多糖分離純化及含量測(cè)定1課件

多糖的分離純化與含量測(cè)定2013年4月29日生物制藥技術(shù)專(zhuān)題主要講授內(nèi)容一、多糖的提取方法二、多糖的純化方法三、多糖含量的測(cè)定方法四、純度與相對(duì)分子質(zhì)量的檢測(cè)polysaccharide;separation；extraction;isolationpurification;contentdetermination;前言多糖在早期的天然產(chǎn)物化學(xué)研究中,因活性不明顯,常作為無(wú)效成分棄去。由于化學(xué)、生物學(xué)、藥理學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展,自20世紀(jì)80年代來(lái),人們對(duì)多糖的生物活性有了新的認(rèn)識(shí)。如香菇多糖、靈芝多糖、云芝多糖已在國(guó)內(nèi)外臨床上廣泛應(yīng)用。而其他一些多糖正在深入研究,如桑黃多糖、豬苓多糖、人參多糖、枸杞多糖等。生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、動(dòng)物多糖3大類(lèi)。多糖的提取首先要根據(jù)多糖的存在形式及提取部位，決定在提取之前是否做預(yù)處理。動(dòng)物多糖和微生物多糖多有脂質(zhì)包圍，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液進(jìn)行回流脫脂，釋放多糖；植物多糖提取時(shí)需注意一些含脂較高的根、莖、葉、花、果及種子類(lèi)，在提取前，應(yīng)先用低極性的有機(jī)溶劑對(duì)原料進(jìn)行脫脂預(yù)處理。1.溶劑法：水提醇沉法多糖是極性大分子化合物，提取時(shí)應(yīng)選擇水、醇等極性強(qiáng)的溶劑。水提醇沉法是提取多糖最常用的一種方法。用水作溶劑來(lái)提取多糖時(shí)，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提滲漉，然后將提取液濃縮后，在濃縮液中加乙醇，使其最終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%左右，利用多糖不溶于乙醇的性質(zhì)，使多糖從提取液中沉淀出來(lái)，室溫靜置一定的時(shí)間，多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和得率均較高。影響多糖提取率的因素有：水的用量、提取溫度、浸提固液比、提取時(shí)間以及提取次數(shù)等。該種方法提取多糖不需特殊設(shè)備，生產(chǎn)工藝成本低，安全，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，是一種可取的提取方法。但由于水的極性大，容易把蛋白質(zhì)、苷類(lèi)等水溶性的成分浸提出來(lái)，從而使提取液存放時(shí)腐敗變質(zhì)，為后續(xù)的分離帶來(lái)困難，且該法提取比較耗時(shí)，提取率也不高。溶劑法：酸提法為了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基礎(chǔ)上發(fā)展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基團(tuán)的多糖在較低pH值下難以溶解；含有胺基的多糖可使用乙酸或鹽酸調(diào)節(jié)提取液成酸性進(jìn)行提取，然后再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入銅鹽等生成不溶性絡(luò)合物或鹽類(lèi)沉淀而析出。溶劑法：堿提法有的酸性多糖,或分子量較大的多糖,在熱水中溶解度不大,一般在稀堿溶液中溶解度較大,所以常用稀的NaOH溶液或Na2CO3溶液提取。不過(guò)用稀堿溶液提取時(shí),提取溫度必須保持在10℃以下,否則多糖容易發(fā)生降解反應(yīng)。多糖在堿性溶液中穩(wěn)定，例如粘多糖的提取多采用堿提取法。