穩(wěn)定性同位素示蹤法

穩(wěn)定性同位素示蹤法第1頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5.1947年9月在美國(guó)Wisconsin大學(xué)召開(kāi)了“同位素在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中應(yīng)用”專(zhuān)題討論會(huì)，從此開(kāi)始了穩(wěn)定性核素示蹤技術(shù)應(yīng)用的新紀(jì)元。6.近20年，穩(wěn)定性核素示蹤技術(shù)迅速發(fā)展，分離分析方法取得了較大突破，13C、2H、18O、15N廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)保、農(nóng)藥、農(nóng)學(xué)、微生物等研究領(lǐng)域。我國(guó)先后分離了25種元素的100多種穩(wěn)定性核素，例如：15N標(biāo)記化合物就有30余種。第2頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

幾個(gè)概念

穩(wěn)定性同位素（Stableisotope）

豐度（Abundance）

A

即某核在該組同位素中濃度(通常指人工加濃了的)。

自然豐度（Naturalabundaa）A自(AO)15N：0.365%、18O:0.204%

原子百分超（Atompercentexcess）

a

a=A-A自

又稱富集度（Enrichment）富集15N（Enriched15N）貧化15N（Depeled15N)第3頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

一.穩(wěn)定性同位素示蹤法的基本依據(jù)：

1.自然界中一種元素同位素組成是相對(duì)恒定

2.同一元素的同位素具有相同的化學(xué)性質(zhì)

3.同一元素的同位素之間存在質(zhì)量差異第4頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

重要化學(xué)元素的穩(wěn)定性同位素元素同位素自然豐度樣品來(lái)源H1H99.985新鮮的表面淡水

2H(D)0.0147B10B18.46意大利天然硼酸鹽

11B81.54C12C98.892捷克撲利茲石灰石

13C1.108N14N99.635

大氣中的氮?dú)?/p>

15N0.365O16O99.759大氣中的氧氣

17O0.037418O0.2039第5頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

氮的同位素表同位素射線種類(lèi)半衰期自然豐度12Nβ+0.011S13Nβ+9.96m14N--99.63515N--0.36516Nβ-7.1S17Nβ-4.15S18Nβ-

0.63S第6頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

穩(wěn)定性同位素標(biāo)記物的命名

1978年國(guó)際純化學(xué)和化學(xué)聯(lián)合會(huì)IUPAC的命名法:結(jié)構(gòu)式:

15[N]HCl或15NHCl（這樣純的物質(zhì)不存在)單標(biāo)記化合物:H215N-CO-NH2

15N-尿素，例如15N的豐度可為5%，10%，15%……雙標(biāo)記化合物(一個(gè)同位素):H215N-CO-15NH2尿素4.

混合標(biāo)記化合物:(15NH2)13CO(13C15N)尿素第7頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一核素A（%）質(zhì)量數(shù)

14N99.63514

15N0.36515注意：由于同位素之間的質(zhì)量差異，因此它們的物理、化學(xué)、生物化學(xué)等性質(zhì)會(huì)有所不同，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，需注意同位素效應(yīng)。第8頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

二.穩(wěn)定性同位素示蹤法的特點(diǎn)：1.無(wú)放射性，無(wú)輻射效應(yīng)及不良影響。2.安全、對(duì)人無(wú)傷害。3.無(wú)污染，不受環(huán)境條件限制。4.無(wú)衰變，實(shí)驗(yàn)時(shí)間不受限制。5.可進(jìn)行放射性示蹤法難以進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。例：N素中T最長(zhǎng)的13N：T=9.096m第9頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一

三.穩(wěn)定性同位素分析法的基本流程同位素引入生物體

動(dòng)植物原始樣品儀器所需的待測(cè)樣品

進(jìn)樣過(guò)程

質(zhì)譜分析法光譜分析法

記錄

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析第10頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

四.影響15N引入豐度的因素

1.實(shí)驗(yàn)材料對(duì)15N的稀釋程度。

2.N素在不同部位分布的不均勻性

3.分析測(cè)定技術(shù)所能達(dá)到的精度。第11頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一15N示蹤法引入N素肥料的豐度計(jì)算

參考公式

af=Wp?Rp?ap/Nf?RN式中：af：N素肥料的原子百分超

Wp：植物總重量（待測(cè)）

ap：植物樣品中原子百分超

Rp：植物樣品中含N百分率

Nf：施純N量

RN：N肥利用率第12頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

注意事項(xiàng)：1.同位素交換反應(yīng)：在一定條件下，標(biāo)記的銨鹽可與大氣發(fā)生反應(yīng)：

15NH+4水溶液+14NH3→14NH+4水溶液+15NH315N豐度高時(shí)應(yīng)注意。2.同位素效應(yīng)：藻類(lèi)對(duì)14C、13C、12C的吸收依次遞減。3.予測(cè)樣品測(cè)定項(xiàng)目……第13頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

