(18)-7-原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生物技術(shù)制藥

基因工程菌的構(gòu)建-原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)學(xué)習(xí)目標(biāo)熟悉并掌握如何構(gòu)建有效的原核表達(dá)系統(tǒng)理解并識(shí)記原核表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)缺點(diǎn)蛋白表達(dá)系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主中表達(dá)為目的，由宿主、外源基因、載體和一些輔助成分共同組成的體系1973年，S.Cohen等首次將含卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒和含四環(huán)素抗性基因的質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，使其獲得兩種抗性。外源基因在大腸桿菌中成功表達(dá)基因工程元年原核表達(dá)系統(tǒng)已建立原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌、枯草桿菌、乳酸菌、沙門氏菌、蘇云金桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等主要優(yōu)點(diǎn)宿主菌遺傳背景清楚，商品化菌種齊全，方便購買原核細(xì)胞操作簡(jiǎn)便、繁殖快和周期短大規(guī)模生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量較高下游純化工藝簡(jiǎn)單，易于控制，生產(chǎn)效率高目的基因結(jié)構(gòu)與形式啟動(dòng)子外顯子內(nèi)含子外顯子外顯子內(nèi)含子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)cDNA：在體外經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后與RNA互補(bǔ)的DNA鏈。與基因組DNA不同，cDNA沒有內(nèi)含子而只有外顯子的序列原核表達(dá)體系選取目的基因時(shí)，要選用cDNA目的基因結(jié)構(gòu)與形式密碼子偏愛性：只選用同一種氨基酸同義密碼子中的1~2種，稱為偏愛密碼子稀有密碼子：不被經(jīng)常利用的密碼子稱為稀有或利用率低的密碼子大腸桿菌稀有密碼子：AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA、GTC密碼子表表達(dá)載體選擇與構(gòu)建理想表達(dá)體系強(qiáng)而可控的啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)較高拷貝數(shù)穩(wěn)定性好表達(dá)產(chǎn)物易純化常見啟動(dòng)子：lac、trp、tac、PL/PR、T7基因工程常用工程菌：經(jīng)改造的限制系統(tǒng)和重組系統(tǒng)缺陷的細(xì)菌選擇菌株依據(jù)原則：菌株與表達(dá)載體配套外源表達(dá)蛋白穩(wěn)定性：考慮蛋白酶缺陷型菌株作為起始表達(dá)菌株外源基因的結(jié)構(gòu)目的蛋白的結(jié)構(gòu)宿主菌的選擇外源基因表達(dá)形式胞內(nèi)表達(dá)：融合型表達(dá)載體——融合蛋白非融合型表達(dá)載體——天然完整蛋白胞外表達(dá)：分泌型表達(dá)載體——產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙非融合表達(dá)載體非融合表達(dá)：外源基因的一種獨(dú)立表達(dá)形式，不與細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)或多肽融合在一起進(jìn)行表達(dá)，即將外源基因直接克隆與啟動(dòng)子和SD序列的下游進(jìn)行表達(dá)易被蛋白酶降解可能形成不溶性包含體PSD目的基因終止序列融合表達(dá)載體融合表達(dá)：將一段特殊的蛋白質(zhì)或短肽的基因構(gòu)建入載體，使之與目的蛋白連接表達(dá)形成融合蛋白融合蛋白在大腸桿菌內(nèi)較穩(wěn)定，表達(dá)效率提高原核短肽設(shè)計(jì)為可用于親和純化的標(biāo)簽，從而大大簡(jiǎn)化融合蛋白的純化可以通過化學(xué)方法或蛋白酶法切除融合蛋白中特殊蛋白質(zhì)，形成具有活性的目的蛋白PSD目的基因終止序列編碼特殊蛋白基因胞外表達(dá)通過將外源基因融合至編碼原核蛋白信號(hào)肽序列的下游實(shí)現(xiàn)分泌分泌至周質(zhì)周質(zhì)腔中蛋白酶含量少，蛋白穩(wěn)定性高表達(dá)量較胞內(nèi)低可能形成包含體分泌至胞外（培養(yǎng)基中）可直接分析培養(yǎng)液中重組蛋白水平下游純化步驟簡(jiǎn)單原核工程菌篩選個(gè)體水平篩選抗生素抗性篩選法α-互補(bǔ)篩選法營養(yǎng)缺陷性篩選法噬菌斑篩選法分子水平篩選核酸分子雜交法PCR方法限制性內(nèi)切酶譜法DNA序列測(cè)定法蛋白水平篩選酶聯(lián)免疫吸附