高效液相色譜法檢測海水養(yǎng)殖環(huán)境中喹諾酮類藥物殘留

/高效液相色譜法檢測海水養(yǎng)殖環(huán)境中喹諾酮類藥物殘留摘要：建立了一種養(yǎng)殖海水中諾氟沙星、環(huán)丙沙星爭恩諾沙星3種喹諾酮類抗生素殘留量的高效液相色譜一熒光測定方法。水樣經(jīng)稀鹽酸調PH后經(jīng)HLB固相萃取柱富集、凈化，用外標法定量。結果表明，諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星檢出限分別是2、1和1ｇg／L，定量限分別是６．6、3．3和3．3uｇ／Ｌ，添加濃度為10、2０和5０ug/L時,3種物質的回收率為7１．9％～8５．３%，批內變異系數(shù)≤１0%,批問變異系數(shù)≤7％。利用該方法對黃海沿岸部分養(yǎng)殖場及近岸海水（北起３６。40.3０37N，1２10８．93９’E；南至35。３9。36’N,119。52.４３3’Ｅ)進行分析，諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星的檢出質量濃度分別為6。20～982、５５.2和11。6～5５．4ｕg／Ｌ。實驗結果表明，該方法靈敏度高,重現(xiàn)性好，適用于養(yǎng)殖海水中諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的檢測。關鍵詞喹諾酮類抗生素高效液相色譜固相萃取海水喹諾酮類（Quinolonｅs，QNｓ）抗生素是一族人工合成的新型殺菌性抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性以及毒副作用小的特點,主要用于水生動物弧菌病、鏈球菌病、水霉病和寄生性疾病的防治，其中諾氟沙星(Ｎorfloxａcｉn，ＮF）、環(huán)丙沙星(Ciprofloｘacin,CＩP)和恩諾沙星(Enrｏｆloxacin,EN）等被廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中.目前，我國針對這類抗生素的研究主要集中于水產(chǎn)品中檢測技術和代謝動力學的研究(方星星等２０0４；錢云云等2007；曲曉榮等200７;王洪艷等2007;何平等２008；李娜等2009）。近年來我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，產(chǎn)量和規(guī)模不斷增加,但由于環(huán)境惡化和養(yǎng)殖模式的改變，水生動物疾病頻發(fā).為了預防和治療水生動物疾病,抗生素被廣泛應用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中.但研究表明,所使用的抗生素僅２0％＂—30%被魚類吸收,大部分進入環(huán)境中（Samｕelsen198９）,而這部分抗生素再次進入食物鏈,可能導致養(yǎng)殖環(huán)境中病菌耐藥性的產(chǎn)生，導致二次污染（Ｈamschereｔa1．20０２).這不僅影響到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,而且還威脅著生態(tài)環(huán)境的安全.因此,需要建立水環(huán)境中這類藥物的檢測方法。高效液相色譜法測定海水中環(huán)丙沙星含量的方法，并測定其衰減度，在O～6h內環(huán)丙沙星衰減很快,但６h后其濃度基本穩(wěn)定,同時還發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星在海水中衰減程度隨鹽度的增加而加快。利用高效液相色譜法分析城市河水中的多種抗生素，水樣由稀鹽酸調ｐH至4．2后經(jīng)HLＢ固相萃取，用內標法通過HPLC進行定量分析.對海水養(yǎng)殖環(huán)境中喹諾酮類殘留量的檢測研究報道較少。為減少海水養(yǎng)殖環(huán)境中鹽分、浮游生物及微小顆粒對喹諾酮類測定存在的干擾，本研究采用固相萃取技術對海水中的3種喹諾酮類抗生素進行富集和凈化處理，采用高效液相色譜熒光檢測器測定，建立了諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星3種喹諾酮類抗生素殘留檢測方法，并測試了青島附近黃海海水養(yǎng)殖區(qū)（從3６.４0．３０3’N，1２1。8.93９'E至３5。３９．367Ｎ，１19。52.4337E）海水中的喹諾酮的含量,為海水中藥物的生態(tài)風險評估提供依據(jù).1材料與方法1．１海水樣品海水樣品采自黃海近岸海水養(yǎng)殖區(qū)，包括５個采樣點（圖1）：山東省海陽市大閻家鎮(zhèn)某半滑舌鰨養(yǎng)殖場;山東省即墨市鰲山衛(wèi)鎮(zhèn)某大菱鲆養(yǎng)殖場；青島市太平角海區(qū);青島市紅島灘涂養(yǎng)殖區(qū);山東省膠南市瑯琊鎮(zhèn)某海參養(yǎng)殖場.分別用玻璃取樣瓶在每個采樣點采集500ml表層海水,4℃密封保存,經(jīng)0．45um醋酸纖維濾膜水相濾膜過濾后使用。1．