動物細(xì)胞傳代培養(yǎng)

細(xì)胞工程實驗報告實驗課程：細(xì)胞工程實驗內(nèi)容：動物細(xì)胞傳代培養(yǎng)實驗?zāi)康模菊莆障?xì)胞傳代培養(yǎng)的原理＞了解細(xì)胞傳代培養(yǎng)所需專用設(shè)備、試劑＞學(xué)習(xí)細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作實驗原理?動物細(xì)胞原代培養(yǎng)成功，細(xì)胞生長增殖形成單層細(xì)胞后，會進(jìn)一步擴展匯合，覆蓋整個培養(yǎng)瓶底，細(xì)胞會因生存空間不足或密度過大，發(fā)生接觸抑制，并引起營養(yǎng)物質(zhì)枯竭和代謝產(chǎn)物積累，發(fā)生細(xì)胞中毒，影響正常生長。這時需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶按1：2或1：3稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程稱之為傳代。80%匯合或剛匯合細(xì)胞是理想的傳代階段。?消化法細(xì)胞傳代培養(yǎng)，是用一定含量的胰蛋白酶來進(jìn)行消化使貼壁的單層細(xì)胞脫離下來，形成分散的細(xì)胞懸液，然后用新鮮的培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋、分裝和培養(yǎng)。實驗試劑及器具■改良吸管加樣器■培養(yǎng)瓶（玻璃、塑料）PE液0.25%胰蛋白酶液MEM+10%小牛血清液抽濾裝置■超純水器■倒置顯微鏡■二氧化碳培養(yǎng)箱實驗步驟與操作75%酒精消毒雙手、工作臺面、培養(yǎng)瓶、瓶蓋、試管，并過火焰。用酒精棉球擦拭培養(yǎng)用液瓶蓋，打開瓶蓋在酒精燈火焰上一過，蓋上瓶蓋，但不必擰緊將培養(yǎng)瓶內(nèi)的舊培養(yǎng)液倒入燒杯中舊培養(yǎng)液倒掉后，鏡下觀察細(xì)胞十分干凈、清晰從布袋中取出已消毒的吸管，插入加樣器從布袋中取出已消毒的吸管，插入加樣器，注意吸管的刻度面向上，加樣器的柄面偏左側(cè)，以便于操作時觀察將吸管過火焰（豎向）將吸管過火焰（橫向）吸取PE液5ml從側(cè)面加入瓶內(nèi)?平放輕搖40下，放置2?5分鐘?將PE液倒出?吸取胰酶0.3ml將胰酶加入瓶中，加入時直沖細(xì)胞貼壁處，平放輕搖，使酶液漫過整個瓶底部，放置1-2分鐘，可于鏡下觀察，并輕拍在倒置顯微鏡上觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)漸漸回縮，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞慢慢變圓時用手掌拍打瓶底和瓶側(cè)，使細(xì)胞從瓶壁脫落下來并懸浮和流動起來，再在顯微鏡下觀察。準(zhǔn)備好一個新瓶，松開瓶蓋一圈，吸取MEM培養(yǎng)液5ml準(zhǔn)備加入培養(yǎng)瓶將培養(yǎng)液加入原培養(yǎng)瓶用吸管向瓶壁吹吸數(shù)次，混合成均勻的細(xì)胞懸液后，吸出2ml,裝入一新瓶內(nèi)，剩余的留于瓶內(nèi)，再在兩瓶中分別加入1ml和2ml的新鮮培養(yǎng)液將培養(yǎng)瓶口及蓋過火焰后擰緊做上標(biāo)記?將傳代好的培養(yǎng)瓶放置于合適溫度的培養(yǎng)箱中（視不同細(xì)胞要求而確定培養(yǎng)溫度）培養(yǎng)?細(xì)胞由剛傳代好時的圓球型（游離期）一貼附（貼壁期）f伸展（鋪展）f扁平或梭型或多邊形f繁殖f長滿整個培養(yǎng)瓶底f下一次傳代（或凍存）試驗中PE、胰蛋白酶作用PE作用：＞PE：絡(luò)合、吸收、去除維持組織完整性的鈣、鎂離子，促進(jìn)細(xì)胞分離；＞鈣、鎂離子有抑制胰酶的消化作用，因此用PE液去除；＞將殘余未倒盡的血清除盡，因為血清也會抑制胰酶的消化作用；＞洗去未倒盡的死細(xì)胞。胰蛋白酶作用：＞胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，水解除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，從而使細(xì)胞分離。＞胰蛋白酶液濃度越高，消化作用越強，但超過一定限度會損傷細(xì)胞，消化時間也要適度。實驗結(jié)果（傳代前）（傳代后）（加胰酶后）（加胰酶后）七思考與討論請結(jié)合實驗體會簡述細(xì)胞傳代培養(yǎng)成功的標(biāo)志和顯微鏡下觀察到的現(xiàn)象。（消化前后、游離期、貼壁期、指數(shù)生長期等不同時期細(xì)胞狀態(tài)、培養(yǎng)液的清澈度、顏色、細(xì)胞界限等），并比較成功與不成功培養(yǎng)及其他培養(yǎng)狀態(tài)的差別。答：消化前細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底，細(xì)胞緊密無間隙。消化后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)漸漸回縮，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞慢慢變圓，細(xì)胞從瓶壁脫落下來并懸浮和流動起來。游離期細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞圓球形，細(xì)胞懸浮，培養(yǎng)液渾濁。貼壁期細(xì)胞扁平或梭型或多邊形，透明度較好。指數(shù)生長期培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并逐漸匯合，細(xì)胞密度增大。?培養(yǎng)成功標(biāo)志：細(xì)胞生長狀態(tài)良好，透明度大；細(xì)胞內(nèi)顆粒少，沒有空泡,細(xì)胞形態(tài)完整，飽滿。?成功與不成功培養(yǎng)及其他培養(yǎng)狀態(tài)的差別比較：成功的：細(xì)胞生長狀態(tài)良好，透明度大；細(xì)胞內(nèi)顆粒少，沒有空泡,細(xì)胞形態(tài)完整，飽