【生物】基因工程的基本操作程序課件-2023-2024學年高二下學期生物人教版（2019）選擇性必修3

蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細胞抗蟲棉提取表達Bt基因導入Bt基因重組DNA分子培育轉基因抗蟲棉的簡要過程問題探討1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構建3.將目的基因導入受體細胞4.目的基因的

檢測與鑒定（核心工作）

第2節(jié)

基因工程的基本操作程序1基因表達載體的構建2目的基因的篩選與獲取3將目的基因導入受體細胞4目的基因的檢測與鑒定四個步驟：基因表達載體的構建（核心）將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取基因工程的基本操作程序有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用。載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉化。確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。

第2節(jié)

基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取1.目的基因（1）概念：用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因；如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質、生產藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相

關的基因。主要是編碼特定蛋白質的基因，也可以是具有調控作用的因子一資料：蘇云金桿菌通過產生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲?？茖W家將“殺蟲基因”轉入棉花中，棉花產生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因思考：1.Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理是什么？2.抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會不會對人畜產生危害？

當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。

Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產生上述影響對Bt基因的表達產物-Bt抗蟲蛋白有較為深入的了解Bt基因是培育轉基因抗蟲棉較為合適的目的基因目的基因的篩選與獲取2.篩選合適的目的基因方法：從相關的已知結構和功能清晰的基因中篩選。DNA測序儀核苷酸序列比對氨基酸序列比對越來越多基因的功能和結構被分析。一蘇云金桿菌的殺蟲作用于Bt基因有關掌握了Bt基因的序列信息蘇云金桿菌制劑可防治棉花蟲害實例：利用PCR技術獲取和擴增（重點）cDNA文庫直接獲取人工合成基因文庫（P82了解）（化學合成法）：根據(jù)測序技術或從GenBank等序列數(shù)據(jù)庫中掌握了目的基因的序列后，用DNA合成儀進行人工合成基因組文庫從生物體內用限制酶直接得到獲取目的基因的具體方法3.目的基因的獲取目的基因的篩選與獲取一基因組文庫部分基因文庫（主要是cDNA文庫）基因文庫：基因組文庫：含有某種生物全部基因片段的重組DNA的克隆群體。（1）從基因文庫中直接獲取3.目的基因的獲取目的基因的篩選與獲取一部分基因文庫：含有某種生物部分基因片段的重組DNA的克隆群體。目的基因的篩選與獲取一提取基因組DNADNA片段重組載體基因組文庫限制酶與載體連接導入受體菌提取特定組織或發(fā)育時期的mRNA單鏈DNA重組載體cDNA文庫雙鏈cDNA導入受體菌與載體連接DNA聚合酶逆轉錄酶基因組文庫中的基因含有啟動子、終止子、內含子cDNA文庫中的基因不含以上結構3.目的基因的獲取（2）人工合成DNA合成儀①前提：基因比較小、核苷酸序列已知②方法：通過DNA合成儀用化學方法直接合成目的基因3.目的基因的獲取目的基因的篩選與獲取一提取蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因？快速獲得大量抗蟲基因（3）利用PCR獲取和擴增目的基因目的基因的篩選與獲取一PCR——聚合酶鏈式反應PCR是一項根據(jù)DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。3.目的基因的獲取PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學獎。PCR技術：PCR是______________

