第二章提取分離與鑒定的方法與技術

第二章提取分離與鑒定的方法與技術第1頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)提取方法與技術第二節(jié)分離精制和鑒定的方法與技術第二章天然藥物化學成分提取分離和鑒定的方法與技術第2頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)分離精制和鑒定的方法與技術一、系統(tǒng)溶劑分離法第二章天然藥物化學成分提取分離和鑒定的方法與技術二、兩相溶劑萃取法三、沉淀法四、結晶與重結晶法五、透析法六、分餾法七、色譜法第3頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一七、色譜法柱色譜法第二章天然藥物化學成分提取分離和鑒定的方法與技術薄層色譜法紙色譜法高效液相色譜法氣相色譜法第4頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一學習目標：掌握薄層色譜法、紙色譜法的概念；分離原理和操作技術。2.熟悉比移值的計算方法。3.了解高效液相色譜法和氣相色譜法的應用和適用范圍

。第5頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一

(二)薄層色譜法薄層色譜法（thinlayerchromatography，TLC）是一種快速、簡便、靈敏的分離檢識方法。即將吸附劑均勻地鋪在玻璃板上，把欲分析的樣品點加到薄層上，然后用合適的溶劑展開而達到分離、鑒定和定量目的的方法。該方法不僅對分離鑒定天然產(chǎn)物成分起到了獨特的作用，在分析化學、藥物化學、染料、農藥等領域，均得到廣泛的應用。第6頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一1基本原理吸附和分配兩種薄層色譜法。

2常用的吸附劑與支持劑同柱色譜法。因硅膠和氧化鋁吸附性能好，較為常用。3展開劑的選擇根據(jù)被分離成分的溶解性、酸堿性及溶劑的極性進行選擇。4顯色方法常用紫外光照射、噴霧顯色和碘蒸氣顯色三種方法。第7頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一5操作技術***(1)制板(鋪板)方法：有干法輔板(軟板)和濕法輔板(硬板)。(1)硅膠G板：除另有規(guī)定外，取一份硅膠G，加3份純化水，在研體中研磨均勻成糊狀，除去表面的氣泡，迅速傾于玻璃板上，振蕩均勻，置水平臺上室溫涼干后，活化，備用。(2)硅膠G-CMC-Na板：除另有規(guī)定外，取1份硅膠G，加3份0.1～0.5%的CMC-Na的水溶液，在研缽中研磨均勻使成糊狀，除去表面的氣泡，迅速傾于玻璃上，振蕩均勻，置水平臺上室溫晾干后，活化，備用。第8頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一(3)氧化鋁CMC-Na板：除另有規(guī)定外，取1份氧化鋁，加3份0.5%～1%CMC-Na水溶液，在研缽中研磨均勻，除去表面的氣泡，迅速鋪于玻璃板上，振蕩均勻，置水平臺上室溫晾干后，活化，備用。G表示黏合劑煅石膏，含G的薄層板特點：耐腐蝕性試劑，但不耐磨，易脫落。CMC-Na表示黏合劑羧甲基纖維素鈉，特點：含CMC-Na的薄層板機械性能強，可用鉛筆寫字，但不耐腐蝕。

第9頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一(2)薄層板的活化將涂鋪完成后的薄層板置水平臺上室溫涼干后：硅膠板于100～110℃活化30～60分鐘，置干燥器中備用。也有的不用活化，鋪好陰干后即可使用。氧化鋁薄層板在150～160℃活化4小時，即可得到Ⅲ～Ⅳ活性的薄層板，在200℃活化4小時即可得到Ⅱ級活性的薄層板。第10頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一(3)點樣：①樣品溶液配制：將樣品溶液配制成1%～2%的乙醇(或丙酮、氯仿)溶液，盡量避免用水，因為水溶液斑點易擴散，且不易揮發(fā)除去。②確定起始線的位置：在距離薄板一端2cm處用鉛筆輕輕劃一直線作為起始線。③點樣：少量多次原則。用平口毛細管將樣品溶液吸入管內，點在薄板的起始線上，可在一個原點上反復點2～3次，以增加其點樣量，每點一次須待溶劑揮干后再點第二次，斑點直徑不要大于3mm，若在同一板上點幾個樣品，每個斑點間距應保持1.5～2cm。

第11頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一(4)展開①展開劑配制②飽和10～15min③展開方式：近水平展開、上行法、下行法，單向展開、雙向展開、單向二次展開等。單向展開：將點好樣品的薄板放入盛有展開劑的色譜槽或色譜缸中,展開劑的用量要適中，以浸沒薄層板下端0.5cm為宜。將飽和完畢后的薄層板下端浸入展開劑中進行展開。待展開至規(guī)定距離(一般為10～12cm)，取出薄板劃出溶劑前沿線。雙向展開：操作與上行單向展開相同，在單向展開完畢后，將展開劑倒出，再換入新的展開劑，按與原展開方向成90°的方向進行第二次展開。單向二次展開：取一塊較長的薄板劃出起始線和中線，將樣品點在起始線上按上行單向展開的方法使展開劑行至中線，取出薄板，待溶劑揮干，在第二種展開劑中按原方向進行第二次展開，展至溶劑前沿，這樣可使揮發(fā)油中各成分得到良好的分離。一般常用于揮發(fā)油中混合成分的分離。

