生存；但溫度升高后可造成酵母死亡。謝克曼從中檢測到2株突變體，原本應(yīng)分泌到胞外的酶卻滯留于酵母體內(nèi)同時酵母體內(nèi)積累了大量未分泌囊泡（圖1）。謝克曼將這些突變造成酵母囊泡運輸遺傳的基因命名為“分泌基因”，而這2個基因首先確定為sec1和sec2。謝克曼和學(xué)生對酵母突變體進行大規(guī)模篩選，最終獲得23個參與蛋白質(zhì)分泌的基因，根據(jù)它們作用途徑（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體或其他）的差異而將其分為3類。遺傳和生化分析進一步顯示酵母中的囊泡運輸在哺乳動物中也普遍適用。謝克曼利用酵母遺傳學(xué)分析所獲得23個分泌基因（sec1~sec23）開創(chuàng)了囊泡運輸分子機制研究的新領(lǐng)域，這些分子的生物學(xué)功能的后續(xù)鑒定成為許多研究人員的重要任務(wù)，而與此同時，羅斯曼利用生物化學(xué)方法的研究囊泡運輸也取得了重大突破。3、囊泡運輸?shù)纳锘瘜W(xué)研究羅斯曼最早對物理學(xué)有著濃厚興趣，然而在耶魯大學(xué)期間卻被生物學(xué)深深吸引，尤其是膜生物學(xué)。1971年獲得物理學(xué)學(xué)士后，羅斯曼進入哈佛醫(yī)學(xué)院，跟隨著名膜生物學(xué)家肯尼迪（EugenePatrickKennedy）學(xué)習(xí)膜的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，在隨后2年的博士后學(xué)習(xí)中熟練掌握了利用無細胞體系研究生物學(xué)問題的方法。1978年，羅斯曼受科恩伯格的影響加入斯坦福大學(xué)生物化學(xué)系，在這里羅斯曼又掌握了2條基本原則，一是學(xué)會制定用生物化學(xué)方法解決復(fù)雜生物學(xué)問題的策略；二是生物化學(xué)方法是解決和解釋復(fù)雜生物學(xué)問題的唯一可靠方式。正因為堅信生物化學(xué)方法的有效性，羅斯曼決定用該方法研究囊泡運輸。羅斯曼研究的基本策略為：首先將哺乳動物細胞破碎獲得無細胞體系，從中分離出蛋白運輸?shù)南嚓P(guān)組分，然后在試管內(nèi)通過分析這些組分缺失對蛋白運輸?shù)挠绊憦亩_定其生物學(xué)功能。這種策略為經(jīng)典生物化學(xué)方法，在ATP合成、DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成和遺傳密碼破譯等研究中顯示出巨大優(yōu)勢，但卻遭到了許多科學(xué)家的質(zhì)疑。他們認為囊泡運輸依賴于空間位置，而體外無細胞體系會不可避免地破壞囊泡間的空間聯(lián)系，根本無法完成蛋白運輸。羅斯曼根據(jù)部分蛋白在運輸過程中需要糖基化修飾這個原理，創(chuàng)造性地設(shè)計出一個檢測蛋白運輸相關(guān)元件的無細胞試管體系。羅斯曼獲得2份勻漿，一份含G蛋白（需修飾）但缺乏高爾基體糖基轉(zhuǎn)移酶；另一份缺乏G蛋白但擁有高爾基體糖基轉(zhuǎn)移酶。2份勻漿在單獨狀態(tài)下都無法完成G蛋白運輸，然而混合后卻實現(xiàn)了G蛋白的正確定位，這意味著囊泡運輸由內(nèi)部化學(xué)特異性決定，而非空間位置。無細胞體系在囊泡運輸研究中被確認有效性，極大推進了后續(xù)相關(guān)分子的鑒定成功。4、囊泡形成機制的闡明利用無細胞體系，羅斯曼和他的學(xué)生重點研究高爾基體之間的蛋白運輸，首先確定了囊泡形成（出芽）的3個基本要素：一是高爾基體膜；二是囊泡形成和分離過程中的背膜結(jié)構(gòu)；三是能量分子GTP。為確定囊泡形成的相關(guān)分子，羅斯曼用無法水解的GTP類似物GTPγS處理無細胞體系造成囊泡出芽障礙，從而積累大量背膜。羅斯曼純化了背膜并分析其組成，確定這是一種7亞基復(fù)合物，稱為背膜蛋白復(fù)合物Ⅰ（CoatProteinComplexⅠ，COPⅠ），其主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的順向和反向及高爾基體之間的蛋白運輸。