流式細(xì)胞儀的原理

流式細(xì)胞儀的原理第1頁(yè)/共50頁(yè)流式細(xì)胞術(shù)的原理及應(yīng)用第2頁(yè)/共50頁(yè)流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段，能夠快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞或顆粒的物理和化學(xué)特性（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。第3頁(yè)/共50頁(yè)流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)（1）流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，從分子水平上獲取多種信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。（2）測(cè)量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量第4頁(yè)/共50頁(yè)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……細(xì)胞功能?

細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原?

細(xì)胞活性?

細(xì)胞內(nèi)/外的細(xì)胞因子?

激素結(jié)合位點(diǎn)?

細(xì)胞受體?

鈣離子濃度?

線粒體膜電位?

……第5頁(yè)/共50頁(yè)一、流式細(xì)胞儀的工作原理采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測(cè)的靈敏度和特異性；用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析精確性。第6頁(yè)/共50頁(yè)1.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)（1）液流系統(tǒng)（2）光學(xué)系統(tǒng)（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第7頁(yè)/共50頁(yè)（1）液流系統(tǒng)

單細(xì)胞懸液大多數(shù)儀器檢測(cè)范圍是在50-300μm大小。將細(xì)胞懸液注射進(jìn)入鞘液中這一過(guò)程,稱為流體動(dòng)力學(xué)聚焦第8頁(yè)/共50頁(yè)液流系統(tǒng)示意圖第9頁(yè)/共50頁(yè)（2）光學(xué)系統(tǒng)

由激光光源、分色反光鏡、光束成形器、透鏡組、濾片和光電倍增管組成。FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector第10頁(yè)/共50頁(yè)流式細(xì)胞儀與顯微鏡的區(qū)別區(qū)別流式細(xì)胞儀光學(xué)顯微鏡光源激光自然光、燈光對(duì)象細(xì)胞、生物粒子細(xì)胞、組織等承載工具鞘液及流動(dòng)室載玻片檢測(cè)信號(hào)光學(xué)信號(hào)形態(tài)及染色放大方式PMT、放大電路目鏡×物鏡、光學(xué)放大統(tǒng)計(jì)計(jì)算機(jī)人工結(jié)果多參數(shù)，高通量綜合分析簡(jiǎn)單，單參數(shù)第11頁(yè)/共50頁(yè)二、散射光的測(cè)量

細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍360°立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。第12頁(yè)/共50頁(yè)前向散射光（FS）

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。

通常在FCM應(yīng)用中，選取FS作閾值，來(lái)排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對(duì)被測(cè)細(xì)胞的干擾。第13頁(yè)/共50頁(yè)前向散射光示意圖FALSSensorLaser第14頁(yè)/共50頁(yè)前向散射光第15頁(yè)/共50頁(yè)側(cè)向散射光（SS）

側(cè)向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90°角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。第16頁(yè)/共50頁(yè)側(cè)向散射光示意圖FALSSensor90LSSensorLaser第17頁(yè)/共50頁(yè)側(cè)向散射光第18頁(yè)/共50頁(yè)

光散射測(cè)量的用途

測(cè)得的FS與SS信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。光散射測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

第19頁(yè)/共50頁(yè)三、熒光的測(cè)量熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過(guò)波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi)，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。第20頁(yè)/共50頁(yè)熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)第21頁(yè)/共50頁(yè)熒光信號(hào)的檢測(cè)使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量第22頁(yè)/共50頁(yè)第23頁(yè)/共50頁(yè)熒光補(bǔ)償?shù)?4頁(yè)/共50頁(yè)5ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5/PC7第25頁(yè)/共50頁(yè)四、細(xì)胞分選原理

通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。第26頁(yè)/共50頁(yè)細(xì)胞分選示意圖細(xì)胞懸液形成液流柱流動(dòng)室振動(dòng)液流斷裂成液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)不充電充電第27頁(yè)/共50頁(yè)第28頁(yè)/共50頁(yè)五、數(shù)據(jù)的顯示與分析參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式（單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點(diǎn)圖）設(shè)門分析技術(shù)第29頁(yè)/共50頁(yè)（一）參數(shù)說(shuō)明FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少以及熒光種類第30頁(yè)/共50頁(yè)（二）數(shù)據(jù)顯示方式直分析方圖單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點(diǎn)圖二維等高圖假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析第31頁(yè)/共50頁(yè)1.單參數(shù)直方圖