五、質(zhì)譜和光譜測(cè)定15N原理

14N和15質(zhì)量不同質(zhì)譜：把N2離子化為28N-N2，29N-N2，30N-N2

使其在均勻磁場(chǎng)中發(fā)生不同角度偏轉(zhuǎn)2光譜：28N-N2：譜線波長(zhǎng)為2976.8埃

29N-N2：譜線波長(zhǎng)為2982.9埃

30N-N2：譜線波長(zhǎng)為2988.6埃-第14頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一入口出口加速電壓1800的均勻磁場(chǎng)第15頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第16頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

六.供儀器待測(cè)樣品的制備、測(cè)量

1.對(duì)待測(cè)樣品的要求：

(1)因?yàn)闇y(cè)量的是不同質(zhì)量離子流的相對(duì)含量，因此，保證有一定的N量即可。一般要求含N量1mg/ml最少不低于0.5mg。

(2)儀器的本底檢查。

(3)離子峰的選擇（14N和15N的峰比28N、29N小10倍，選28N、29N、30N）。

(4)儀器精確度檢查（檢查去O2后的空氣或純N氣）。第17頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.分析樣品的制備：

(1)K氏法（Kjeidali）質(zhì)譜分析常用法。

第18頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

A.樣品的消化：（例：0.05g植樣+10ml濃H2S04+3.3gSe:CuSO4:K2SO4為1:10:100混合催化劑→樣液清亮再消煮5h（土）或2h(植)，溫度120-140℃。樣品予處理：水楊酸—硫酸法：5g干土或0.5g植樣+12ml水楊酸：硫酸為50g：1000ml溶液中放置30min，再加2.5g硫代硫酸鈉和15ml水，緩緩加熱至停出起泡→冷卻→常規(guī)消化）。第19頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

B.蒸餾：

用蒸汽蒸餾將消化液中NH3分離出來(lái)，并測(cè)定總N。方法：消化液中加過(guò)量40%NaOH,釋放的NH3被蒸汽逐出，經(jīng)冷凝后被2%硼酸吸收，加入混合指示劑用標(biāo)準(zhǔn)硫酸滴定（設(shè)置一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液）。此步驟將NH3-N轉(zhuǎn)變成了NH4+-N（銨態(tài)N），儀器分析適宜量1mgN/樣品2-3ml(濃縮或稀釋)。(制備好的樣品送交儀器分析)第20頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

以下在質(zhì)譜儀上進(jìn)行C.將NH4+-N轉(zhuǎn)化為N2氣:

在真空條件下，將上述樣品與次溴酸鈉反應(yīng)，放出N氣（在質(zhì)譜儀內(nèi)進(jìn)行）詳見(jiàn)書(shū)15N章節(jié)。第21頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

制樣時(shí)注意：1.所有試劑純度要高。2.消化要完全。3.防止樣品間交叉污染（每個(gè)樣品蒸餾前用蒸餾15ml乙醇洗器皿）。4.“Y”型管及內(nèi)部反應(yīng)抽氣須徹底，防其它氣體干擾。

第22頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一以下在光譜儀上進(jìn)行,可用液體樣品也可用干樣品(2).杜馬法（Dumas）

—光譜分析中常用法適用于含N量低（少于100μg）的樣品，光譜測(cè)量。

第23頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第24頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

方法：A．在放電管中裝入樣品，氧化劑（CuO）及吸收劑（CaO）抽真空，抽完后熔封放電管。在馬福爐中燃燒0.5-3h（560℃）樣品，（CaO吸收CO2和H2O)以產(chǎn)生N2氣。B．冷卻至室溫后在光譜儀上測(cè)定純樣品火焰為粉紅色或淡黃色有CO2呈白色，有水呈黃色）第25頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

注意：

如果是液體樣品。需用Pyrex玻璃管（1cmΦ2mm）吸滿樣液，烘干后再放入放電管。

CuO、CaO使用前用700℃高溫烘干除去CO2，H2O，并在12-18Kg/cm2壓力下制成棒狀,備光譜分析第26頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

儀器分析方法步驟：1、通電予熱儀器10分鐘，打開(kāi)光電倍增管高壓。2、放電管裝入燃燒室固定架上。3、開(kāi)高頻發(fā)生器電源，使放電管中樣品放電發(fā)光。4、選擇適宜放大倍數(shù)對(duì)28N、29N、30N峰分別進(jìn)行放大，在2970A0-2990A0之間掃描。5、放下記錄筆，接通掃描開(kāi)關(guān)，劃出28N、29N、30N峰高。6、求得平均峰高，計(jì)算15N豐度。第27頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第28頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

七．15N實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

14、15的質(zhì)量比28、29、30的小10倍，不參加運(yùn)算

當(dāng)15N豐度小于5%:

