染色體涂染技術(shù)課件

染色體涂染技術(shù)

Chromosomepaintingtechniques

染色體涂染技術(shù)

染色體涂染技術(shù)即將整條染色體、某條染色體臂（長臂或短臂）或者染色體某個片斷的DNA制備成探針，然后用熒光原位雜交的方法，將探針雜交到中期分裂相染色體上，在熒光顯微鏡下觀察熒光素在染色體上標(biāo)記的顏色，從而分析和研究染色體的重組、畸變以及同源基因等的一種新技術(shù)。

染色體涂染技術(shù)1.染色體DNA探針的制備；2.熒光原位雜交。1.染色體DNA探針的制備①流式細(xì)胞分類法（flowcytometry）

該法是用一種或多種熒光染料將懸浮液中的中期分裂相染色體染色。由于染色體大小、形態(tài)、組成和結(jié)構(gòu)的不同，所染色的特征有其特異性，從而可以通過流式細(xì)胞術(shù)將特定的染色體收集起來。1.染色體DNA探針的制備

①流式細(xì)胞分類法（flowcytometry）局限性：如果受試物的染色體形態(tài)單一、數(shù)目較多，如牛(2n=60)和狗(2n=78)的所有常染色體及綿羊(2n=54)和馬(2n=64)的大部分常染色體都是端位著絲點，因此，僅根據(jù)染色體的形態(tài)和大小很難將所有的染色體準(zhǔn)確地區(qū)分開來。1.染色體DNA探針的制備

②克隆基因庫或體細(xì)胞雜交株通過特定的克隆基因文庫或者特異性的體細(xì)胞雜交細(xì)胞系制備某條染色體整個或部分DNA探針。該法特異性強，準(zhǔn)確性高，并且可以與功能遺傳學(xué)的研究結(jié)合起來，但對實驗室要求較高，取材來源和研究范圍有所限制。

1.染色體DNA探針的制備③染色體顯微切割和PCR擴(kuò)增

顯微切割(microdissection)技術(shù)是在顯微狀態(tài)或顯微鏡直視下直接或通過顯微操作系統(tǒng)對欲選取的材料進(jìn)行切割分離并收集用于后續(xù)研究的技術(shù)。

染色體顯微切割分手工切割和激光切割法，倒置顯微鏡上裝配切割臂，安上硅化玻璃針，找到分散良好的分裂相來切割所需染色體片段。1.染色體DNA探針的制備

③通過染色體顯微切割和PCR擴(kuò)增制備特異性的染色體DNA探針。相對而言，該方法具有直接、準(zhǔn)確、簡便和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。

2.熒光原位雜交

fluorescentinsituhybridazation,FISH

什么是原位雜交？原位雜交是基于DNA分子復(fù)制原理而發(fā)展起來的一種技術(shù)。用帶有標(biāo)記（放射性同位素、熒光染料等）的DNA或RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測核酸(RNA或DNA）片段進(jìn)行雜交，然后用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在及定位。2.熒光原位雜交

基本原理：如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析。2.熒光原位雜交實驗流程：

FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→（染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測→結(jié)果分析。

2.熒光原位雜交

優(yōu)點:

熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全；

探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；實驗周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針當(dāng)；

多色FISH在同一個核中顯示不同顏色可同時檢測多種序列；

既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以