細(xì)菌和病毒的遺傳轉(zhuǎn)化接合

細(xì)菌和病毒的遺傳轉(zhuǎn)化接合第1頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)菌的遺傳重組一、轉(zhuǎn)化二、接合三、性導(dǎo)四、轉(zhuǎn)導(dǎo)一個細(xì)菌細(xì)胞的DNA與另一個細(xì)菌細(xì)胞的DNA的交換重組可以通過4種方式進(jìn)行P213第三節(jié)細(xì)菌的遺傳分析第2頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二一、轉(zhuǎn)化(transformation)概念：某些細(xì)菌(或其他生物)能通過其細(xì)胞膜攝取周圍供體(donor)的染色體片段，并將此外源DNA片段通過重組整合到自己染色體組的過程。只有當(dāng)整合的DNA片段產(chǎn)生新的表現(xiàn)型時，才能測知轉(zhuǎn)化的發(fā)生。轉(zhuǎn)化中接受供體遺傳物質(zhì)的稱為受體(receptor)。P213(一)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗(二)、轉(zhuǎn)化過程(三)、轉(zhuǎn)化在遺傳分析中的應(yīng)用第3頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二(一)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗1.基礎(chǔ)知識莢膜菌落毒性類型光滑型S發(fā)達(dá)光滑有I,II,III粗糙型R無粗糙無I,II野生型肺炎雙球菌的菌落一種突變型為粗糙型兩者根本差異在于莢膜形成；莢膜的主要成分是多糖，具特殊的抗原性；不同抗原型是遺傳的、穩(wěn)定的，一般情況下不發(fā)生互變。第4頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二2.Griffith轉(zhuǎn)化研究P213第5頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二Griffith對其試驗結(jié)論及發(fā)展根據(jù)上述研究結(jié)果Griffith認(rèn)為：(有毒)死細(xì)菌中的某種物質(zhì)轉(zhuǎn)移到(無毒)活細(xì)菌中，并使之具有毒性，導(dǎo)致小家鼠死亡。他將這種細(xì)菌遺傳類型的轉(zhuǎn)變稱為轉(zhuǎn)化，并將引起轉(zhuǎn)化的物質(zhì)稱為轉(zhuǎn)化因子(tranformingprinciple)。以后一些研究者重復(fù)上述試驗，并且加入了體外培養(yǎng)試驗，即：將加熱殺死的SIII細(xì)菌與無毒RII細(xì)菌混合培養(yǎng)，然后注入小家鼠體內(nèi)，同樣導(dǎo)致家鼠死亡。表明：細(xì)菌在培養(yǎng)條件下也能夠?qū)崿F(xiàn)遺傳類型間的定向轉(zhuǎn)化。第6頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二3.阿維利(Avery)等的轉(zhuǎn)化實驗(1944)實驗結(jié)果：來源于加熱殺死的SIII細(xì)菌，并使RII細(xì)菌轉(zhuǎn)化成為SIII型細(xì)菌的轉(zhuǎn)化因子是DNA。第7頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二實驗結(jié)論轉(zhuǎn)化定義：某一基因型的細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一基因型的DNA而使它的基因型和表現(xiàn)型發(fā)生變化的現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)化。Avery等人的實驗也表明：決定細(xì)菌遺傳類型的物質(zhì)是DNA，即證明了DNA就是遺傳物質(zhì)。（p36）由于他們采用的實驗方法當(dāng)時不被人們廣泛接受，而且得出的結(jié)論與當(dāng)時人們的傳統(tǒng)觀念(認(rèn)為蛋白質(zhì)是遺傳物質(zhì))不符合，而長期沒有得到人們的承認(rèn)。P213第8頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)菌轉(zhuǎn)化過程（一）轉(zhuǎn)化的過程非感受態(tài)細(xì)胞外源DNA被洗掉了轉(zhuǎn)化因子感受態(tài)細(xì)胞外源DNA仍與細(xì)胞結(jié)合