多糖堿法提取雖然可提高多糖的收率,且可縮短提取時(shí)間,但提取液中含有其它雜質(zhì)如蛋白質(zhì),粘度過(guò)大,過(guò)濾困難,且有些多糖在堿性較強(qiáng)時(shí)會(huì)水解。通常先用熱水法提取,然后殘?jiān)儆孟A溶液提取,這樣可將大部分多種類(lèi)型的多糖提取出來(lái)。溶劑法：超臨界流體萃取法超臨界流體是指物質(zhì)處于臨界溫度和臨界壓力以上時(shí)的狀態(tài)，這種流體兼有液體和氣體的特點(diǎn)，即密度大，粘稠度小，有極高的溶解，滲透到提取材料的基質(zhì)中，發(fā)揮非常有效的萃取功能。而且這種溶解能力隨著壓力的升高而增大，提取結(jié)束后，再通過(guò)減壓將其釋放出來(lái)，具有保持有效成分的活性和無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)。由于糖類(lèi)的化合物分子量較大、羥基多、極性大，用純二氧化碳提取產(chǎn)率較低，加入夾帶劑或加大壓力則可提高提取率。該法的缺點(diǎn)是設(shè)備復(fù)雜，運(yùn)行成本高，提取范圍有限。2.酶解法：?jiǎn)我幻附夥▎我幻附夥ㄊ侵甘褂靡环N酶來(lái)提取多糖，從而提高提取率的生物技術(shù)。其中經(jīng)常使用的酶有蛋白酶、纖維素酶等。

蛋白酶對(duì)植物細(xì)胞中游離的蛋白質(zhì)具有分解作用，使其結(jié)構(gòu)變得松散；蛋白酶還會(huì)使糖蛋白和蛋白聚糖中游離的蛋白質(zhì)水解，降低它們對(duì)原料的結(jié)合力，有利于多糖的浸出。纖維素酶則能特異性地降解纖維素，使植物細(xì)胞的細(xì)胞壁破裂，有利于多糖易從胞內(nèi)釋放。影響因素：酶種類(lèi)和添加量、酶解溫度(℃)、酶解pH值、水解時(shí)間、料液比有直接關(guān)系。3.物理強(qiáng)化法：超聲波輔助提取法超聲波是頻率高于20kHz的聲波，它方向性好，穿透能力強(qiáng)，易于獲得較集中的聲能。超聲波提取是利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)。機(jī)械效應(yīng)可增大介質(zhì)的運(yùn)動(dòng)速度及穿透力，能有效的破碎生物細(xì)胞和組織，從而使提取的有效成分溶解于溶劑之中；空化作用,形成高溫和高壓的環(huán)境,增加物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的頻率和速度、溶劑的穿透力,從而加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑,提高提取率。熱效應(yīng)增大了有效成分的溶解速度，這種熱效應(yīng)是瞬間的，可使被提取成分的生物活性盡量保持不變。影響因素有：超聲波的頻率、功率、溫度、時(shí)間、料液比、超聲波發(fā)生器的型式。超聲提取可極大地提高提取效率,節(jié)約溶劑,避免高溫對(duì)提取成分的影響,與常規(guī)提取法相比,具有提取時(shí)間短、產(chǎn)率高、無(wú)需加熱等優(yōu)點(diǎn)。值得注意的是超聲時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),否則提取量反而下降,原因可能是由于超聲處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng),導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,糖鏈斷裂,使多糖提取含量下降。進(jìn)一步加熱，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞壁水分減少，細(xì)胞收縮，表面出現(xiàn)裂紋?？