第12頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一(5)顯色如果斑點有色，可在日光下直接觀察；若有熒光可在紫外燈下觀察熒光；如果斑點本身無色又無熒光，可噴灑適宜的顯色劑，待斑點顯色后，計算Rf值。

第13頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一(6)Rf值計算顯色后，各成分斑點在薄板上的位置可用Rf值表示。Rf=A成分的Rf=B成分的Rf=由于同一種成分在相同的色譜條件下（吸附劑、展開劑、溫度等）的Rf值相同，故利用Rf可進行定性鑒別。例如欲知某提取液中是否含有A成分，可將對照品A成分與提取液在同一塊薄板上點樣、進行展開，顯色后，若提取液中某斑點的Rf與對照品A的Rf相同，則說明提取液中含A成分。第14頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一(6)特點具有價廉、設備簡單、操作容易、展開迅速、所得斑點擴散小、分離過程受溫度影響較小、可使用腐蝕性試劑、試樣負荷量大、分辨率高等優(yōu)點。(7)適用范圍①分離鑒定、定量分析、微量制備等；②配合柱色譜作跟蹤分離，了解分離效果，指導溶劑系統(tǒng)的選擇。第15頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一(8)提示根據(jù)被分離成分的溶解性、酸堿性等性質，選擇合適的吸附劑和展開劑是吸附色譜法分離的關鍵；薄層板的制備要求厚薄均勻（0.25～0.5mm),無氣泡；點樣時注意不要損壞薄層板的表面；在TLC法中能使各組分Rf值達到0.2～0.3的溶劑系統(tǒng)，可選作柱色譜的分離條件。(9)制備性薄層色譜用于分離微量混合物或天然產(chǎn)物的降解產(chǎn)物。第16頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一七、色譜法柱色譜法第二章天然藥物化學成分提取分離和鑒定的方法與技術薄層色譜法紙色譜法高效液相色譜法氣相色譜法第17頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一(三)紙色譜法紙色譜****：是以濾紙作為載體，濾紙上吸附的水分作為固定相，與水不相混溶的有機溶劑作為流動相的一種分配色譜。第18頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一1.操作技術(1)濾紙的選擇與預處理色譜濾紙質地應均勻平整，具有一定機械強度，不含影響展開效果的雜質，也不應與所用顯色劑起作用。分類：根據(jù)展開速度不同色譜濾紙可分為快速、中速和慢速濾紙。根據(jù)用途不同分為定性濾紙(薄)和定量濾紙(厚)。選擇：若展開劑黏度大，展開速度慢，可選用快速濾紙；若展開劑展開速度快，可選用中速或慢速濾紙；若用于定性分析可選用定性濾紙；若用于定量分析，可選用定量濾紙。剪裁濾紙時要使展開方向與濾紙的紋路方向垂直，才能獲得較滿意的分離效果。分離特殊成分時，可將濾紙預處理。例如，分離酸堿性成分時，可將濾紙浸入一定的pH緩沖溶液中預處理，使其維持恒定的酸堿度后再使用(也可在展開劑中加入一定比例的酸或堿)。第19頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一(2)點樣

將選好的濾紙在一端約2.5cm處劃起始線，將樣品點于起始線上，原點的直徑不宜大于4mm，各點之間的距離應在1.5～2cm。(3)展開

紙色譜的展開方式分為上行、下行、徑向、單向二次和雙向展開等形式，其操作與薄層色譜基本相同。(4)顯色(5)計算Rf值第20頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一2.特點設備簡單、操作容易、展開迅速、但載樣量低。3.適用范圍親水性化合物的分離。4.提示根據(jù)被分離成分的性質，選擇合適的色譜濾紙和移動相溶劑系統(tǒng)；定性、定量分析，微量物質的制備性分離，但常用于定性鑒別和提取分離過程中有效成分的跟蹤檢測。第21頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一七、色譜法柱色譜法第二章天然藥物化學成分提取分離和鑒定的方法與技術薄層色譜法紙色譜法高效液相色譜法氣相色譜法第22頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一(四)高效液相色譜法（HPLC）也稱高壓液相色譜法。它是在經(jīng)典的液相柱色譜的基礎上發(fā)展而成的一種高效、快速、高靈敏的色譜分離方法。根據(jù)柱內填料的不同及不同的分離機制，可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜及凝膠色譜。由于采用了高效填充劑，并配以高壓輸液泵、高靈敏檢測器、自動記錄裝置及自動收集裝置，使高效液相色譜法的分離速度及效率均大大提高，更趨于儀器化、自動化，且使用范