的縮寫，是一項根據(jù)___________的原理，在___

_提供參與DNA復制的___

____與__

____，對

_________________

_進行______

__的技術；聚合酶鏈式反應DNA半保留復制體外各種組分反應條件目的基因的核苷酸序列大量復制全稱聚合酶鏈式反應DNA半保留復制體外（PCR擴增儀/PCR儀）對目的基因的核苷酸序列進行大量復制可以在短時間內大量擴增目的基因原理操作環(huán)境目的優(yōu)點（3）利用PCR擴增目的基因目的基因的篩選與獲取一結合體內DNA復制過程，思考PCR的進行需要哪些條件？PCR擴增儀溫故知新：回顧DNA的復制過程體內DNA復制過程解旋酶DNA聚合酶體內DNA復制需要模板、原料、引物、酶、能量等引物目的基因的篩選與獲取一DNA復制的方向引物DNA母鏈DNA的復制方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸引物從模板鏈3’端結合①DNA復制所需的基本條件:參與的組分在DNA復制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA復制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（體外用耐高溫的DNA聚合酶）（體外用高溫代替）（2種）引物是一小段能與__________的一段堿基序列__________的____________DNA母鏈互補配對短單鏈核酸3’5’DNA母鏈3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物目的基因的篩選與獲取一（3）利用PCR擴增目的基因DNA雙鏈解旋之后DNA聚合酶無法直接聚合游離的脫氧核苷酸，必須由引物提供3′端之后才能開始連接脫氧核苷酸。由于DNA雙鏈是反相平行的，所以需要兩種引物。復制原則:堿基互補配對原則（保證復制的準確進行）引物①設計引物的依據(jù)是：

_______________________②引物設計時既要考慮目的基因序列，又要考慮載體序列，原因是：

________________________________________③使用的一對引物的序列相同嗎？

_________________________________________④引物設計的要求（或引物失效的原因）

a._______________________________________b._______________________________________⑤每種引物內部不能發(fā)生局部堿基互補配對的原因

______________________________⑥兩種引物之間不能在局部發(fā)生堿基互補配對的原因

_____________________________________⑦兩種引物都結合在DNA模板鏈的_____端脫氧核苷酸連接在引物的_____端進行延伸目的基因兩端的核苷酸序列為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的5’端加上限制酶的酶切位點不相同，目的基因兩端具有不同的核苷酸序列*兩種引物才能確保DNA的兩條鏈同時被擴增3’防止引物自身環(huán)化防止引物之間配對，導致引物不能同模板鏈結合3’每種引物內部不能發(fā)生局部堿基互補配對兩種引物之間不能在局部發(fā)生堿基互補配對3’5’DNA母鏈3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物引物長度不宜過短，防止引物隨機結合目的基因的篩選與獲取一耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2種）穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）四種脫氧核苷酸(dNTP)激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶②基本過程變性復性延伸①基本條件:（3）利用PCR擴增目的基因控制溫度能量:熱能，dNTP水解釋放的能量③檢測方法完成后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定產物。(90℃以上）(50℃左右）(72℃左右）（含目的基因）dATP與ATP在結構上有什么區(qū)別？dATP為什么能用作DNA復制的底物？

如圖所示，ATP結構中的五碳糖為核糖，而dATP結構中的五碳糖為脫氧核

糖。ATP轉移掉兩個磷酸基團后剩下的結構就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP

是轉錄的底物；同理，dATP轉移掉兩個磷酸基團后剩下的結構就是腺嘌呤脫氧

核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA復制的底物。3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈B.復性50℃左右，兩種引物與兩條單鏈DNA結合C.延伸72℃左右，4種脫氧核苷酸在Taq酶的作用下，合成新的DNA鏈3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’目的基因的篩選與獲取一②基本過程（3）利用PCR擴增目的基因堿基互補配對原則第一輪循環(huán)的產物作為第二輪反應的模板，經過變性、復性和延伸三步產生第二輪循環(huán)的產物；第二輪循環(huán)的產物作為第三輪反應的模板，經過變性、復性和延伸三步產生第三輪的產物；第二輪循環(huán)的產物第三輪的產物完成后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產物目的基因的篩選與獲取一②基本過程（3）利用PCR擴增目的基因PCR小結目的基因的篩選與獲取一受熱變性引物