整合吸收吸附洗滌兩種核酸酶：切為約14kb的片段使外源DNA片段變?yōu)閱捂?二)、轉(zhuǎn)化過程P214第9頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二(二)、轉(zhuǎn)化過程1.感受態(tài)與感受態(tài)因子：感受態(tài)指細(xì)菌能夠從周圍環(huán)境中吸收DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。感受態(tài)主要受一類蛋白質(zhì)(感受態(tài)因子)影響，感受態(tài)因子可以在細(xì)菌間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，從感受態(tài)細(xì)菌中傳遞到非感受態(tài)細(xì)菌中，可以使后者變?yōu)楦惺軕B(tài)。一般認(rèn)為感受態(tài)出現(xiàn)在細(xì)菌對數(shù)生長后期，并且某些處理過程可以誘導(dǎo)或加強感受態(tài)，以大腸桿菌為例，用Ca2+(CaCl2)處理對數(shù)生長后期的大腸桿菌可以增強其感受能力。P214第10頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二轉(zhuǎn)化過程2.供體DNA與受體細(xì)胞結(jié)合(binding)：結(jié)合發(fā)生在受體細(xì)胞特定部位；供體DNA片段為雙鏈；結(jié)合過程是一個可逆過程。3.DNA的穿入和攝?。寒?dāng)細(xì)菌結(jié)合點飽和之后，細(xì)菌開始攝取外源DNA；往往只有一條DNA單鏈進(jìn)入細(xì)胞，另一條鏈在膜上降解。4.聯(lián)會(synapsis)與外源DNA片段整合(integration)：整合指單鏈的轉(zhuǎn)化DNA與受體DNA對應(yīng)位點的置換，穩(wěn)定摻入到受體DNA中的過程，實際就是遺傳重組的過程。研究整合的分子機制也就是研究遺傳重組的分子機制。P214第11頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二第12頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二第13頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二轉(zhuǎn)化過程P213第14頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二(三)、轉(zhuǎn)化在遺傳分析中的應(yīng)用共轉(zhuǎn)化供體一條DNA片段上的兩個基因同時轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象稱為～。共轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜繪制利用共同轉(zhuǎn)化繪制細(xì)菌連鎖遺傳圖譜的基本原理：相鄰基因發(fā)生共同轉(zhuǎn)化的概率與兩者的距離成正向關(guān)系→基因間距離越近，發(fā)生共同轉(zhuǎn)化的頻率越高，反之越低。因此可能通過測定兩基因共同轉(zhuǎn)化的頻率來指示基因間的相對距離。第15頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜應(yīng)用：①兩個基因同時轉(zhuǎn)化的效率（連鎖或不連鎖）②基因定位（遺傳作圖）（枯草桿菌）P215雜交實驗：trp2+his2+tyr1+×trp2-his2-tyr1-（黎德伯格等）結(jié)果(轉(zhuǎn)化子類型):

基因座位

trp2+---+++

his2++-+--+tyr1+++--+-

數(shù)目11940366068541826001071180第16頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二3660p215

trp234

his213tyr1表10-5第17頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二二、接合(conjugation)(一)、接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實(二)、F因子及其在雜交中的行為(三)、中斷雜交試驗作圖概念：在原核生物中，接合是指遺傳物質(zhì)從供體—“雄性”轉(zhuǎn)移到受體—“雌性”的過程。

P215重點：接合的概念與基本原理、掌握F-、F+、Hfr菌株的概念、區(qū)別和用途；中斷雜交試驗及重組作圖。第18頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二(一)、接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實材料：大腸桿菌(Escherichiacoli)K12菌株的兩個營養(yǎng)缺陷型品系：