锥椿蛄鸭y的存在使胞外溶劑容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，溶解并釋放出胞內(nèi)有效成分，再擴(kuò)散到萃取劑中；另一方面，在固液萃取過(guò)程中，固體表面的液膜通常是由極性強(qiáng)的萃取劑所組成，在微波輻射作用下，強(qiáng)極性分子將瞬時(shí)極化，并以每秒2.45×109次的速度做極性變換運(yùn)動(dòng)，這就可能對(duì)液膜層產(chǎn)生一定的微觀“擾動(dòng)”影響，使附在固相周?chē)囊耗ぷ儽。軇┡c溶質(zhì)之間的結(jié)合力受到一定程度的削弱，從而使固液浸取的擴(kuò)散過(guò)程所受的阻力減小，促進(jìn)擴(kuò)散過(guò)程的進(jìn)行。二、多糖的分離純化1.除蛋白Sevage法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法2.色素的去除吸附法（DEAE-纖維素、硅藻土等）、氧化法（過(guò)氧化氫）、離子交換法3.多糖的純化超濾法、季胺鹽沉淀法、柱層析法和色譜法等1.除蛋白采用醇沉或其它溶劑沉淀得到的粗多糖中常含有較多的蛋白質(zhì),需要除蛋白。除蛋白的方法傳統(tǒng)上有Sevage法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法等。Sevage法根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)，用V(氯仿)∶V(戊醇或正丁醇)為5∶1或4∶1，混合物劇烈振搖20～30min，蛋白質(zhì)變性生成凝膠，離心分離，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。一般按多糖水溶液的1/5~1/4體積加入。此種方法只能除去少量蛋白質(zhì)，須反復(fù)多次，多糖有損失，得率不高,且氯仿對(duì)人體也有一定毒性,操作時(shí)應(yīng)注意。該法優(yōu)點(diǎn)是條件溫和,可避免多糖的降解。利用蛋白酶可水解蛋白質(zhì)的特性,在多糖樣品溶液中加入一些蛋白質(zhì)水解酶如中性蛋白酶和糜蛋白酶,再用Sevage法效果更佳。此法不能除去脂蛋白，因?yàn)橹鞍兹苡诼确?。三氯乙酸法三氯乙酸是一種有機(jī)酸，使多糖提取液中的蛋白質(zhì)與有機(jī)酸作用而變性沉淀。該法是在多糖水提液中滴加5%～10%與多糖水提取液等體積的三氯乙酸，混勻靜置過(guò)夜，離心除去膠狀沉淀，重復(fù)以上的操作直至溶液不再繼續(xù)混濁為止，得無(wú)蛋白質(zhì)的多糖。三氯乙酸濃度越大，除蛋白質(zhì)效果越好，但對(duì)多糖的影響也越大，可能是三氯乙酸對(duì)多糖結(jié)構(gòu)具有破壞作用，使多糖降解，而且這種破壞作用隨著三氯乙酸濃度增大而增強(qiáng)。三氟三氯乙烷法將多糖溶液與三氟三氯乙烷等體積混合，低溫?cái)嚢?0min左右，離心分離得上層水層，水層繼續(xù)用上述方法反復(fù)處理幾次，得無(wú)蛋白質(zhì)的多糖溶液，此法效率較Seavg法高，但溶劑沸點(diǎn)低，易揮發(fā)，不宜大量應(yīng)用。2.色素的去除中草藥來(lái)源的多糖,可能含有酚型化合物而顏色較深,這類(lèi)色素大多呈負(fù)性離子,不能用活性炭吸附劑脫色,可以用弱堿性樹(shù)脂DEAE-纖維素來(lái)吸附色素,這樣不僅可以達(dá)到脫色的目的,而且可以進(jìn)行多糖的分離。若多糖與色素結(jié)合,易被DEAE纖維素吸附,不能被水洗脫,這類(lèi)色素可用低溫氧化法脫色，溫度較高下氧化易引起多糖的降解。

對(duì)于同時(shí)含有游離蛋白質(zhì)和色素的多糖,可通過(guò)生成金屬絡(luò)合物的方法以同時(shí)除去蛋白和色素,方法是加入菲林試劑、氯化銅、氫氧化鋇和醋酸鉛等與多糖生成不溶性絡(luò)合物,經(jīng)分離后用陰離子交換樹(shù)脂分解絡(luò)合物得到多糖。3.多糖的純化