由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。第32頁(yè)/共50頁(yè)單參數(shù)直方圖細(xì)胞相對(duì)數(shù)量信道(channel)第33頁(yè)/共50頁(yè)2.雙參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。第34頁(yè)/共50頁(yè)雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖綠色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度第35頁(yè)/共50頁(yè)（三）設(shè)門分析技術(shù)1.Gate設(shè)置：指根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。第36頁(yè)/共50頁(yè)A淋巴細(xì)胞B單核細(xì)胞C中性粒細(xì)胞A、B、C均為任意門第37頁(yè)/共50頁(yè)線性門第38頁(yè)/共50頁(yè)

2.

區(qū)閾（Region設(shè)置）:

如十字門分析時(shí)，由四個(gè)區(qū)閾構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。

D1：CD4+/CD3-D2：CD4+/CD3+D3：CD4-/CD3-D4：CD4-/CD3+第39頁(yè)/共50頁(yè)（1）淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)：CD3,CD4,CD8,CD16+56,CD19

免疫功能的變化監(jiān)測(cè)，AIDS（2）HLA-B27:強(qiáng)直性脊柱炎

（3）白血病免疫分型：白血病的分類（4）貧血的鑒定：PNH（CD55,CD59）,血小板抗體

(5)………..

六、流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用第40頁(yè)/共50頁(yè)七、流式細(xì)胞儀的科研應(yīng)用細(xì)胞周期的分析干細(xì)胞研究癌癥病人的多藥耐藥性細(xì)胞動(dòng)力學(xué)功能研究環(huán)境微生物分析流式細(xì)胞術(shù)與分子生物學(xué)研究流式細(xì)胞術(shù)在免疫檢驗(yàn)中的應(yīng)用第41頁(yè)/共50頁(yè)DNA細(xì)胞周期分析ScelldivisionG1(DNAsynthesis)G2M(mitosis)第42頁(yè)/共50頁(yè)第43頁(yè)/共50頁(yè)P(yáng)I染色檢測(cè)細(xì)胞周期Protocol

離心收集細(xì)胞，棄上清，用PBS洗細(xì)胞兩次。加入預(yù)冷的70%乙醇，于40C固定過(guò)夜，或-200C長(zhǎng)期固定。細(xì)胞染色：離心收集細(xì)胞，用1mlPBS洗細(xì)胞一次，加入500ulPBS（含50ug/ml溴化乙錠（PI），100ug/mlRNaseA,0.2%TritonX-100)40C避光孵育30分鐘。流式細(xì)胞儀檢測(cè)：一般細(xì)胞計(jì)數(shù)2-3萬(wàn)個(gè)。結(jié)果用軟件Modfit分析。第44頁(yè)/共50頁(yè)第45頁(yè)/共50頁(yè)

細(xì)胞凋亡的檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞膜通透性的變化(Hoechest33342和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）Caspases激活(Caspase-3)

線粒體跨膜電位降低(Rhodamine123）膜磷脂酰絲氨酸外化(AnnexinV-FITC/PI)Ca2+濃度升高(Fluo-3）DNA斷裂及含量的變化(TUNEL和PI）第46頁(yè)/共50頁(yè)

Annexin-V和PI雙染protocol

細(xì)胞用冷PBS洗滌二次并在恰當(dāng)?shù)娜旧彌_液（bindingbuffer）中以1x106

細(xì)胞/mL的濃度重懸吸取100ul的細(xì)胞(1x105)至試管中。加進(jìn)適量的熒光標(biāo)記的annexin-V試劑和PI。混勻后避光室溫下孵育15分鐘。（必須在室溫下進(jìn)行）孵育后加進(jìn)400ul染色緩沖液，立即上流式細(xì)胞儀分析。第47頁(yè)