R=質(zhì)量為28離子流強(qiáng)度/質(zhì)量為29離子流強(qiáng)度此時(shí)30N的流子離強(qiáng)度很小，

1.豐度：A=1/2R+1×100%(1)第29頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

當(dāng)15N豐度大于5%

R’=質(zhì)量為29離子流強(qiáng)度/質(zhì)量為30離子流強(qiáng)度

A=2/R’+2×100%或者由質(zhì)量為28、29、30的峰值直接算出：A=[29]+2[30]/2（[28]+[29]+[30])×100%

第30頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一以下以植物材料實(shí)驗(yàn)為例進(jìn)行計(jì)算，其計(jì)算原理也適用于動(dòng)物等，共同的條件是在一個(gè)相對(duì)封閉系統(tǒng)內(nèi)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。（若是用32P等實(shí)驗(yàn)，計(jì)算時(shí)把原子百分超換成比強(qiáng)度即可）

2.植樣的原子百分超:ap

ap

=A-A自（2）（A自=0.365%或空白實(shí)驗(yàn)值）第31頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

3.植物從肥料中攝取N的%:Ndff

植物中N有多少%是來(lái)自于肥料（Percentageofintheplantderivedfromthefertilizer），可以是根、莖、葉、果實(shí)的任一Ndff

Ndff=ap/af×100%（設(shè)N素來(lái)源于土壤和肥料二方面）（3）af：肥料N的原子百分超（或動(dòng)物飼料N的原子百分超，此時(shí)又多了一個(gè)動(dòng)物排泄因素）。

第32頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一上片解釋見(jiàn)第五章第37片同位素稀釋法第33頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4、植物從土壤中攝取N的%（Percentageofintheplanttissuederivedfromthesoil）:Ndfs

Ndfs

=1-Ndff(4)5、植物中來(lái)自肥料的N量:Npf

Npf=植物總N量×ap/af

（5）

Npf+Nps=植物中總N量（已在定N中測(cè)定,K氏定N法）設(shè)總N來(lái)源于土壤和肥料，則：第34頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

6.植物中來(lái)自土壤N的量：Nps

Nps=總N-Npf(6)

7.N素利用率：R=Npf/Nf×100%(7)Nf：施入純N的總量

8.土壤A值：A值

=Ndfs/Ndff×Nf

(Kg/公頃)（8）

A值：表示土壤有效供應(yīng)N素量(用A值可以解釋為什么某種土壤適合于種植某種植物)。

(來(lái)自：A值/Ndfs=Nf/Ndff)

第35頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

9、N素回收率：

R回

=已檢出的Nf量/Nf×100%(9)10、N素?fù)p失率：

R失

=100%-R回(10)以上公式適用32P等放射性物質(zhì)（以比強(qiáng)為單位）等計(jì)算。

第36頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一練習(xí)題：

蕃茄實(shí)驗(yàn)地中施用15N-尿素純N20Kg/畝，收獲后測(cè)得植物含N量為30Kg/畝，植物樣品的15N豐度為0.67%，15N-尿素的15N豐度為1.37%，設(shè)自然豐度為0.37%，尿素的含N量為40%。求：1、每畝施入尿素量？2、肥料N素的利用率？3.A值?

解：∵ap=0.67-0.37=0.3%af=1.37-0.37=1.0%∴Ndff=ap/af=0.3/1.0=30%Npf=Np×Ndff=30Kg/畝×30%=9Kg/畝施入尿素量：W=20/40%=80Kg/畝肥料N素利用率：R=Npf/Nf=9/20=45%A值=Ndfs/Ndff×Nf=70%/30%×20Kg/畝=46.7Kg/畝（土壤中可供蕃茄生長(zhǎng)的每畝有效N--當(dāng)然不是全部被吸收,A值愈大說(shuō)明土壤的供N能力愈強(qiáng)）第37頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一下列研究方法：1.測(cè)根瘤數(shù)目和干物質(zhì)產(chǎn)量。早、有無(wú)？2.氮素平衡法。十分煩瑣。3.比較固N(yùn)作物和非固N(yùn)作物總N量差異。4.乙炔還原法。簡(jiǎn)單、靈敏。5.乙炔還原成乙烯，存在轉(zhuǎn)換因子（3個(gè)）。

15N示蹤與生物固氮(以下各方法簡(jiǎn)講)工業(yè)固氮（Haber-Bosch反應(yīng)）：N2+3H2催化劑/45℃，200在氣壓2NH3生物固氮：N2+6H++xATP6e-/固氮酶2NH3+xADP+xPi第38頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

6.同位素法：①15N2還原法（Burris,1941）:充15N2密室進(jìn)行

NdfA=a樣/a氣×100%

固氮量=NdfA×總N量②同位素稀釋法（J、O、Legg等，1975），15N施入土壤

NdfA=1-a固/a非③AN值法（M、Fried等，1975），田間種固N(yùn)、非固N(yùn)NdfA=(As+Afix-As)×NdfF/AfAs、Af、Afix分別代表土壤、肥料、大豆有效N量。

NdfF:來(lái)自肥料N素的比例。第39頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，