超濾法季胺鹽沉淀法柱層析法色譜法其他方法超濾法膜分離技術(shù)（membraneseparationtechnology，MST）是一種高效分離技術(shù)，分離過(guò)程以選擇透過(guò)性膜作為分離介質(zhì)，通過(guò)在膜兩側(cè)施加某種推動(dòng)力（壓力差、化學(xué)位差、電位差等），使原料液中組分有選擇性的通過(guò)膜。目前應(yīng)用較多的是超濾和微濾技術(shù)。如采用中空纖維超濾膜,對(duì)多糖去蛋白質(zhì)后的提取液通過(guò)超濾去除小分子雜質(zhì)。季胺鹽沉淀法季銨鹽及其氫氧化物是一類(lèi)乳化劑,可與酸性糖形成不溶性沉淀,常用于酸性多糖的分離。當(dāng)溶液的pH值增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高,也會(huì)與中性多糖形成沉淀。常用的季銨溴化物(CTAB)及其氫氧化物(CTA-OH)和十六烷基氯化吡啶(CPC),其濃度一般為1%~10%(W/V),它們可在酸性、中性、微堿性和堿性中分級(jí)沉淀分離出酸性多糖。柱層析方法纖維素柱層析陰離子交換柱層析凝膠柱層析親和層析纖維素柱層析柱中的載體是纖維素。先用乙醇液將柱內(nèi)纖維素平衡好,然后將多糖混合物全部沉淀于惰性的纖維素上面。用不同濃度乙醇水溶液(如80%,60%,40%,20%)梯度洗脫,則不同多糖就依次洗脫出來(lái)。先洗脫的是分子量最小的多糖,最終洗脫的是分子量最大的多糖。在洗脫過(guò)程中,由于各種多糖在柱上進(jìn)行無(wú)數(shù)次的溶解和沉淀過(guò)程,最終將各種多糖分離開(kāi)來(lái)。這種方法實(shí)質(zhì)上與分步沉淀法相反,可稱(chēng)其為分步溶解法。其理論塔板數(shù)較高,所以流出液的純度高。但該法的缺點(diǎn)是流速慢,純化周期長(zhǎng),特別是對(duì)于粘度較大的酸性多糖,更顯得流速過(guò)慢。陰離子交換柱層析至今應(yīng)用最廣泛的陰離子交換劑有二乙基氨基乙基纖維素(DEAE-cellulose),DEAE-葡聚糖(DEAE-Sephadex)及DEAE-瓊脂糖(DEAE-Sepharose)三種,其中以DEAE-cellulose應(yīng)用得最廣泛。DEAE-cellulose具有開(kāi)放性的骨架,多糖能自由進(jìn)入載體中并進(jìn)行迅速擴(kuò)散。它有較大的比表面積,雖然其離子交換容量?jī)H為0.70~0.75mmol/g,但其對(duì)多糖的吸附量較離子交換樹(shù)脂大許多。

陰離子交換柱層析是目前多糖純化中（也是柱層析中）應(yīng)用最普遍的一種方法,特別是對(duì)于體積較大的多糖溶液,大多數(shù)首先采用陰離子交換柱層析。通過(guò)柱層析,多糖溶液得到濃縮及初步純化(有的多糖通過(guò)該步驟即可得到各種均一多糖組分)。由于纖維素上的離子交換基團(tuán)較少,排列疏散且呈弱堿性,所以對(duì)大分子的吸附較弱,用一定離子濃度的鹽就可將其洗脫下來(lái)。陰離子交換柱層析適合于分離各種酸性、中性多糖及粘多糖。它的分離機(jī)理包括離子交換,而更重要的是吸附與解吸附,所以其不僅可應(yīng)用于中性多糖與酸性多糖的分離,也可應(yīng)用于不同中性多糖的分離。凝膠柱層析它是根據(jù)多糖分子的大小和形狀的不同即按分子篩的原理進(jìn)行分離的。凝膠柱層析在多糖的分離純化上應(yīng)用得很普遍。通常在獲得粗多糖后,先用陰離子交換柱層析、透析、干燥,溶解后再用凝膠柱層析。凝膠柱層析是目前植物多糖最常用的高級(jí)純化方法。常用的凝膠有各種型號(hào)的交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)、瓊脂糖凝膠(Sepharose)和聚丙烯酰胺凝膠(Bio-gel)三大類(lèi)，以及后來(lái)在這些凝膠上進(jìn)行性能改良的新一代凝膠,如Sephacryl、Superdex和Superose等。展開(kāi)劑為各種濃度的鹽溶液及緩沖溶液,離子強(qiáng)度最好不低于0.2mol/L(否則拖尾嚴(yán)重)。親和層析某些特定多糖具有和某些相對(duì)應(yīng)的專(zhuān)一分子可逆結(jié)合的特性,如一種凝集素(刀豆球蛋白)能專(zhuān)一地與分支多糖結(jié)合。分子之間的這種結(jié)合能力稱(chēng)為親和力,使它們結(jié)合后再將其解離,可以純化多糖。