耐高溫的DNA聚合酶(1)過程：（3）結果：1個模板DNA分子經過n輪PCR，以_____方式擴增，可以擴增出

個DNA片段，共需要引物數(shù)量為

個。指數(shù)2n2n＋1－2(2)DNA復制方向：

。5’端→3’端觀看視頻，跟隨視頻畫出前三個循環(huán)的過程，并思考：為了保證目的基因的完整，在實際操作中，用于PCR的模板往往會保留目的基因前后的一小段序列，那么幾輪循環(huán)后會出現(xiàn)只有目的基因片段（等長）的DNA分子？目的基因的篩選與獲取一（3）利用PCR獲取和擴增目的基因③相關計算觀看視頻，跟隨視頻畫出前三個循環(huán)的過程，并思考：為了保證目的基因的完整，在實際操作中，用于PCR的模板往往會保留目的基因前后的一小段序列，那么幾輪循環(huán)后會出現(xiàn)只有目的基因片段（等長）的DNA分子？三輪目的基因的篩選與獲取一（3）利用PCR獲取和擴增目的基因③相關計算思維拓展復制次數(shù)DNA分子總數(shù)01123n21=222=423=82n１)復制n次后DNA總數(shù):2n2）含母鏈的DNA占總數(shù)的比例：22ｎ12ｎ-1=3）只含子鏈的DNA占總數(shù)的比例：

親代DNA（2條鏈）無論DNA復制多少次，含母鏈的DNA數(shù)永遠是2第1次復制第2次復制第3次復制2ｎ

-22ｎ思維拓展復制次數(shù)脫氧核苷酸鏈總數(shù)02123n2×21=42×22=82×23=162×2n=2n+1１)復制n次后脫氧核苷酸鏈總數(shù):2）新合成的脫氧核苷酸鏈數(shù)：2n+1一個DNA分子中含有2條脫氧核苷酸鏈

親代DNA（2條鏈）第1次復制第2次復制第3次復制2n+1-2②1個目的基因進行PCR擴增,循環(huán)n次，得到多少個目的基因？含引物的DNA分子有多少個？①1個DNA分子進行PCR擴增,循環(huán)n次，理論上至少需要多少個引物？2n思維拓展復制n次，需要的引物數(shù)=新合成的脫氧核苷酸鏈數(shù)找一找：復制n次，含有引物的脫氧核苷酸鏈有多少？2n+1-22n+1-2思維拓展一個DNA分子復制n次，則消耗的脫氧核苷酸數(shù)若親代DNA分子含有胞嘧啶脫氧核苷酸m個，經過n次復制需要消耗胞嘧啶脫氧核苷酸數(shù):m（2n-1）

第n次復制需胞嘧啶脫氧核苷酸數(shù):m.2n-1

親代DNA（2條鏈）第1次復制第2次復制第3次復制總的DNA數(shù)Xm-親代DNA的m（原本就有的）

堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶、引物解旋酶催化體外復制細胞內（主要在細胞核內）耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶DNA在高溫下變性解旋大量的DNA片段形成整個DNA分子PCR與DNA復制過程比較目的基因的篩選與獲取一（3）利用PCR擴增目的基因比較項目PCR細胞核內DNA復制場所試管中細胞內方式半保留全連續(xù)局部區(qū)域復制半保留半不連續(xù)全鏈復制起始位點引物3'端復制起始位點酶僅一種DNA聚合酶（Taq酶）多種酶反應條件溫度變幅大溫和解旋高溫解旋解旋酶解旋引物DNA片段，保留在復制的子鏈中RNA片段，不保留在復制的子鏈中產物引物界定的片段核基因組循環(huán)次數(shù)人為設置與細胞分裂同步聯(lián)系①模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板②原料:均為四種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物開始進行互補鏈的合成補充2.PCR技術與細胞內DNA復制的比較目的基因的篩選與獲取一1.下列有關體內DNA復制與PCR比較的敘述，正確的是A.二者合成子鏈的方向相同，均從5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破壞氫鍵來實現(xiàn)解旋C.體內DNA復制不需要引物，PCR反應需要引物D.二者遵循的堿基互補配對方式相同，且均需要ATP提供能量√學以致用

