ADC藥物的深度表征

———ADC藥物的深度表征

抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drugconjugate，ADC）是一類通過特定的連接子將靶向單克隆抗體與高殺傷性的細胞毒性小分子藥物偶聯(lián)起來的生物藥，以單克隆抗體為載體將小分子細胞毒性藥物高效地運輸至目標(biāo)腫瘤細胞中，起到治療的目的。

與傳統(tǒng)抗體藥相比，ADC藥物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜度和異質(zhì)性更高，因為添加了多變的有效載荷和連接子1。為確保藥物安全性和有效性，ADC的深度表征在其開發(fā)過程中至關(guān)重要。這不僅包括對mAb的翻譯后修飾（PTM）的鑒定和定位，還包括藥物偶聯(lián)的鑒定。由于質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，質(zhì)譜已經(jīng)成為ADC藥物表征中最廣泛使用的方法。完整質(zhì)量分析是用于確定小分子藥物與抗體比率（DAR）的常規(guī)方法，而對結(jié)合位點的深入表征，通常依賴于bottom-up的方法?，F(xiàn)在最廣泛采用的碰撞誘導(dǎo)解離（CID）技術(shù)能夠提供氨基酸序列確認(rèn)，但是這種能量比較大的碎裂技術(shù)也將有效載荷碎裂為更小的片段，從這種方法獲得的高度復(fù)雜的譜圖可能很難解析。而能量更柔和的碎裂方法可以促進此類復(fù)雜樣品的解析，一種基于電子活化裂解（EAD）2,3的創(chuàng)新、高度可重復(fù)的碎裂方法用于分析來自商業(yè)化ADC藥物的偶聯(lián)肽。使用10Hz快速非靶向的數(shù)據(jù)依賴采集（DDA）方法采集數(shù)據(jù)，通過此工作流程，一次進樣就可以應(yīng)用基于EAD的碎片進行常規(guī)和高級表征。曲妥珠單抗美坦新偶聯(lián)物（T-DM1）是最早的ADC治療藥物之一，于2023年獲得FDA批準(zhǔn)用于治療人表皮生長因子受體2（HER2）陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌。T-DM1是由單克隆抗體曲妥珠單抗和細胞毒素美坦新（DM1）通過不可裂解連接子共價偶聯(lián)而成（圖1）。將單克隆抗體（mAb）的靶標(biāo)特異性與細胞毒性藥物的高效率相結(jié)合，可充分利用兩個方面的優(yōu)勢，最大限度地減少副作用3。T-DM1是與氨基連接，如連接在曲妥珠單抗的賴氨酸殘基的側(cè)鏈中。先前的完整質(zhì)量研究表明，T-DM1的平均DAR約為3.5.1,4。但是曲妥珠單抗中有88個賴氨酸殘基和4個N端基團，可能會出現(xiàn)450萬個以上的不同分子形式1。有效載荷的位點和結(jié)構(gòu)將直接影響藥物的功效和安全性，因此將其歸類為關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），并且需要在開發(fā)過程中進行全面表征和嚴(yán)格監(jiān)控。

圖1.細胞毒藥物有效載荷和連接子與mAb偶聯(lián)的示意圖。T-DM1由DM1（黑色），靶向連接氨基殘基的MCC連接子（linker，藍色）和單克隆抗體組成。