2儀器和試劑海能LC70００型高效液相色譜儀，配LC7070熒光檢測器；VisiｐｒepＴM－DＬ型固相萃取裝置（Sｕｐeｌeｏ）；漩渦混合器（德國IKＡ儀器公司)；KQ－６00DＥ型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司);Milli-Ｑ超純水器(Milｌi-pore公司)；Laｂｏrｏｔa４0０型旋轉蒸發(fā)器（Heidｏｐlh公司）；PHS—３C精密ｐH計（雷磁儀器廠）；ＯａsisＨLB固相萃取小柱(３ml/６０mｇ，Waterｓ公司）。標準品和試劑:諾氟沙星標準品(含量≥9９．8％)、環(huán)丙沙星標準品(含量≥99．8％）、恩諾沙星標準品(含量≥９9。8％)(美國Sｉgmacｈemicａｌ公司)；甲醇、乙腈為色譜純；四丁基溴化銨、磷酸為分析純；實驗用水均來自Miｌli-Q純水系統(tǒng)。標準儲備液（100ｕｇ/m1):準確稱取諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星標準品各10．０mg，分別用乙腈溶解并定容至100ｍl棕色容量瓶中，于4℃保存（保存期不超過3個月）?；鞓耸褂靡?分別取適量各標準儲備液，用流動相稀釋成濃度均為1.0ug/mｌ的混合標準工作使用液,4℃保存。0．０1mol／L四丁基溴化銨溶液(0.0１ｍol／Ｌ）：精確稱取3。22g四丁基溴化銨，用水溶解并定容至1００0ml棕色容量瓶中，用磷酸調ｐＨ至3．１。１．3方法1．3．1提取方法取水樣6０m１，用稀鹽酸調pH值至４.0,通過HLB固相萃取柱富集、凈化.HLB柱上樣之前依次用３ml甲醇和3mｌ水活化。水樣過柱流速控制在１mｌ／min以下。樣品過柱后，先用2mｌ水淋洗，減壓抽干后用10ml甲醇洗脫至雞心瓶中，35～40℃旋轉蒸發(fā)至干。用１。０mｌ流動相定容，充分渦旋溶解殘渣，濾液經(jīng)0。２2弘m微孔濾膜過濾，供高效液相色譜儀測定。１。3．2測試方法色譜柱：AgilentZORBＡXSB-C／１8柱(250ｍmX4．６mm）；柱溫：4０℃；流動相：乙腈＋0。01ｍol/L四丁基溴化銨（pH3。１)＝5+９５（Ｖ／V）；流速：１。5mｌ／min;熒光檢測器:激發(fā)波長280nm，發(fā)射波長4５0nｍ；進樣量：２０ul。1.3。3標準曲線的繪制1。3.3．1標準工作液,準確量取混標使用液，用流動相配制成濃度為1、２、5、10、２0、50和１00/ｚg/L的系列標準工作液.1．3．3．２繪制標準工作曲線將繪制標準曲線所用的系列標準工作液從低濃度到高濃度依次注入液相色譜儀,按１．3．2方法進行分析.每一濃度進兩針，按其所得峰面積的平均值與對應標準溶液濃度作標準曲線,得出回歸方程及相關系數(shù)。１．3．4檢出限和定量限取加標水樣按“1．3．１和1．３．2”方法進行處理和分析,以3倍信噪比(S／N=3)對應濃度為分析物的最低檢測濃度,以１0倍信噪比（S/N=10）對應濃度為分析物的最低定量濃度。１．3.5回收率及變異系數(shù)的測定取空白海水樣品６0m1，添加10、20和5０ug／Ｌ的混標使用液，每個添加水平設5個平行，按“１．3.１和1．３．2”的方法進行處理和分析,取峰面積值分別計算3種喹諾酮類抗生素的含量，以加入量和測定值之比計算回收率。按每個濃度各測定5個樣品計算批內變異系數(shù)；每個濃度各測3批，計算批間變異系數(shù)。2結果與討論2．1標準曲線配制濃度為1、2、5、1０、20、5０和１０0ug／L３種喹諾酮類的標準液，測定其峰面積,并做面積與濃度工作曲線（圖2）。結果表明,諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的1~10０uｇ／L濃度與其峰面積呈良好的線性關系,其相關參數(shù)見表１。２.２檢出限和定量限以3倍信噪IZ(Ｓ/N＝３)對應濃度為分析物的最低檢測濃度，３種喹諾酮類抗生素的最低檢測限分別為NF2ug／L，CＩP1ug/L和ＥN１ug／L。以１0倍信噪比(S／N=1０）對應濃度為分析物的最低定量濃度,3種喹諾酮類抗生素的最低定量限分別為NF6.6ug/Ｌ、CＩＰ３。3ug/L和EN3。3uｇ/L。2．3回收率及變異系數(shù)的測定取空白海水為試驗對象，測定３種喹諾酮類的添加濃度在10～５0弘g／L時的回收率和變異系數(shù)（表2）?；厥章示冢?.9％~8５．３%之間，批內變異系數(shù)均≤１０%，批問變異系數(shù)≤7%。2。4實驗色譜圖2。5樣品測定分析了1０份采自不同海域的養(yǎng)殖海水，結果見表3。譚建華等（２0０7）利用固相萃取的方法分析了珠江廣州河段的城市河水，檢測到諾氟沙星和環(huán)丙沙星的質量濃度范圍為０．197，’一0.5１0／堅ｇ／L，說明人們日常生活中也有３種喹諾酮類抗生素；本試驗對黃海沿岸部分養(yǎng)殖場及近岸海水分析，有養(yǎng)殖海水檢測到３種喹諾酮類抗生素,而近岸海水未檢測到３種喹諾酮類抗生素。這說明大水域生態(tài)系統(tǒng)由于面積大、范圍廣，更有利于稀釋、降解抗生素。養(yǎng)殖海水中檢出喹諾酮類抗生素的原因可能是:（1)３種喹諾酮類抗生素藥物仍在使用。藥物的不規(guī)范使用是導致水環(huán)境中存在檢出藥物的重要原因（王朋華等2０08）;(2)殘留在海水中的未代謝藥物。水生動物用藥后，藥物以原形或其代謝物的形式通過糞便和尿液排到體外，繼而對海水造成污染；(3)殘留在海底底泥中未代謝的藥物.Kiｉmmeｒeｒ(200１）報道環(huán)丙沙星進入水體后，會被沉積物吸附，有65％進入到污泥中。3結論本研