后來，又相繼鑒定出另外2類背膜，一類是網(wǎng)格蛋白（clathrin）型背膜，主要參與高爾基體到質(zhì)膜的蛋白運輸；另一類是COPⅡ，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的順向蛋白運輸。羅斯曼小組還確定了一種GTP結(jié)合蛋白———ADP核糖基化因子（ADPribosylationfactor，ARF），該因子是囊泡形成的必需因素，從而解釋了GTP參與囊泡形成的作用。至此，羅斯曼提出了囊泡形成（出芽）的分子機制：攜帶GTP的ARF在高爾基體表面通過招募7亞基至高爾基體表面而啟動囊泡出芽，當(dāng)形成完整囊泡后，利用GTP水解供能使囊泡與高爾基體分離。與此同時，謝克曼研究了酵母細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的蛋白運輸過程，發(fā)現(xiàn)也形成了類似哺乳動物細胞的背膜結(jié)構(gòu)，盡管酵母的亞基組成與哺乳動物不同，但背膜形成和分離過程中也需要GTP結(jié)合蛋白參與，且基本過程機制類似。GTP酶結(jié)合蛋白啟動的背膜復(fù)合物形成及囊泡分離有效解釋了囊泡形成機制，隨后囊泡運輸?shù)陌邢蛉诤蠙C制成為亟待解決的關(guān)鍵問題。5、囊泡融合過程的闡述1987年，羅斯曼的學(xué)生發(fā)現(xiàn)N-乙酰馬來酰胺（N-ethylmaleimide，NEM）可有效阻斷無細胞體系內(nèi)的蛋白運輸，隨后將NEM敏感因子（NEM-sensitivefactor，NSF）進行了純化。NSF定位于細胞質(zhì)，是一個多亞基復(fù)合物，它的缺乏不影響高爾基體囊泡出芽，但會破壞囊泡融合。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，NSF能與可溶性NSF附著蛋白（solubleNSFattachmentproteinSNAP）結(jié)合形成復(fù)合物并被引導(dǎo)至靶膜。1993年，羅斯曼利用親和純化方法從牛腦中分離得到SNAP受體（SNAPreceptor，SNARE）,SNARE是一種主要由α-螺旋形成的單跨膜蛋白，在囊泡和靶膜（targetmembrane）上均存在，分別稱為v-SNARE和t-SNARE。細胞內(nèi)存在多種SNARE，羅斯曼據(jù)此提出囊泡融合的SNARE假說，該假說認為，只有當(dāng)v-SNARE和t-SNARE兩者特異性識別才可形成拉鏈狀的SNARE復(fù)合物，從而促進靠近的囊泡和靶膜實現(xiàn)融合（圖2）。v-SNARE在出芽過程中被整合入囊泡，隨后攜帶v-SNARE囊泡只與表達對應(yīng)t-SNARE靶膜融合，從而保證了蛋白運輸?shù)陌邢騿栴}。與此同時，羅斯曼利用酵母研究囊泡融合過程，深入分析表明酵母sec18與哺乳動物NSF編碼基因同源，而SNAP基因則與酵母sec17同源；此外，酵母sec17和sec18基因產(chǎn)物也發(fā)揮了類似哺乳動物NSF和SNAP的作用，親緣關(guān)系較遠的生物采用類似機制進行囊泡融合說明了該過程的進化保守性。6、神經(jīng)遞質(zhì)釋放的鈣離子調(diào)節(jié)機制神經(jīng)元間突觸傳遞是神經(jīng)系統(tǒng)功能正常完成的基本方式，其中化學(xué)性突觸傳遞涉及突觸小泡的胞內(nèi)生成、運輸及與細胞膜的融合，最終將神經(jīng)遞質(zhì)分泌到胞外，從而完成神經(jīng)元的胞吐作用（exocytosis）。已知鈣離子控制神經(jīng)元胞吐過程，但對其詳細機制缺乏深入理解，蘇德霍夫?qū)Υ诉M行了深入探索。1982年，蘇德霍夫從哥廷根大學(xué)獲得醫(yī)學(xué)學(xué)位，同年還從馬普研究所獲得博士學(xué)位。1983年，蘇德霍夫來到美國德克薩斯州西南大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，在布朗（MichaelStuartBrown，1985年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者）和戈爾茨坦（JosephLeonardGoldstein，1985年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者）的指導(dǎo)下研究低密度脂蛋白受體在膽固醇代謝中的作用。