本研究選擇了與ZenoEAD相結(jié)合的DDA方法。采用這種方法，不僅可以執(zhí)行常規(guī)的肽圖分析，而且EAD可以在同一針分析中進行高級表征。此外，ZenoEAD增強了碎片離子的檢測能力，從而正確鑒定了低豐度物質(zhì)。圖2展示了在偶聯(lián)肽SCDK[DM1]THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK上觀察到的碎裂模式的例子。在分析中未觀察到?jīng)]有連接子和藥物或其部分的肽，表明其完全偶聯(lián)。獲得了此肽段高質(zhì)量的MS/MS譜圖，從而使該特定肽段的MS/MS序列覆蓋率達到96.6％。一個更占優(yōu)勢的碎片從m/z大于500的有效載荷產(chǎn)生（請見圖2中的標(biāo)記）。觀察到的有效載荷結(jié)構(gòu)的主要裂解位點是DM1的COO-C鍵，這種碎裂模式與先前利用CID技術(shù)產(chǎn)生的一系列小碎片的數(shù)據(jù)不同1。較大分子量的藥物碎片可以用作特征碎片，以更具體地確認(rèn)有效載荷的存在，并可以用來確認(rèn)有效載荷的結(jié)構(gòu)。圖2.應(yīng)用ZenoEAD得到的偶聯(lián)肽SCDK[DM1]THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK（z=+4）的碎片數(shù)據(jù)。來自肽段主鏈指定偶聯(lián)肽段離子的全掃描MS/MS數(shù)據(jù)，以及有效載荷中的碎離子信息。此外，通過將ZenoEAD技術(shù)用于增強的碎片離子檢測，還可以很好地檢測到來自肽段主鏈的片段信息，從而提供有關(guān)肽段的分子完整性的信息。由于酶的空間位阻，抗體上偶聯(lián)藥物的存在會導(dǎo)致樣品制備酶解過程中的更多漏切位點。另外，賴氨酸殘基和有效載荷之間的結(jié)合過程是隨機反應(yīng)，偶聯(lián)的比率并不總是100％，這導(dǎo)致了多樣性和低豐度物質(zhì)存在。當(dāng)一個肽段中存在多個潛在連接形式時，鑒定正確的連接位點可能是一個挑戰(zhàn)。肽段ASQDVNTAVAWYKPGKAPK是這種具有挑戰(zhàn)性的另一個例子（圖3）。它包含一個漏切位點和一個脯氨酸相鄰的N端賴氨酸，導(dǎo)致偶聯(lián)位點的多種選擇。但是，有了從EAD技術(shù)碎裂得到豐富、高質(zhì)量的MS/MS質(zhì)譜圖，就可以實現(xiàn)藥物定位的自動匹配（圖3A）。由于有效載荷靠近肽的C端，因此檢測到的C離子比Z離子豐富（圖3A），而未結(jié)合的肽顯示出來自C端和N端的豐富片段（圖3B）。眾所周知因為電子活化解離技術(shù)不會解離脯氨酸的N端，我們還檢測到了除了C15以外的從C3到C17的全系列C片段7。這提供了確鑿的證據(jù)表明K15未與細胞毒藥物偶聯(lián)。此外，z4，z5和z7表明K18（而非K21）是藥物偶聯(lián)的正確位點。

圖3.應(yīng)用ZenoEAD得到的來自偶聯(lián)/非偶聯(lián)肽ASQDVNTAVAWYKPGK[DM1]APK（z=+3）的碎片的數(shù)據(jù)。A：來自肽段主鏈指定偶聯(lián)肽段離子的全掃描MS/MS數(shù)據(jù)，以及有效載荷中的碎離子信息。B：來自肽段主鏈指定非偶聯(lián)肽的全掃描MS/MS數(shù)據(jù)。連接子顯示為藍色，DM1藥物顯示為黑色。

結(jié)論：

通過EAD的新型碎裂模式，實現(xiàn)了具有多個潛在位點的多肽中藥物偶聯(lián)的準(zhǔn)確定位

與傳統(tǒng)的MS/MS分析相比，EAD技術(shù)獲得更豐富的MS/MS碎片信息。應(yīng)用ZenoEAD技術(shù)，即使對于中等強度或極低強度的母離子（例如低豐度的偶聯(lián)肽），也能獲得令人信服的二級碎片和出色的數(shù)據(jù)質(zhì)量

SCIEXZenoTOF7600系統(tǒng)強大、高重現(xiàn)性且易于