·鏈接典例拓展3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈B.復性50℃左右，兩種引物與兩條單鏈DNA結合C.延伸72℃左右，4種脫氧核苷酸在Taq酶的作用下，合成新的DNA鏈3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’目的基因的篩選與獲取一②基本過程（3）利用PCR擴增目的基因堿基互補配對原則思維拓展新合成的脫氧核苷酸鏈上都有引物，即每個DNA都有引物找一找：①復制n次，含有引物的脫氧核苷酸鏈有多少？②復制n次，含有引物的DNA有多少？2n2n+1-2大本78題2小本141題13cd小本141題13cdef用PCR可以擴增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉錄成cDNA再進行擴增。1.逆轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；3.以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNADNA片段的擴增及電泳鑒定探究·實踐實驗原理（1）DNA片段的擴增①利用PCR可以在體外進行DNA片段的擴增。②PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。③PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器。一次PCR一般要經歷30次循環(huán)。（2）DNA片段的電泳鑒定①DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。②PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。瓊脂糖凝膠電泳

原理：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就叫電泳。PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300納米的紫外燈下被檢測出來。加樣孔電源瓊脂糖凝膠電泳DNA片段的電泳鑒定材料用具（1）儀器（2）用具PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性吸液槍頭、電泳裝置（包括電泳儀電泳槽等）4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、DNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等PCR儀微量離心管微量移液器電泳裝置方法步驟（1）DNA片段的擴增用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分參照下表的參數(shù)，設置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）循環(huán)程序變性復性延伸預變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后1次94℃,1min55℃,30s72℃,1min10倍濃縮的擴增緩沖液5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物I2.5μL20μmol/L的引物II2.5μLH2O28-33μL1~5U/μL的TaqDNA聚合酶1~2U模板DNA5~10μL總體積50μL瓊脂糖凝膠電泳的操作步驟配制瓊脂糖溶液制備凝膠制備凝膠加樣電泳觀察記錄DNA片段的擴增及電泳鑒定注意說明1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。結果：片段相同的DNA分子會停留在相同的條帶，因此可以鑒別PCR的產物是否為目的基因。1234561：Marker、標準大小的DNA分子2：目的基因3-5：不同循環(huán)次數(shù)的PCR產物6：清水瓊脂糖凝膠電泳目的基因的篩選與獲取一2至5都為含目的基因的DNA片段,因為引物是依據(jù)目的基因的核苷酸序列設計的，引物只能和含目的基因的DNA片段結合，并在耐高溫的DNA聚合酶的作用下延伸應用：在刑偵學中，只要能獲取痕量DNA，就可以應用PCR技術，大量擴增，結合凝膠電泳，判斷個體之間的親緣關系。瓊脂糖凝膠電泳目的基因的篩選與獲取一獲取了足夠量的Bt基因后，下一步就是要讓基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；同時，使Bt基因能夠表達和發(fā)揮作用。構建基因表達載體（核心工作）基因表達載體由哪些部分組成二基因表達載體的構建1.基因表達載體的目的（1）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細胞中表達和發(fā)揮作用。2.基因表達載體的組成位置：功能：RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質基因的上游（一段有特殊結構的DNA片段）緊挨轉錄的起點能控制表達所需要的特殊性狀。位置：功能：基因的下游（一段特殊的DNA片斷）終止mRNA的轉錄用來鑒別或篩選含有目的基因的細胞基因表達載體的構建二DNA復制的起始位點，DNA聚合酶結合位點。=復制原點