A—甲硫氨酸缺陷型met-和生物素缺陷型bio-；

B—蘇氨酸缺陷型thr-和亮氨酸缺陷型leu-。方法：將A、B兩菌株混和，在基本培養(yǎng)基(固體)上涂布培養(yǎng)。結(jié)果：

平板上長出原養(yǎng)型菌落(++++)。P2151946年，黎德伯格和塔特姆的大腸桿菌雜交試驗：第19頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二1946年黎德伯格和塔特姆接合試驗原養(yǎng)型菌落頻率10-7第20頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二幾種可能解釋及其分析對上述試驗結(jié)果原養(yǎng)型菌落可能產(chǎn)生于：親本細(xì)菌A或B發(fā)生了回復(fù)突變；兩品系細(xì)胞通過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料——互養(yǎng)作用；兩品系間交換DNA；發(fā)生細(xì)胞融合，形成了異核體或雜合二倍體。P216結(jié)論：這些解釋均不成立。第21頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二回復(fù)突變？Lederbery和Tatum利用的雙營養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)行試驗，已基本排除A或B品系發(fā)生回復(fù)突變產(chǎn)生原養(yǎng)型細(xì)菌的可能。單基因回復(fù)突變的頻率約為10-6；雙基因回復(fù)突變的頻率則為10-12，頻率很低。但試驗中產(chǎn)生原養(yǎng)型菌落產(chǎn)生的頻率非常高，因此基本可以排除回復(fù)突變的可能。第22頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二互養(yǎng)作用？試驗材料：A品系：A-B+T1S(met-bio-thr+leu+T1S)；B品系：A+B-T1R(met+bio+thr-leu-T1R)。試驗方法：將A、B品系混合接種在基本培養(yǎng)基表面；短時間后噴T1殺死A品系，使其不能持續(xù)產(chǎn)生thr與leu供B品系持續(xù)生長。結(jié)果與結(jié)論：仍然出現(xiàn)原養(yǎng)型菌落。從而表明互養(yǎng)并非原養(yǎng)型菌落出現(xiàn)的原因，而可能發(fā)生了遺傳重組。第23頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二交換DNA？Lederberg和Tatum曾把品系A(chǔ)的培養(yǎng)液經(jīng)加熱滅菌，加入到B品系的培養(yǎng)物中，未得到原養(yǎng)型菌落；表明原養(yǎng)型菌落可能不是由轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)生。戴維斯(Dawis1950)U型管試驗；實驗結(jié)論：細(xì)胞直接接觸是原養(yǎng)型細(xì)菌產(chǎn)生的必要條件。結(jié)果沒有得到原養(yǎng)型細(xì)菌；第24頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二異核體和雜合二倍體？

若細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生融合，產(chǎn)生異核體或雙雜合二倍體。這兩種情況類似于二倍體生物的雜合體,將產(chǎn)生原養(yǎng)型菌落。異核體：指由于細(xì)胞融合而在細(xì)胞內(nèi)含有遺傳組成不同的兩個或多個細(xì)胞核。

雙雜合二倍體：是指異核體進(jìn)一步發(fā)生核融合，形成二倍體細(xì)胞核，核內(nèi)含有兩種遺傳物質(zhì)。

細(xì)菌為單倍配子體生物，異核體和二倍體只能暫存。培養(yǎng)繁殖過程中必將發(fā)生分離，產(chǎn)生各種缺陷型菌落，對試驗中得到的原養(yǎng)型菌落后代研究表明，后代沒有出現(xiàn)預(yù)期的性狀分離現(xiàn)象。第25頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實經(jīng)過上述分析可認(rèn)為：在Lederberg和Tatum的試驗中，發(fā)生了一種不同于轉(zhuǎn)化的遺傳重組方式，稱之為接合。Hayes(1952)研究表明：大腸桿菌兩種不同菌株(品系)接合過程中遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是單向的；P217大腸桿菌存在兩種類型品系：雌性與雄性分別作為接合過程中遺傳物質(zhì)的供體與受體。接合(conjugation)：遺傳物質(zhì)從供體轉(zhuǎn)移到受體的重組過程。第26頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二1.F因子：Hayes等深入研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌在接合中作供體的能力受細(xì)胞內(nèi)一種致育因子（F因子-fertilityfactor；性因子-sexfactor）控制。(二)、F因子及其在雜交中的行為P217F因子的化學(xué)本質(zhì)是DNA，可以自主狀態(tài)存在于胞質(zhì)中或整合到細(xì)菌的染色體上，又稱F質(zhì)粒。第27頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二(二)、F因子及其在雜交中的行為P217F因子可以在細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)移并傳遞遺傳物質(zhì)。圖10-14F因子結(jié)構(gòu)：①原點（origin）②致育基因（fertilitygene）③配對區(qū)（pairingregion）第28頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二Hfr菌株重組頻率比F+

