檢驗(yàn)診斷試劑免疫

檢驗(yàn)診斷試劑免疫第1頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五固相酶免疫測(cè)定ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))第2頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五酶標(biāo)志物、抗原、抗體、酶免疫復(fù)合物第3頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五酶標(biāo)志物——酶標(biāo)記抗體或抗原酶免疫技術(shù)的核心組成部分

酶結(jié)合物（conjugate）酶標(biāo)記物通過化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物

第4頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五酶標(biāo)記抗體或抗原制備方法過碘酸鈉法（直接法）常用于HRP標(biāo)記抗體或抗原

戊二醛交聯(lián)法第5頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1.辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶的活性中心(ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶

)ELISA常用酶2.堿性磷酸酶（AP）

第6頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五辣根過氧化物酶HRP上的糖羥基可以被高碘酸鈉（NaPIO4）激活生成醛基，這些醛基能通過Schiff堿與蛋白中的氨基偶聯(lián)，緊接著還原Schiff堿形成穩(wěn)定的偶聯(lián)產(chǎn)物。這種HRP偶聯(lián)標(biāo)記方法已經(jīng)被廣泛認(rèn)可，但是也存在一定的缺陷，特別是去除過量高碘酸鈉（NaPIO4）的過程較為繁瑣。需要注意的是，被高碘酸鈉（NaPIO4）激活的HRP很不穩(wěn)定，其酶活力會(huì)在幾天內(nèi)丟失第7頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第8頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第9頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五評(píng)價(jià)第10頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第11頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第12頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第13頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第14頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第15頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五均相酶免疫測(cè)定

homogenousenzymeimmunoassay

用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測(cè)定

酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性會(huì)發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物，通過測(cè)定標(biāo)記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理第16頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五均相酶免疫測(cè)定最具代表性的兩種技術(shù)酶放大免疫測(cè)定技術(shù)EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供體免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

第17頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第18頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第19頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五

利用重組DNA技術(shù)制備β-半乳糖苷酶的兩個(gè)片段：大片段稱為酶受體（enzymeacceptor,EA），小片段稱為酶供體（enzymedonor,ED），兩個(gè)片段本身均不具酶活性，但結(jié)合在一起就具有酶活性，利用這一特性建立的均相酶免疫測(cè)定稱為克隆酶供體免疫測(cè)定(CEDIA)。

CEDIA的反應(yīng)模式為競(jìng)爭(zhēng)法?？寺∶腹w免疫測(cè)定

（clonedenzymedonorimmunoassay,CEDIA）第20頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五一、基本原理：標(biāo)本中的抗原和ED標(biāo)記的抗原與特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，形成兩種抗原抗體復(fù)合物。ED標(biāo)記的抗原與抗體結(jié)合后由于空間位阻，不能再與EA結(jié)合。反應(yīng)平衡后，剩余的ED標(biāo)記抗原與EA結(jié)合，形成具有活性的酶，加入底物測(cè)定酶活力，酶活力的大小與標(biāo)本中抗原含量呈正比。第21頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第22頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第23頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第24頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五：健康人O型血或綿羊靜脈血，應(yīng)2w內(nèi)固化第25頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第26頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第27頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第28頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第29頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第30頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第31頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第32頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第33頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第34頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第35頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第36頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第37頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第38頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第39頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第40頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第41頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第42頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第43頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第44頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第45頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第46頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第47頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第48頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第49頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第50頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第51頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1.概述：以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的可濾過性，使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成。（斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)最初是從斑點(diǎn)ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展起來建立的，應(yīng)用的結(jié)合物是酶標(biāo)記的，稱為斑點(diǎn)酶免疫滲濾試驗(yàn)。90年代初發(fā)展了以膠體金為標(biāo)記物的斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA），又名滴金免疫測(cè)定法（簡(jiǎn)稱滴金法）。在滴金法中不需酶對(duì)底物的反應(yīng)，更加簡(jiǎn)便、快速，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用日漸廣泛。）斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)2.原理：以雙抗體夾心法為例。在硝酸纖維素膜的膜片中央滴加純化的抗體，為膜所吸附。當(dāng)?shù)渭釉谀ど系臉?biāo)本液體滲濾過膜時(shí)，標(biāo)本中含抗原被膜上抗體捕獲，其余無關(guān)蛋白等沒濾出膜片。其后加入的膠體金標(biāo)記也在滲濾中與已結(jié)合在膜上的抗原相結(jié)合。因膠體金本身呈紅色，陽性反應(yīng)即在膜中央顯示紅色斑點(diǎn)。3.試劑和操作滲濾裝置是滴金法測(cè)定中的主要試劑成分之一，由塑料小盒、吸水墊料和點(diǎn)加了抗原或抗體的硝酸纖維素膜片三部分組成塑料小盒可以是多種形狀的，盒蓋的中央有一直徑約0.4～0.8cm的小圓孔，盒內(nèi)墊放吸水墊料，硝酸纖維素膜片安放在正對(duì)盒蓋的中央有一直徑約0.40.8cm的小圓孔，盒的墊放吸水塑料，硝酸纖維素膜片安放在正對(duì)盒的圓孔下，緊密關(guān)閉盒蓋，使硝酸纖維素膜片貼緊吸水墊料。如此即制備成一滲濾裝置（圖19-1）。塑料小盒的形狀最多見的是扁平的長方形小板，加之滴金法的整個(gè)反應(yīng)過程都是在滲濾裝置上進(jìn)行的，因此又常稱滲濾裝置為滴金法反應(yīng)板。第52頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五

圖19-1DIGFA滲濾裝置及操作示意圖A：操作示意圖B:裝置分解圖斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)第53頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)1.原理：斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)（DICA）簡(jiǎn)稱免疫層析試驗(yàn)（ICA），也以硝酸纖維素膜為載體，但利用了微孔膜的毛細(xì)血管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析一般2.試劑和操作免疫層析試驗(yàn)以單克隆雙抗體夾心法為例。試驗(yàn)所用試劑全部為干試劑，多個(gè)試劑被組合在一個(gè)約6mm×70mm的塑料板條上，成為一單一試劑條（圖19-2），試劑條上端（A）和下端（B）分別粘貼吸水材料，免疫金復(fù)合物干片粘貼在近下端（C）處，緊貼其上為硝酸纖維素膜條。硝酸纖維素膜條上有兩個(gè)反應(yīng)