+目的基因+啟動子+終止子

+標記基因注意：目的基因必須插入到

與

之間。啟動子終止子

3.基因表達載體的構建過程基因表達載體構建模式圖載體（質粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種二基因表達載體的構建培育抗蟲棉的簡要過程使用一種DNA限制酶進行切割，共有幾種連接情況？問題探討載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質粒自連目的基因與質粒連接目的基因與目的基因連接質粒與質粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1思考：1、啟動子和終止子分別是轉錄的起點和終點嗎？提示：不是。啟動子是轉錄的起始信號，而非轉錄的起始位點；終止子是轉錄的終止信號，而非轉錄的終止位點。啟動(終止)轉錄啟動(終止)翻譯作用位于DNA上位于mRNA上位置DNA片段三個相鄰堿基本質啟動(終止)子啟始(終止)密碼子2、完成下表結果：片段相同的DNA分子會停留在相同的條帶，因此可以鑒別PCR的產物是否為目的基因。1234561：Marker、標準大小的DNA分子2：目的基因3-5：不同循環(huán)次數(shù)的PCR產物6：清水瓊脂糖凝膠電泳目的基因的篩選與獲取一2至5都為含目的基因的DNA片段,因為引物是依據(jù)目的基因的核苷酸序列設計的，引物只能和含目的基因的DNA片段結合，并在耐高溫的DNA聚合酶的作用下延伸基因表達載體的構建復制原點標記基因KanR啟動子多克隆位點終止子XbaIHindIIIBamHISmaIpBI121表達載體HindIII酶切HindIIIHindIIIBamHICCCAAGCTTAAGCTTGGGTTCGAACCCCCTAGGBt基因GGATCCGGGTTCGAA核心步驟HindIIIHindIIIBamHIAGCTTCCTAGGBt基因GGATCCATTCGAA同一種限制酶切CGATTAGCTTAAACGATTA

G

CTTA如何改進?DNA連接酶ACGACGATTTTAGCTTAAGCTTAABt基因ACGACGATTTTAGCTTAAGCTTAABt基因Bt基因Bt基因Bt基因Bt基因HindIIIBamHIAGCTTBt基因ACCTAGG用兩種限制酶切CGATTGATCCGADNA連接酶GCGATAGTTCCGATCCAAGCTTAGBt基因HindIIIHindIIIBamHICCCAAGCTTAAGCTTGGGTTCGAACCCCCTAGGBt基因GGATCCGGGTTCGAA原則：1.限制酶切位點不得破壞目的基因和載體上的各類有功能的基因2.用兩種酶切割，可以避免目的基因自接，質粒自身環(huán)化，目的基因與質粒倒接3.用于切割目的基因和質粒的限制酶必須是同種酶復制原點標記基因KanR啟動子多克隆位點終止子XbaIHindIIIBamHISmaIpBI121表達載體小本137題9小本137題12大本73體驗區(qū)

題1(2016·全國課標卷Ⅰ，40)某一質粒載體如圖所示，有人將此質粒用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌，結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。回答下列問題：

(1)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是______；并且_____

和____的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是________________

_

。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有________的固體培養(yǎng)基。二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長含有質粒載體含有目的基因的重組質粒

二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長四環(huán)素即含有重組質粒的大腸桿菌在其中不能生長，而含有普通質粒的大腸桿菌能生長．將目的基因導入受體細胞的方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入原核細胞農桿菌轉化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法（感受態(tài)細胞法）（我國科學家獨創(chuàng))將目的基因導入受體細胞三轉化：指目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內穩(wěn)定維持和表達的過程。（雙子葉植物、裸子植物)（葉肉細胞)（受精卵)（大腸桿菌)基因槍法（單子葉植物)1.花粉管通道法或②在植物受粉后一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；花粉管通道法導入外源DNA將目的基因導入受體細胞三（一)將目的基因導入植物細胞是我國科學家周光宇在1987年獨創(chuàng)的。將重組DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道內，進入卵細胞、合子或早期胚胎細胞中。此方法直接、簡便且經濟，已應用于水稻、小麥、棉花、大豆等多種植物中。2.農桿菌轉化法-雙子葉植物、裸子植物目的基因插入到農桿菌Ti質粒的T-DNA中重組DNA轉入農桿菌農桿菌侵入植物將目的基因帶入植物細胞含外源目的基因的重組DNA整合到植物細胞的基因組中目的基因遺傳特性穩(wěn)定維持和表達農桿菌轉化法步驟：將目的基因導入受體細胞三（一)將目的基因導入植物細胞構建基因表達載體Ti質粒目的基因含目的基因的重組Ti質粒轉入農桿菌導入植物細胞目的基因插入植物細胞染色體DNA中植物細胞植物組織培養(yǎng)表現(xiàn)出新性狀的植株總結：農桿菌轉化法流程圖該過程經過__次拼接、__次導入①第一次拼接_______________________________②第二次拼接______________________________________________________________③第一次導入__________________________________④第二次導入__________________________________將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌含目的基因的T-DNA導入受體細胞（非人工操作）2.農桿菌轉化法-雙子葉植物、裸子植物將目的基因導入受體細胞三（一)將目的基因導入植物細胞