1986年，蘇德霍夫成為霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員和西南醫(yī)學(xué)中心員工，開始了對突觸前神經(jīng)元的研究。1988年，施勒（RichardH.Scheller）分離得到囊泡相關(guān)膜蛋白（vesicle-associatedmembraneprotein，VAMP），次年，蘇德霍夫從大鼠大腦中分離出了相同蛋白，將其命名為小突觸泡蛋白（synaptobrevin）。不久，施勒又發(fā)現(xiàn)另一種定位于細胞膜上的突觸融合蛋白（syntaxin）。與此同時，羅斯曼在大腦中尋找SNAP受體，從而鑒定出3種蛋白VAMP/synaptobrevin、突觸融合蛋白和突觸小體相關(guān)蛋白-25（synaptosomal-associatedprotein25，SNAP-25），進一步證實了定位于囊泡的VAMP/synaptobrevin為v-SNARE，而定位于神經(jīng)末端細胞膜的syntaxin和SNAP-25共同構(gòu)成t-SNARE，三者形成復(fù)合物促使囊泡與細胞膜融合，從而明確了突觸膜融合的分子機制。1990年，蘇德霍夫純化出另一種囊泡蛋白—突觸結(jié)合蛋白（synaptotagmin），并確定這種蛋白也與囊泡融合相關(guān)。蘇德霍夫還發(fā)現(xiàn)鈣離子可促使突觸結(jié)合蛋白與磷脂結(jié)合。突觸結(jié)合蛋白是一類進化上比較保守的單跨膜囊泡蛋白，C端擁有2個鈣離子結(jié)合域（C2A和C2B），可作為鈣離子傳感器發(fā)揮作用，小鼠模型進一步證實突觸結(jié)合蛋白主要在囊泡融合后神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中發(fā)揮作用。這一系列結(jié)果確定突觸結(jié)合蛋白是鈣離子的作用位點，神經(jīng)細胞鈣離子外流可通過激活突觸結(jié)合蛋白而招募相關(guān)分子到融合處，隨后突觸小泡與神經(jīng)細胞膜融合，并促使小泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)釋放到神經(jīng)細胞（圖3）。蘇德霍夫還進一步明確了鈣離子更為精細的調(diào)節(jié)機制。1995年，蘇德霍夫鑒定出參與突觸融合的細胞質(zhì)蛋白complexin（又名synaphin），該蛋白與SNARE復(fù)合物的形成相關(guān)，進一步研究顯示其在鈣離子介導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其機制在于complexin可激活前SNARE復(fù)合物形成，而鈣離子與突觸結(jié)合蛋白結(jié)合后可代替complexin從而啟動膜融合和神經(jīng)遞質(zhì)釋放。7、研究意義囊泡運輸是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)等多種“貨物”最為重要的運輸體系，可有效保證特定分子及時、精確地在細胞內(nèi)、外發(fā)揮生物學(xué)作用，是多種生理過程正常工作的基礎(chǔ)，如神經(jīng)系統(tǒng)信號傳導(dǎo)、免疫系統(tǒng)細胞因子分泌和內(nèi)分泌系統(tǒng)激素生成和作用發(fā)揮等。囊泡運輸精細調(diào)控也保證了生命體內(nèi)各生理過程的有序進行，若該過程異常將導(dǎo)致多種疾病發(fā)生。糖尿病是由于胰島細胞中胰島素分泌異?；蛞葝u素作用于骨骼肌或脂肪細胞時糖移位缺陷引起。參與突觸復(fù)合物組裝的α-突觸核蛋白（α-synuclein）可有效預(yù)防神經(jīng)細胞衰老，它的功能缺陷可造成帕金森綜合征等神經(jīng)退行性疾病。部分囊泡運輸分子的基因突變還可引起遺傳學(xué)疾病的發(fā)生。3位科學(xué)家工作的重要性獲得了科學(xué)界的普遍認可，并獲得了大量科學(xué)獎勵，羅斯曼和謝克曼因此成為2002年拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎（AlbertLaskerAwardforBasicMedicalRe