高500多倍圖10-15大腸桿菌F因子的三種狀態(tài)供體菌(雄性)受體菌(雌性)高頻重組菌株第29頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二具有F因子的菌株可作為供體，F(xiàn)因子中有控制F性傘毛(Fpillus)形成的基因。F性傘毛是由供體細(xì)胞表面伸出的一種長附屬物，與受體細(xì)胞接合，就成為兩個細(xì)胞之間原生質(zhì)的通道，叫接合管(conjugationtube)

。接合現(xiàn)象P217圖10-16第30頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二F因子及其在雜交中的行為F因子在宿主染色體上有許多特定的插入位點和方向，整合頻率為每代10-5～10-7。性傘毛形成結(jié)合橋/管，產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶，該酶在oriT轉(zhuǎn)移起始點處一條單鏈上切開一個口，供體DNA從5′末端開始向受體轉(zhuǎn)移。P218-220第31頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二接合過程：F＋

和F－

的雜交細(xì)菌間接觸→接合管形成→單鏈斷裂—單鏈DNA從供體向受體轉(zhuǎn)移→環(huán)化（F+→F-）或DNA雙鏈的形成（部分二倍體）（Hfr→F-）→重組交換（奇偶次交換）。第32頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二接合過程：F＋

和F－

的雜交第33頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二

F因子的特點F＋細(xì)菌可以把F因子傳給后代。F＋細(xì)菌經(jīng)吖啶橙處理F因子丟失，丟失后不再出現(xiàn)。F＋可以和F－雜交，而不能和F＋雜交。F＋和F－雜交后代皆為F＋，而且可以以10－7頻率獲得重組體后代。第34頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二Hfr和F－雜交僅有一部分F因子（近原點處）被轉(zhuǎn)移；受體獲得完整的F因子--這種情況頻率非常低。高頻重組：細(xì)菌重組子頻率為10－4。P219第35頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二接合過程：Hfr和F－雜交第36頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)菌重組特點：只有偶數(shù)次交換才能產(chǎn)生平衡的重組子。相反的重組子不出現(xiàn)，所以在選擇性培養(yǎng)基上只出現(xiàn)一種重組子。部分二倍體/部分合子圖10-18細(xì)菌部分二倍體的形成及單交換和雙交換的結(jié)果知識要點：p219第37頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二奇偶次交換第38頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二(三)、中斷雜交試驗作圖雅各布(Jacob，F(xiàn))和沃爾曼(Wollman，E.)著名的中斷雜交試驗(interruptedmatingexperiment)。試驗材料：

Hfr:thr+leu+aziStonSlac+gal+strsF–:thr–leu–aziRtonRlac–gal-strRP231thr、leu、lac、gal分別代表蘇氨酸、亮氨酸、乳糖和半乳糖，+代表原養(yǎng)型或發(fā)酵型，–代表營養(yǎng)缺陷型或不發(fā)酵型；azi和tonA分別代表疊氮化納和T1噬菌體；Str表示鏈霉素，r代表抗性，s代表敏感。

第39頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二理解細(xì)菌和病毒在遺傳研究中的優(yōu)越性和意義；掌握轉(zhuǎn)化、接合、性導(dǎo)與轉(zhuǎn)導(dǎo)的概念與基本原理；掌握F-菌株、F+菌株、Hfr菌株的概念、區(qū)別和用途；區(qū)別F因子、F′因子的異同；了解溫和性噬菌體、烈性噬菌體的生活周期；掌握原噬菌體、溶源性細(xì)菌的概念；了解細(xì)菌和病毒遺傳作圖的原理和基本過程。本章要求第40頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二W.Hayes關(guān)于E.coliK12菌株A、B的實驗（1952）鏈霉素處理A菌完全培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間洗滌離心

B菌

重組體未減少基本培養(yǎng)基鏈霉素處理B菌完全培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間

洗滌離心

A菌

無重組體產(chǎn)生基本培養(yǎng)基

結(jié)論：細(xì)菌接合過程中遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是單向的，即遺傳物質(zhì)從A株轉(zhuǎn)移到了B株。阻礙細(xì)菌分裂，并不殺死細(xì)菌第41頁，共43頁，2023年，2月20日，星期二致育因子的發(fā)現(xiàn)

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放置冰箱一年Bs