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。3.基因槍法適用于單子葉植物將目的基因導入受體細胞三（一)將目的基因導入植物細胞基因槍法意圖1.顯微注射法操作程序：（為什么常選用受精卵作為受體細胞呢？)①體積大，易操作。②全能性高，易培養(yǎng)成完整個體。將目的基因導入受體細胞三（二)將目的基因導入動物細胞提純含目的基因表達載體受精卵顯微注射移植到輸卵管或子宮受精卵發(fā)育新性狀動物2.科學家也用病毒DNA

與目的基因一起構建的載體，去感染受體動物細胞，也能使目的基因導入動物細胞內。如慢病毒載體、腺病毒載體等。將目的基因導入受體細胞三（二)將目的基因導入動物細胞使用Ca2+處理：可使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。過程微生物作為受體細胞的優(yōu)點：繁殖快，單細胞，遺傳物質相對較少，易于培養(yǎng)操作Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子將目的基因導入受體細胞三原核生物作為受體細胞產生的真核生物的蛋白質通常沒有生物活性，需要在體外進行再加工。（三)將目的基因導入原核細胞（增加細胞壁的透性，與細胞膜無關）常用菌：大腸桿菌Ca2+感受態(tài)細胞吸收返校要帶的生物資料1.生物必修一《分子與細胞》教材2.選擇性必修三單元復習清單默寫（還沒打印的同學要打印帶回來）3.筆記本（大一點厚一點，一輪復習用）4.選擇性必修三教材，大小本目的基因的檢測與鑒定四在棉花細胞中，重組表達載體是否導入成功？是否可以穩(wěn)定維持并表達出Bt蛋白？表達出的Bt蛋白是否具有殺蟲的功效？1.分子水平檢測2.個體水平鑒定③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA①檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因PCR技術或分子雜交技術抗原-抗體雜交技術（一)分子水平的檢測1.檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因方法：PCR擴增或DNA分子雜交技術M：marker；1-陽性質粒；2：原始品系；3-9轉Bt品系；轉Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果DNA分子雜交（Southern-blot)流程圖DNA分子雜交結果圖目的基因的檢測與鑒定四15N15N變性變性①首先取出轉基因生物的基因組DNA；過程:②將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針；③使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中。（基因探針：指用熒光或放射性同位素標記的DNA分子2.檢測目的基因是否轉錄出了mRNA方法：PCR擴增或DNA-RNA分子雜交技術RNA分子雜交(NorthernBlot)流程圖Bt基因在抗蟲棉中的表達從左至右依次是苗期葉片、花鈴期葉片，苞葉，花，雌雄蕊和鈴殼目的基因的檢測與鑒定四（一)分子水平的檢測用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA。3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質方法：抗原-抗體雜交技術蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內抗體標記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交目的基因的檢測與鑒定四（一)分子水平的檢測轉Bt基因非轉基因抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等采摘抗蟲棉植株葉接種棉鈴蟲蟲沒有死蟲被殺死沒有表達目的基因表達目的基因的檢測與鑒定四（二)個體水平的鑒定轉基因生物檢測方法觀察指標抗蟲植物害蟲吞食害蟲死亡抗病毒(菌)植物病毒(菌)感染未侵染上病斑抗鹽植物鹽水澆灌正常生長抗除草劑植物噴灑除草劑正常生長獲取目的基因產物的轉基因生物提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較細胞產物功能活性正常常見轉基因生物在個體水平上鑒定、檢測的方法（列舉如下表）目的基因的檢測與鑒定四（二)個體水平的鑒定目的基因的檢測與鑒定（小結)四類型步驟檢測內容方法分子水平檢測第一步轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因PCR擴增DNA分子雜交技術第二步目的基因是否轉錄出mRNAPCR擴增DNA-RNA分子雜交技術第三步目的基因是否翻譯形成蛋白質抗原-抗體雜交技術個體水平鑒定抗蟲或抗病的接種實驗抗性以及抗性程度抗性檢測；基因工程產品與天然產品的功能活性比較