把欲分離的可親和的一對(duì)分子的一方作為配基(ligand)與不溶性載體結(jié)合使固定化,裝入色譜柱(親和柱),然后把含有欲分離的多糖溶液作流動(dòng)相,這時(shí)溶液中只有能和配基具有親和力的多糖分子被結(jié)合而吸附,其他多糖則流出柱外,然后再改變流動(dòng)相的離子強(qiáng)度及pH,使配基與多糖解離,則被純化的多糖就流出柱外。其他方法分級(jí)沉淀法大多數(shù)活性多糖可溶于水，3個(gè)碳以下的多糖還可溶于乙醇，隨著聚合度的增大，多糖在乙醇中的溶解度逐漸降低。根據(jù)這一性質(zhì)可在多糖的濃縮水溶液中分批加入乙醇，使乙醇的體積濃度逐漸增加到50，100，200，900mL/L，從而使不同聚合度的多糖分別沉淀析出。如在五味子多糖提取液中加入無(wú)水乙醇，使其體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到10%，30%，45%，65%，進(jìn)行分級(jí)沉淀，最后將剩余的母液直接蒸發(fā)濃縮，得到5個(gè)分級(jí)的五味子多糖組分。三、多糖含量的測(cè)定方法多糖含量測(cè)定常規(guī)方法是以無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品,采用苯酚-硫酸法,或者蒽酮-硫酸法。上述兩種方法由于操作簡(jiǎn)單,試劑容易獲得而在多糖含量測(cè)定中被廣泛采用。苯酚-硫酸法的原理多糖在硫酸存在下先水解成單糖,再脫水生成具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。由五碳糖生成的是糠醛,甲基五碳糖生成的是5-甲糠醛,六碳糖生成的是5-羥甲糠醛。糠醛酸在此條件下往往脫羧,并生成糠醛?？啡┘捌溲苌锖捅椒涌s合成有色物質(zhì),在480nm處有最大吸收,吸收值與糖的含量呈線性關(guān)系。蒽酮-硫酸法的原理蒽酮-硫酸法其原理是糖類(lèi)與濃硫酸在沸水浴中迅速脫水生成糠醛或其衍生物,再與蒽酮試劑縮合,形成藍(lán)綠色溶液,在620nm處有最大吸收,吸收值與糖的含量呈線性關(guān)系。這兩種方法也存在較為嚴(yán)重的缺陷:首先,葡萄糖是單糖,而植物多糖的組成是多樣的,只用葡萄糖作為參照不確切;其次,顯色試劑的不專(zhuān)屬,單糖的干擾嚴(yán)重,實(shí)際上測(cè)得的結(jié)果是總糖的結(jié)果。在未嚴(yán)格純化的植物多糖樣品中,這種情況更為普遍。為排除還原性單糖的干擾,可采用DNS(3,5-二硝基水楊酸)比色法測(cè)定還原糖含量。其原理是在堿性溶液中,3,5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色氨基化合物,在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系。再將通過(guò)硫酸-苯酚法或者蒽酮-硫酸法得到的總糖結(jié)果減去還原糖,即得較準(zhǔn)確的多糖含量。糖醛酸含量測(cè)定糖醛酸含量測(cè)定則以咔唑-硫酸法多見(jiàn)。該法的原理在于糖醛酸在硫酸存在下會(huì)與咔唑反應(yīng)生成含羰基的紫紅色產(chǎn)物。該產(chǎn)物在530nm下有最大吸收,吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。四、純度與相對(duì)分子質(zhì)量的檢測(cè)純度鑒定分子量的測(cè)定結(jié)構(gòu)測(cè)定包括多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定、多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定純度鑒定多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，通常所說(shuō)的多糖純品實(shí)質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組分。多糖純度鑒定的常用方法：超離心、高壓電泳、凝膠層析、HPLC法等。現(xiàn)在應(yīng)用較多的是HPLC法，旋