功能活性。目的基因的檢測與鑒定四基因工程的基本操作程序獲取質粒、噬菌體等載體篩選和獲取目的基因用限制酶切割載體和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA連接酶連接，構建基因表達載體將含有目的基因的表達載體導入受體細胞檢測和鑒定目的基因是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性目的基因的篩選和獲取-前提利用PCR獲取和擴增化學方法人工合成構建基因表達載體-核心目的基因、啟動子、終止子、標記基因將目的基因導入受體細胞-關鍵農桿菌轉化法(植物)、顯微注射法(動物)、感受態(tài)細胞轉化法(微生物);目的基因的檢測與鑒定-保證分子檢測：是否插入、轉錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強度等?；蚬こ痰幕静僮鞒绦颍?個步驟）單元網(wǎng)絡構建一、目的基因的篩選與獲取基因工程的基本操作程序1.篩選適合的目的基因：3.利用PCR獲取和擴增目的基因：2.獲取目的基因的方法：從相關的已知結構和功能清晰的基因中篩選。直接獲取，人工合成，利用PCR技術獲取和擴增全稱聚合酶鏈式反應DNA半保留復制體外（PCR擴增儀/PCR儀）對目的基因的核苷酸序列進行大量復制DNA模板，4種脫氧核苷酸，2種引物，耐高溫的DNA聚合酶，能量原理操作環(huán)境目的條件過程變性（90℃以上）→復性（50℃左右）→延伸（72℃左右）DNA合成方向5’端→3’端結果DNA數(shù)：2n,需要的引物數(shù)：2n＋1－2擴增產物的檢測瓊脂糖凝膠電泳單元網(wǎng)絡構建基因工程的基本操作程序二、基因表達載體的構建（核心）1.目的2.組成3.啟動子4.終止子5.標記基因：6.描述基因表達載體的構建過程7.切割載體和切割含有目的基因的DNA片段的方法（1）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細胞中表達和發(fā)揮作用。=復制原點

+目的基因+啟動子+終止子

+標記基因基因的上游（一段有特殊結構的DNA片段）緊挨轉錄的起點，RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質基因的下游（一段特殊的DNA片斷），終止mRNA的轉錄鑒定或篩選含有目的基因的受體細胞注意：1.限制酶切位點不得破壞目的基因和載體上的各類有功能的基因2.用于切割目的基因和質粒的限制酶必須是同種酶優(yōu)點：可以避免目的基因自接，質粒自身環(huán)化，目的基因與質粒倒接雙酶切單元網(wǎng)絡構建

基因工程的基本操作程序三、將目的基因導入受體細胞四、目的基因的檢測與鑒定將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入原核細胞農桿菌轉化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法（感受態(tài)細胞法）（我國科學家獨創(chuàng))（雙子葉植物、裸子植物)基因槍法（單子葉植物)1.分子水平檢測2.個體水平鑒定③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA①檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因PCR擴增或分子雜交技術抗原-抗體雜交技術1.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉Bt基因的抗蟲棉產生了嚴重的抗性？證據(jù)是什么？

科研人員對長江流域種植的轉基因抗蟲棉進行了監(jiān)測，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉Bt基因的抗蟲棉產生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續(xù)抗性篩選，已經培育出多個高抗水平的轉基因抗蟲棉品種。

到社會中去2.科研工作者在沒有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲出現(xiàn)抗性之前，就應該想辦法應對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？

科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的